3.2.1基因工程的基本操作程序第一课时课件-高二下学期生物人教版选择性必修3

3.2.1基因工程的基本操作程序第三章

基因工程教学目标1.阐明基因工程的基本操作程序——目的基因的获取的方法2.比较基因组文库和cDNA文库的不同3.知道通过PCR技术能获取目的基因，比较PCR技术和体内DNA复制的异同基因的组成课本76---801.基因工程的操作程序主要包括哪几个步骤？核心是2.什么是目的基因?目的基因的获取的方法有哪些？3.如何扩增目的基因（方法）？原理是？操作环境是？4.DNA复制所需的基本条件是？作用是？缓冲液中需要加入什么物质用来激活细胞？什么是引物？5.PCR的操作流程？数量计算公式是？

鉴定方法为？引物的设计相关知识，PCR相关计算（补充）1.基因工程的操作程序主要包括哪几个步骤？核心是①目的基因的筛选与获取②基因表达载体的构建（核心)③将目的基因导入受体细胞④目的基因的检测和鉴定2.什么是目的基因?(主要是）目的基因的获取的方法有哪些？用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因主要指编码蛋白质的基因①

目的基因；②通过构建

来获取目的基因；③常用

特异性地快速扩增目的基因。人工合成基因文库PCR不再含有目的基因3.如何快速扩增目的基因（方法）？原理：操作环境是：DNA半保留复制体外（PCR扩增仪）PCR（聚合酶链式反应）

DNA体外复制（PCR）的条件：参与的组分在DNA复制中的作用解旋酶DNA母链4种脱氧核苷酸DNA聚合酶引物（2种）无需解旋酶，用高温代替耐高温的DNA聚合酶②4种脱氧核苷酸（dNTP）①4.DNA复制所需的基本条件是？作用是？断开氢键，打开DNA双链提供DNA复制的模板合成DNA子链的原料催化合成DNA子链使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸

是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸（通常为20-30个核苷酸）4.缓冲液中需要加入什么物质用来激活细胞？Mg2＋.复制的DNA片段其长度由引物的位置决定的是么是引物？5.PCR的操作流程？数量计算公式是？

鉴定方法为？变性复性延伸2n琼脂糖凝胶电泳5.PCR的操作流程，利用PCR获得和扩增目的基因①

：当温度

时，双链DNA

为单链。②

：当温度下降到

时，

通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。③

：当温度上升到

时，溶液中的4种脱氧核苷酸在

的作用下，根据

原则合成新的DNA链。变性超过90℃解聚复性50℃左右两种引物延伸72℃左右耐高温的DNA聚合酶碱基互补配对

DNA体外复制（PCR）的过程：在

中自动完成。PCR扩增仪第二轮循环的产物第三轮循环的产物第一轮循环的

.作为第二轮反应的

，经过

、

.和

三步产生第二轮循环的产物。产物模板变性复性延伸第二轮循环的

.作为第三轮反应的

，经过

、

.和

三步产生第三轮循环的产物。产物模板变性复性延伸一次PCR一般要经历30次循环由于一个循环得到的产物又可以作为下一个循环的模板，因而每一次循环后目的基因的量可以增加

倍。即成

形式扩增。（约为

，其中n为扩增循环的次数）。5.PCR产物的鉴定:常采用

来鉴定PCR的产物。一指数2n琼脂糖凝胶电泳PCR的结果：1.DNA分子数：

。2.含引物的DNA分子数：

。3.同时含两种引物的DNA分子数：

。4.共消耗引物的对数：

。第三轮5'3'5'3'5'3'5'3'5'3'3'5'5'3'3'5'5'3'5'3'5'3'3'5'5'3'3'5'5'3'3'5'2n2n2n－22n－1PCR中的数量关系：(设n为扩增循环的次数，即DNA复制次数)

是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸（通常为20-30个核苷酸）复制的DNA片段其长度由引物的位置决定的引物引物的设计相关知识:知识延伸2.DNA复制过程需要引物的原因：①DNA聚合酶不能从头合成子链。②使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸①两种引物之间:

②每种引物内部:

不能在局部发生碱基互补配对不能在局部发生碱基互补配对引物的设计原则：引物的设计：1．PCR扩增的

(填“一定”或“不一定”)是完整的模板DNA分子，理由是

。2．如果已知某目的基因的序列和结构，利用PCR筛选和扩增出该目的基因的关键是

。3.要保证目的基因能与载体相连接，要在两种引物的

分别添加上

。不一定PCR扩增的仅仅是两种引物之间所对应的特定DNA片段根据目的基因两端（

′端）的核苷酸序列设计引物5′端限制酶的识别序列3获得所需的目的基因：一5'3'5'3'3'5'5'3'目的片段第一轮5'3'5'3'引物A3'5'5'3'引物B目的片段1.若两条引物均从DNA分子端部结合，则第

轮PCR循环结束时出现两条单链等长的目的片段。2.若一条引物从DNA分子端部结合，另一条引物从DNA分子中间部位结合，则第

轮PCR循环结束时出现两条单链等长的目的片段。5'3'5'3'引物A3'5'5'3'引物B目的片段第一轮第二轮目的片段5'3'5'3'3'5'5'3'二5'3'5'3'5'3'目的片段5'3'5'3'5'3'5'3'5'3'获得所需的目的基因：013.若两条引物均从DNA分子中间部位结合时，则第

轮PCR循环结束时出现两条单链等长的目的片段。5'3'5'3'引物A3'5'5'3'引物B目的片段第一轮第二轮5'3'5'3'5'3'目的片段5'3'目的片段5'3'5'3'5'3'5'3'5'3'5'3'3'5'3'5'第三轮5'3'5'3'5'3'5'3'5'3'3'5'5'3'3'5'5'3'5'3'5'3'3'5'5'3'3'5'5'3'3'5'三获得所需的目的基因：mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增（逆转录PCR，简称RT-PCR）。①逆转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA链，形成RNA-DNA杂交分子。②核酸酶H降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链，使之变成单链DNA。③以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子，即cDNA。一第一步：目的基因的筛选与获取用PCR可以扩增mRNA吗？(P79旁栏思考题）思考讨论【小结】选择限制酶的基本原则:①切割目的基因时: