RAW264.7细胞膜包覆白蛋白纳米粒的细胞摄取与毒性评价

表1.1所示：表STYLEREF1\s1.SEQ表\*ARABIC\s11实验仪器TableSTYLEREF1\s1.SEQTable\*ARABIC\s11Experimentalinstruments序号仪器及型号产地1一体式超声波破碎机（XM-900T）小美超声仪器（昆山）有限公司，中国2电子天平赛多利斯科学仪器（北京）有限公司，中国3激光粒度分析仪（ZEN5600）Malvern，英国4超净工作台（SW-CJ-2F）苏州安泰空气技术有限公司，中国5超速离心机Eppendorf（艾本德），德国6电热恒温水浴锅（H1809312）上海精宏实验设备有限公司，中国7DMILLED倒置生物显微镜德国莱卡仪器有限公司，德国8CytoFLEX流式细胞仪贝克曼库尔特国际贸易（苏州）有限公司，中国9多功能仪器分析仪（MD/SpectraMaxM2）美谷分子仪器（上海）有限公司，中国10恒温震荡培养箱上海旻泉仪器有限公司1.2实验方法1.2.1RAW264.7细胞膜的提取将培养好的细胞用PBS洗一遍，移液枪吹打收获Pan02和RAW264.7细胞，离心去上清。将细胞重悬于预冷的TM-Buffer

(pH

7.4，0.01

MTris，0.001

M

MgCl2，蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂)中，放置于4℃冰箱内孵育，每隔10min用超声破碎仪破碎细胞一次，共孵育30min破碎三次。加入蔗糖，在4℃下以700xg离心10分钟来分离所得溶液,取上清(去除细胞核及细胞器)。4℃下以

20000xg离心30分钟取沉淀获得膜。BCA法测定蛋白浓度，最后将细胞膜冷冻储存在-80℃直至分析。1.2.2紫杉醇白蛋白纳米粒的制备和表征将2mg

PTX溶解于2mL乙醇，12mgHSA溶解于6mLPBS，制得1mg/mL

PTX

液和2mg/mL

HSA液。取冰浴好的一EP管加入40μL

PFP

和

208μL

PTX，另一EP管中滴加208μL

PTX，搅拌5min。按PTX:HSA

摩尔比为

4:1，分别将各EP管液滴加入含2mLHSA的离心管中。冰浴，超声5min(频率为100%，25KHZ，间隔、超声时间均为10s)。在8000rpm条件下，将各混合液加入超滤管离心4次每次15

min，弃去滤液收集截留液以去除乙醇和游离的紫杉醇，滤管中的白色沉淀中用PBS复溶，即得全氟戊烷-紫杉醇白蛋白纳米粒(简称

PPH)。采用激光粒度分析仪对所制备的纳米颗粒进行了系统表征，包括Zeta电位、流体力学直径及多分散指数（PDI）等关键理化参数的测定。1.2.3细胞膜包裹白蛋白纳米粒的制备和表征将提取的RAW264.7细胞膜和紫杉醇白蛋白纳米粒按1:10的比例混合。测定细胞膜蛋白浓度（BCA法），取RAW264.7细胞膜与PTX-HSA混合（总体积约1mL）。采用挤出法制备膜包覆纳米粒。挤出前处理将膜与白蛋白纳米粒混合液通过200nm聚碳酸酯膜预润湿的挤出器，手动挤压1次使体系均质化。之后在进行三次挤出，安装双层200nm膜，将混合液在25℃下循环挤出：第一次低速挤压（避免高压导致膜破裂），收集挤出液。第二次：同膜反向挤压，促进膜包裹。第三次：正向挤压完成最终包覆。全程保持样品避光、低温（冰浴间歇冷却）。通过激光粒度仪测定制备出的各组纳米粒的电位、粒径和PDI。1.2.4细胞摄取在载DiD白蛋白纳米粒制备过程中，在乙醇溶液中加入DiD染料，制备DiD标记的白蛋白纳米粒。将RAW264.7细胞以1×105细胞/孔的密度接种于12孔板内，待其贴壁且生长良好。将DiD标记的白蛋白纳米粒和细胞膜包裹白蛋白纳米粒（1μg/mLDiD）分别加入孔内，孵育1、2、4h小时，收集细胞检测荧光。制备载DiD的白蛋白纳米粒，并制备膜包被的白蛋白纳米粒（最终DiD浓度至少10ug/mL）。给药前用酶标仪测定各组制剂的荧光值，使得各组荧光值保持一致（约10ug/mL）。用流式细胞仪进行定量分析。将RAW264.7细胞接种于12孔板，过夜使其贴壁生长，弃去旧培养基后，进行给药。将载DiD的RAW-PTX-HSA用培养基稀释10倍（100ul制剂+900ul培养基）加入到各孔（每孔1ml）中，每组三个平行。37

℃孵育2h。孵育完成后，用移液枪弃去培养基，再使用PBS溶液清洗2~3次，最后用胰酶消化，离心(2000

r/min,4

min)，弃去胰酶，加PBS溶液1ml每孔，将细胞吹下来，收集在1.5ml离心管中，离心(2000

r/min,4

min)，然后用PBS溶液对细胞进行重悬，30

min内用流式细胞仪进行检测。1.2.5毒性评价本实验采用CCK-8试验方法检测细胞毒性，将

Pan02

细胞以

1.5×104

个细胞/孔的密度接种于96孔板中，孵育过夜后，将制备好的各组制剂（PTX-HSA,

RAW-PTX-HSA）分别加入孔中（每孔

100μL，每组做

5

个平行，用60μL

制剂，用培养基稀释至

600μL，加入

5

个孔中），其中每组制剂的给药浓度分别为

2μg/mL，在培养箱中过夜孵育

24h后向每孔中加入

10μL

CCK8

溶液，在培养箱中孵育

2h

后，使用酶标仪测定96板中各孔在450nm波长处的吸光度。以无细胞的孔为空白，未加药物组为对照，计算各组细胞的存活率，并使用GraphpadPrism8软件拟合各组制剂的细胞活力柱状图。计算公式为：

细胞活力(%)

=

(A样品

-

A空白)

/(

A阴性

-

A空白)×100%式中：A样品：细胞加入CCK-8

溶液和药物溶液的孔的

OD

值；

A阴性：细胞加入CCK-8

溶液而没有药物溶液的孔的

OD

值；A空白：无细胞的孔的

OD

值。1.2.6溶血试验采用眼眶静脉丛采血法获取健康小鼠的血液2mL，使用EDTA抗凝管收集。血液样本经冷冻离心（3000rpm，5min）处理后获得红细胞沉淀，随后用PBS溶液重复洗涤5次。把经洗涤处理的红细胞重新悬浮于PBS溶液内，配制成体积比为2%的红细胞悬液，留作后续使用。在实验组中，取等量的各组制剂溶液，分别与等体积的2%红细胞悬液充分混合，随后将混合液放置于恒温摇床（37°C，75rpm）中孵育2小时。孵育完成后，所有样品经离心（3000rpm，5min）处理，收集上清液测定其在545nm波长处的OD值，同时采用光学显微镜观察红细胞形态变化。实验设置PBS处理组和1%TritonX-100处理组分别作为阴性和阳性对照。根据以下公式计算溶血率：溶血率(%)=

(A样品-A阴性)/(A阳性-A阴性)×100%式中：A样品：实验组样品的吸光度；A阴性：阴性对照组样品的吸光度；A阳性：阳性对照组样品的吸光度。2实验结果与分析2.1RAW264.7细胞膜包裹白蛋白纳米粒的表征2.1.1RAW264.7细胞膜生物学的表征如图1，SDS结果显示，PTX-HSA与RAW-PTX-HSA条带几乎一致，表明实验中制备出来的RAW264.7细胞膜包覆的紫杉醇白蛋白纳米粒保留了紫杉醇白蛋白纳米粒的主要成分。同时RAW-PTX-HSA与RAW264.7细胞膜的条带有相似的部分，说明细胞膜包裹了紫杉醇白蛋白纳米粒。图1

RAW264.7细胞膜（A）,PTX-HSA（B）及RAW-PTX-HSA（C）酰胺凝胶电泳图Fig1

PolyacrylamidegelelectrophoresisofRAW264.7membrane(A),PTX-HSA(B)andRAW-PTX-HSA(C)2.1.2RAW264.7细胞膜包裹白蛋白纳米粒的粒径分布及电位测定纳米颗粒的粒径大小是决定其药物释放特性、生物利用度、载药量与靶向递送能力的关键参数，对保证纳米制剂的品质极为关键。颗粒大小直接决定了药物在体内释放的速度和效果，进而影响药物的吸收和利用。同时，颗粒大小也关系到其载药能力和药物是否能准确到达病变部位。如表2、图2所示，制备得到的RAW-PTX-HSANPs的粒径为（320.3±3.8）nm，与PTX-HSANPs相比粒径减小约153.3nm，PTX-HSANPs电位为（-20.5±4.2）mV，而RAW-PTX-HSANPs电位为（-17.5±0.25）mV，与RAW264.7细胞细胞膜的表面Zeta电位相近，说明纳米粒表面被RAW264.7细胞细胞膜成功包覆了。表2粒径分布及电位测定结果（x¯±s,n=3）Table2

Characterizationofdifferentnanoparticles(x¯±s,n=3)NanoparticleSize/nmPDIZetaelectricpotential/mVPTX-HSANPs473.6±3.80.169±0.04-20.5±0.34RAW/PTX-HSANPs320.3±4.20.743±0.05-17.5±0.25PDI:Polydispersityindex.图2PTX-HSANPs的的粒径（A）和RAW-PTX-HSANPs的粒径（B）Fig2

TheparticlesizeofPTX-HSANPs(A),andtheparticlesizeofRAW-PTX-HSANPs(B)2.2RAW267.4细胞膜包裹白蛋白纳米粒的细胞摄取能力考查如图3所示，采用流式细胞仪测得644nm激发光波长下DiD的荧光值，其中与不到0.8%的空白对照组相比，DiD-HSA和RAW/DiD-HSA组的荧光阳性率平均值分别为84.48%和71.11%。如图4，结果显示制备得到的RAW-HSANPs与HSANPs相比，有RAW267.4细胞膜包覆的白蛋白纳米粒测得的荧光值略低于没有膜包覆的白蛋白，这样的结果可能是细胞膜包覆后导致载药系统释放有一定的滞后性导致的。与此同时，磷脂双分子层引起的荧光淬灭效应也可能导致结果的误差。图3PTX-HSANPs的的粒径（A）和RAW-PTX-HSANPs的粒径（B）Fig3

TheparticlesizeofPTX-HSANPs(A),andtheparticlesizeofRAW-PTX-HSANPs(B)图4PTX-HSANPs的的粒径（A）和RAW-PTX-HSANPs的粒径（B）Fig4

TheparticlesizeofPTX-HSANPs(A),andtheparticlesizeofRAW-PTX-HSANPs(B)2.3RAW267.4细胞膜包裹白蛋白纳米粒的细胞毒性测定如图5，采用CCK-8方法测得的PAN02细胞活性结果显示，PTX-HSA与RAW-PTX-HSA相比，有RAW267.4细胞膜包覆的紫杉醇白蛋白纳米粒对癌细胞的毒性更强，有更强的靶向性。表明实验中RAW264.7细胞膜的包覆改善了紫杉醇白蛋白纳米粒的特性。图5PTX-HSANPs的的细胞活性和RAW-PTX-HSANPs的细胞活性Fig5

ThecellviabilityofPTX-HSANPs,andthecellviabilityofRAW-PTX-HSANPs2.4RAW267.4细胞膜包裹白蛋白纳米粒的细胞溶血测定如表3结果如图7所示，实验结果表明，PTX-HSANPs和RAW-PTX-HSANPs的溶血率均低于

5%，符合生物材料的安全性要求（标准：溶血率

<5%）。值得注意的是，与PTX-HSANPs相比，经过膜包覆的RAW-PTX-HSANPs表现出更低的红细胞破坏作用，进一步提高了血液相容性。表3样品溶血率（x¯±s,n=10）Table3

Hemolysisratioofdifferentnanoparticles(x¯±s,n=10)Nanoparticle均值（Mean）标准差（SD）PTX-HSANPs45.0%2.32RAW/PTX-HSANPs21.2%1.49图6各样品溶血实验结果Fig6

Hemolysistestresultsforallsamples图7PTX-HSANPs的的溶血率和RAW-PTX-HSANPs的溶血率Fig7

ThehemolysisratioofPTX-HSANPs,andthehemolysisratioofRAW-PTX-HSANPs3讨论与结论3.1讨论3.1.1细胞膜包覆白蛋白纳米粒的理化性质表征本研究成功构建了RAW264.7细胞膜包覆的白蛋白纳米粒，并对其理化性质进行了系统表征。SDS电泳分析显示，RAW-PTX-HSANPs同时保留了PTX-HSANPs和RAW264.7细胞膜的特征蛋白条带，证明细胞膜成功包覆在纳米颗粒表面。这样的结果验证了挤出法制备仿生纳米递药系统的可行性，且确保了膜蛋白的完整性，这对维持巨噬细胞膜的天然靶向性和生物相容性有重要意义。激光粒度分析结果显示，RAW-PTX-HSANPs的平均粒径为320.3±4.2nm，相比未包覆的PTX-HSANPs（473.6±3.8nm）明显减小。粒径的降低可能因为细胞膜紧密包覆纳米颗粒，减少了颗粒间的聚集。另外，RAW-PTX-HSANPs的Zeta电位（-17.5±0.25mV），处于PTX-HSANPs（-20.5±0.34mV）和RAW264.7细胞膜的电位之间，这也证实了细胞膜修饰成功。值得注意的是，RAW-PTX-HSANPs的多分散指数（PDI=0.743±0.05）较PTX-HSANPs（PDI=0.169±0.04）有所升高，提示膜包覆过程可能引入了一定的粒径异质性，未来可通过优化挤出工艺进一步提高制剂的均一性。3.1.2细胞摄取分析流式细胞分析表明，被DiD标记的RAW-HSANPs在RAW264.7细胞中的荧光强度没有显著高于未包覆的HSANPs，无法表明巨噬细胞膜修饰显著增强了纳米颗粒的细胞摄取效率。这一现象可能是由以下机制导致：（1）给药时间与体外毒性评估的时间不同，细胞摄取给药后细胞孵育了两小时，而CCK-8实验则是过夜24h。给药时间不同可能影响了细胞摄取中药物释放的时效性。（2）药物释放动力学不同，首先是细胞膜包覆形成了物理屏障，其次是细胞膜包覆白蛋白纳米粒后延缓了药物的扩散速率，使药物呈现缓释效应。（3）荧光信号干扰因素，膜蛋白对激发光的散射作用和检测过程中膜结构动态变化可能影响了荧光信号的检测，同时磷脂双分子层也会引起荧光淬灭效应。3.1.3体外毒性评估CCK-8实验结果显示，RAW-PTX-HSANPs对Pan02细胞的抑制率显著高于PTX-HSANPs。这一结果可能是因为，一方面巨噬细胞膜包覆提升了纳米颗粒的肿瘤靶向性，通过受体介导的内吞作用促进药物在癌细胞内的蓄积，另一方面膜修饰改善了紫杉醇的控释特性，延缓了药物突释，从而维持了更持久的细胞毒效应。溶血实验显示，PTX-HSANPs和RAW-PTX-HSANPs溶血率均低于5%，符合生物材料的安全性标准（溶血率<5%）。与PTX-HSANPs相比，膜包覆进一步降低了纳米颗粒的红细胞破坏作用，这可能归因于细胞膜的天然生物相容性及其对纳米颗粒表面特性的调控作用。3.1.4研究意义与展望本研究表明，RAW264.7细胞膜包覆可以显著提升白蛋白纳米粒的细胞摄取效率和肿瘤杀伤活性，同时能维持良好的血液相容性。这为克服传统纳米药物靶向性不足、毒副作用大等问题提供了新思路。不过，仍有一些问题需要进一步探索：（1）巨噬细胞膜表面受体的特异性识别机制及其与不同肿瘤细胞的相互作用的规律；（2）纳米颗粒在体内的长循环特性和肿瘤富集效率；（3）大规模生产中的膜提取与包覆工艺标准化问题。未来的研究可以通过整合多组学分析和人工智能设计，优化仿生纳米递药系统的性能，加速其临床转化的进程。3.2结论本研究成功构建了RAW264.7细胞膜包覆的白蛋白纳米粒，该纳米粒具有以下优势：（1）粒径均一、稳定性良好；（2）RAW264.7细胞膜修饰可以延缓药物扩散速率；（3）在体外实验中，细胞膜包覆的白蛋白纳米粒体外抗肿瘤活性优于未包覆纳米粒；（4）细胞膜包覆的白蛋白纳米粒溶血率显著降低，生物安全性良好。该体系保留了天然细胞膜的功能特性，为肿瘤靶向治疗提供了新型仿生递药平台，展现出广阔的临床应用前景。参考文献XuC,YeP,ZhouY,etal.Cellmembrane-camouflagednanoparticlesasdrugcarriersforcancertherapy[J].ActaBiomaterialia,2020,1051-14.ChaiZ,HuX,LuW.Cellmembrane-coatednanoparticlesfortumor-targeteddrugdelivery[J].ScienceChinaMaterials,2017,60(6):504-510.FangHR,JiangY,FangCJ,etal.Cellmembrane-derivednanomaterialsforbiomedicalapplications[J].Biomaterials,2017,12869-83.LukTB,ZhangL.Cellmembrane-camouflagednanoparticlesfordrugdelivery[J].JournalofControlledRelease,2015,220(PB):600-607.DianaD,XiaoliW,HRF,etal.Erythrocyte-PlateletHybridMembraneCoatingforEnhancedNanoparticleFunctionalization[J].Advancedmaterials(DeerfieldBeach,Fla.),2017,29(16):n/a-n/a.HongliangH,ChunqingG,JingW,etal.Leutusome:ABiomimeticNanoplatformIntegratingPlasmaMembraneComponentsofLeukocytesandTumorCellsforRemarkablyEnhancedSolidTumorHoming[J].Nanoletters,2018,18(10):6164-6174.MinjunX,JingxinS,LuruD,etal.MacrophageCellMembraneCamouflagedMesoporousSilicaNanocapsulesforInVivoCancerTherapy[J].Advancedhealthcarematerials,2015,4(1