4.1基因工程赋予生物新的遗传特性课件高二下学期生物浙科版选择性必修3

第一节

基因工程赋予生物

新的遗传特性三文鱼（Oncorhynchus）被国际美食界誉为“冰海之皇”。1.不饱和脂肪酸5.多种矿物质

富含人体所需矿物质钙、铁、镁、磷2.虾青素强力抗氧化剂3.脂肪酸

增强脑功能，防止

老年痴呆、预防视

力减退4.多种维生素富含多种维生素A.B1.B2.D.E

目前市场主要销售的是养殖的大西洋三文鱼。其能在春季和夏季生长繁殖，而在漫长的冬季（低温环境）基本停止生长。

能不能在冬季也吃到新鲜的大西洋三文鱼？100200300400500600700800900654321weight(Kg)days(fromfirstfeeding)导入大麻哈鱼生长素基因非转基因鱼基因工程指有意识地把一个人们所需要的基因转入另一个生物体中，使后者获得新的遗传性状或表达所需要产物的技术。其核心是构建重组的DNA分子，也称为重组DNA技术。1.操作对象：2.原

理3.意

义：基因重组DNA分子定向改变生物的遗传性状，克服远源杂交不亲和如何将鳕鱼的抗冻蛋白基因（目的基因）从它的DNA中切割下来？如何将切下来的目的基因与载体连接起来？如何将目的基因运送到大西洋三文鱼细胞？

基因的手术刀——限制性内切核酸酶基因的缝合针——DNA连接酶基因的运输工具——载体

基因工程的技术上的保障一.“分子手术刀”——限制性内切核酸酶

限制性内切核酸酶（restrictionendonuclease），简称“限制酶”，主要存在于细菌等微生物中。它能破坏外源DNA，如侵染细菌的噬菌体DNA，"限制"病毒在细菌内的寄生，而细菌自身DNA经过相应的化学修饰则不会被限制酶破坏。限制酶的保护作用是细菌等进化出的一种防御机制。提取鳕鱼DNA抗冻蛋白基因

该如何切下抗冻蛋白基因？？识别限制性内切核酸酶能识别DNA分子内的一小段脱氧核苷酸序列，并催化其中特定的两个核苷酸之间的_______________键水解，使得DNA双链在特定位置断开。一.“分子手术刀”——限制性内切核酸酶磷酸二酯键

限制性内切核酸酶识别序列通常是4～8个核苷酸对，以6个核苷酸对最为常见。断开后的DNA末端分为两种：如果末端有凸出的单链部分称为黏性末端；如果DNA末端没有单链部分称为平末端。不同菌株含有不同的限制酶，不同限制酶的识别序列一般也各不相同。思考：把目的基因切断要几个切口？切断几个磷酸二酯键？目的基因含

几个粘性末端？抗冻蛋白基因一.“分子手术刀”——限制性内切核酸酶鳕鱼载体重组DNA分子抗冻蛋白基因

二.基因的针线——DNA连接酶TTAAAATT完全互补的黏性末端能通过氢键暂时连接在一起，但并不稳定。发现于微生物的DNA连接酶可以将不同来源的2个DNA分子的双链通过磷酸二酯键分别连接起来，形成一个稳定的重组DNA分子（图4-2）。

二.基因的针线——DNA连接酶鳕鱼载体重组DNA分子抗冻蛋白基因思考：在获取目的基因和切割载体时,通常使用相同的限制酶,其目的是

______________________________。若均使用相同的1种限制酶酶切，

会造成______________________________________________________,

为了避免上述情况发生,可采取的措施是:________________________。产生相同的黏性末端，便于连接目的基因、质粒的自身环化以及目的基因与质粒反向连接使用相同的两种限制酶下图表示四种限制性内切核酸酶BamHⅠ,EcoRⅠ,HindⅢ以及BglⅡ的识别序列和切割位点。为防止酶切后含目的基因的DNA片段自身连接成环状,下列不能同时切割目的基因的两种酶是(

)A．EcoRⅠ

和

HindⅢ

B．EcoRⅠ

和

BglⅡC．BamHⅠ和HindⅢ

D．BamHⅠ和

BglⅡ鳕鱼载体重组DNA分子抗冻蛋白基因

大西洋三文鱼

受精卵导入

基因的运输工具——载体质粒（plasmid）是独立于细菌拟核DNA的较小的环状DNA分子，是一种常用载体。除质粒外，有些动植物病毒及噬菌体也可作为载体。载体须具备的条件:A.含有复制起点，能够独立自主复制并稳定存在

基因的运输工具——载体B.含有一种或多种限制酶的识别序列，方便外源基因插入载体中C.具有筛选作用的标记基因，以便能够通过表型鉴别含有载体的细胞D.对受体细胞无毒害作用，避免受体细胞受到损伤标记基因的筛选原理载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了载体的受体细胞。如图所示：例

下面是一种质粒四种不同切割位点的示意图,中ori为复制必需的序列,amp为氨苄青霉素抗性基因,tet为四环素抗性基因,箭头表示一种限制性核酸内切酶的切割位点.若要得到一个能在四环素培养基上生长而不能在氨苄青霉素培养基上生长的含重组DNA分子的细胞,应选用的切割位点是（）标记基因一定是抗性基因吗？思考：标记基因一定是抗生素抗性基因吗？荧光基因目的基因导入“融合基因”发出荧光的愈伤组织鳕鱼载体重组DNA分子抗冻蛋白基因

大西洋三文鱼

受精卵导入转基因三文鱼表达基因工程诞生的理论基础DNA是生物遗传物质的发现

遗传信息传递方式的认定DNA双螺旋结构的确立1928肺炎双球菌的活体转化实验1944肺炎双球菌的离体转化实验1952噬菌体的侵染实验

中心法则生物共用一套基本的遗传密码思考：为什么在三文鱼体内表达出抗冻蛋白序列与鳕鱼一样？提取鳕鱼DNA从目标生物中提取分离DNA,是进行基因工程操作的基础。可利用DN与其他成分在物理、化学性质上的差异，通过一定分方法，去除其他成分，提取DNA。DNA的粗提取和鉴定一、实验原理：1.提取DNA的原理①用SDS处理材料，能使核蛋白变性并与DNA分离；

EDTA能抑制DNA酶活性，防止核DNA被酶解。②DNA在2mol/L的NaCl溶液中溶解度高，且Na+与DNA形成钠盐；

DNA钠盐不溶于酒精而某些蛋白质能溶于酒精。2.鉴定DNA的原理在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。

讨

论1.实验结果说明絮状物中含有什么？2.鉴定时，为什么要设置只加入二苯胺试剂的试管？3.实验中研磨生物材料、倒入冷酒精的目的分别是什么？1.絮状物中含有DNA；2.

只加入二苯胺试剂的试管作为对照；3.

研磨生物材料的目的是破坏植物细胞结构，利于提取DNA;

倒入冷酒精的目的是使DNA钠盐形成絮状沉淀而析出。1、以洋葱为材料进行DNA的粗提取与鉴定实验，相关叙述错误的是(

) A.可将洋葱换成哺乳动物的血液进行该实验 B.向含DNA的滤液中加入2mol/L的NaCl溶液，有利于去除杂质 C.向含DNA的滤液中加入预冷的体积分数为95%的酒精溶液，有利于获得

较纯净的DNA D.用二苯胺试剂鉴定DNA时进行沸水浴，有利于显色反应的发生因为哺乳动物成熟的红胞中没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA。1.科学家们经过多年努力，创立了一种新兴生物技术——基因工程，实施该工程的最终目的是()

A.定向提取生物体的DNA分子

B.定向地对DNA分子进行“剪切”

C.在生物体外对DNA分子进行改造

D.定向地改造生物的遗传性状D2.下列有关基因工程中限制性核酸内切酶的描述,错误的是()

A．一种限制性内切核酸酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列B．限制性内切核酸酶能识别和切割RNAC．限制性内切核酸酶的活性受温度影响D．限制性内切核酸酶可以从原核生物中提取B3.下列能正确表示限制性内切核酸酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、解旋酶的作用顺序的是(

)A．①②③④B．①②④③C．①④②③D．①④③②4.下列关于下图所示粘性末端的叙述,正确的是(

)A．①与③是由相同的限制性内切核酸酶切割产生的B．DNA连接酶可催化①与③的拼接C．经酶切形成④,需要脱去２个水分子D．图中需要两种限制性内切核酸酶作用5.下列关于基因工程所用工具的叙述正确的是（

）A.有些动植物细胞也可以作为载体B.基因工程载体的化学本质是蛋白质C.限制酶能切割烟草花叶病毒核酸，使其失去感染性、D.T4DNA连接酶既可以催化平末端连接，也可以催化粘性末端连接6.某线性DNA分子含有5000个碱基对(bp),先用限制性内切核酸酶a完全切割,再把

得到的产物用限制性内切核酸酶b完全切割,得到的DNA片段大小如下表.限制性

内切核酸酶a和b的识别序列和切割位点如下图所示。下列有关叙述错误的是

()A．a酶与b酶切断的化学键相同B．限制性内切核酸酶a和b切出的DNA片段不能相互连接C．该DNA分子中,a酶有３个酶切位点D．仅用b酶切割该DNA分子,可得到３种DNA片段

胰岛素是治疗膜岛素依赖型（IDDM）糖尿病的有效药物，传统只能从猪和羊中提取，获得1g膜岛素大约需要100g的猪胰脏，因此生产成本高患者难以支付昂贵的药费。1978年，科学家在大肠杆菌中成功地表达了人胰岛素原,并正式批准生产和销售。基因工程的一些列操作可使得生物获得新的遗传特性基因工程的基本操作步骤：一.获取目的基因二.利用载体构建重组DNA分子三.将重组DNA分子导入受体细胞四.检测目的基因及其表达产物人体细胞增殖克隆的目的基因

人胰岛素原重组DNA重组质粒进入大肠杆菌宿主细胞

用同种限制性

内切核酸酶讲

行酶切DNA连接酶连接目的基因和质粒大肠杆菌质粒

目的基因（人胰岛素原基因）人体细胞增殖克隆的目的基因

人胰岛素原重组DNA重组质粒进入大肠杆菌宿主细胞

用同种限制性

内切核酸酶讲

行酶切DNA连接酶连接目的基因和质粒大肠杆菌质粒

目的基因（人胰岛素原基因）生产转基因胰岛素选择大肠杆菌作为受体细胞的主要原因不包括（

）A.成本低廉、操作方便B.繁殖速度快，易培养C.仅含核糖体一种细胞器D.遗传背景清晰需提取并进一步加工后才可获得有生物活性的胰岛素。一.获取目的基因1.化学合成法将核苷酸按照特定顺序一个一个地连接起来，由此合成目的基因。化学合成法需要已知目的基因全部序列，且成本较高，适于合成序列较短的基因。一.获取目的基因2.可借助载体建立基因文库获取。从基因组文库中翻阅目的基因过于繁复，如何缩小查找范围？（2）从胰岛β细胞中提取并纯化全部mRNA，在逆转

录等酶的催化下，以mRNA为模板合成互补的

DNA，即cDNA。最后利用与构建基因组文库相

同的方法构建cDNA文库。（1）建立基因组文库：将人的基因组DNA经限制酶

切片段化，与载体连接后导入微生物中储存，

形成克隆。构建基因组文库示意图DNA重组质粒克隆用限制性内切核酸酶剪切成小片段一.获取目的基因3.PCR扩增目的基因PCR又称聚合酶链式反应，是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。一.获取目的基因PCR扩增目的基因①变性：高温下DNA的两条单链分开②退火：温度降低，引物与目的基因的单链

互补配对结合，形成氢键③延伸：TaqDNA聚合酶将核苷酸不断连接

到2个引物的3'端根据目的基因两端的核苷酸序列设计引物。思考：1.PCR扩增的是完整的模板DNA分子吗?不是,PCR扩增的仅仅是两种引物之间所对应的特定DNA片段。第三轮。2.经过第几轮扩增后,扩增出的含有目的基因的DNA片段不含凸起单链?3.如果已知某目的基因的序列和结构,利用PCR筛选和扩增出该目的基因的

关键是什么?如何鉴定PCR的产物？PCR产物可利用电泳技术来鉴定。电泳是指带电粒子在电场作用下，向与其携带电荷相反的电极迁移的过程。不同带电粒子因分子大小、形状、所带电荷等因素不同，迁移速率也会有所差异。该技术是分离、鉴定、纯化核酸和蛋白质的常用方法。凝胶加样孔迁移方向核酸是带有负电的生物大分子，其迁移速率主要受核酸片段长度影响。核酸分子越大，迁移速率越慢。电泳时常使用凝胶作为介质，凝胶的孔隙可起到分子筛的作用，凝胶。DNA片段根据长度大小在凝胶上分开，形成不连续的条带，每个条带包含的DNA片段长度是相同的。凝胶加样孔迁移方向marker样1样2样3凝胶切断电源后，肉眼无法直接观察到DNA条带在凝胶中的位置。所以凝胶中的DNA分子可以用荧光或放射性染料对DNA进行标记，或使用亚甲基蓝将DNA染成蓝色后观察。DNAmarker是已知长度和含量的标准DNA片段混合物，在电泳中能作为参考。对于需要的DNA条带可从凝胶中切割回收。荧光染色电泳结果

亚甲基蓝染色电泳结果如图甲表示某DNA分子经限制性内切核酸酶（EcoRI）完全酶切后的片段电泳结果，若改变条件使其酶切不充分（但至少切割了一个识别序列）就有可能获得如图乙所示的电泳结果（Kb即千个碱基对）。下列叙述正确的是（）A.该DNA是线性DNA，其中有3个限制酶（EcoRI）酶切位点B.在这个DNA中长度4Kb和1.5Kb片段相邻C.在电泳时，A端为加样口，B端接正极D.电泳后一定要用亚甲基蓝染色才能看到条带二.

利用载体构建重组DNA分子用

，这样会在目的基因和载体DNA的两端形成

，然后用

将目的基因和载体DNA连接在一起，形成重组DNA分子。相同的2种限制性内切核酸酶相同的粘性末端DNA连接酶二.利用载体构建重组DNA分子载体分为克隆载体和表达载体，他们两者之间有什么区别？基因的结构——真核细胞启动子终止子非编码区非编码区（不能编码蛋白质）RNA聚合酶结合的位点，控制转录的开始控制转录的终止编码区转录RNA细胞核中RNA加工mRNA外显子内含子在细胞质种翻译蛋白质基因的结构

——原核细胞启动子终止子非编码区非编码区（不能编码蛋白质）编码区（连续的）转录RNA翻译蛋白质核糖体直接与拟合区DNA接触，基因表达是边转录边翻译。二.

利用载体构建重组DNA分子载体分为克隆载体和表达载体，他们两者之间有什么区别？表达载体启动子终止子目的基因复制起点标记基因克隆载体没有基因的表达系统（启动子、终止子），含复制起点、标记基因和目的基因插入位点。三.

将重组DNA分子导入受体细胞

自然条件下，细菌的转化效率很低，通过化学和物理方法的处理可以增强细菌捕获外源DNA的能力，成为感受态细胞。如将大肠杆菌放于低温、低浓度的CaCl溶液中，造成细胞膨胀，细胞膜通透性改变，成为感受态细胞。再在低温条件下将大肠杆菌与重组DNA分子混合，使外源DNA黏附于受体细胞表面，最后进行短暂的热刺激处理，使外源DNA转入细胞。人体细胞增殖克隆的目的基因

人胰岛素原重组DNA重组质粒进入大肠杆菌宿主细胞

用同种限制性

内切核酸酶讲

行酶切DNA连接酶连接目的基因和质粒大肠杆菌质粒

目的基因（人胰岛素原基因）将目的基因导入动物细胞时，常使用显微注射法。1982年，科学家将含有生长激素基因的重组DNA片段，通过显微操作仪注射到受精卵内还未融合的雄性细胞核中，体外培养一段时间后再将胚胎移植到雌性小鼠子宫内，获得了成功转入目的基因的体形大、生长快的“超级小鼠”。三.

将重组DNA分子导入受体细胞显微注射法示意图普通鼠与生长速度加快的转基因鼠（右）三.

将重组DNA分子导入受体细胞将目的基因导入植物细胞(体细胞或受精卵)时，常使用农杆菌转化法。下列关于图中T-DNA中一定含有的元件的推测，错误的是（

）A.含有标记基因B.含有限制酶切位点C.含有复制起点D.含有启动子和终止子三.

将重组DNA分子导入受体细胞基因枪法：将DNA吸附在金属颗粒表面，通过基因枪高速打入植物细胞并整合到植物DNA中表达，甚至可以将目的基因导入叶绿体等细胞器中。花粉管通道法：将重组DNA滴加到植物授粉后形成的花粉管通道内，进入卵细胞、合子或早期胚胎中。三.

将重组DNA分子导入受体细胞转基因目标微生物动物植物受体细胞方法细菌细胞感受态细胞转化法受精卵显微注射法体细胞或受精卵农杆菌转化法（80%）基因枪法花粉管通道法显微注射法（原生质体）三.

将重组DNA分子导入受体细胞四.

检测目的基因及其表达产物人体细胞增殖克隆的目的基因

人胰岛素原重组DNA重组质粒进入大肠杆菌宿主细胞

用同种限制性

内切核酸酶讲

行酶切DNA连接酶连接目的基因和质粒大肠杆菌质粒

目的基因（人胰岛素原基因）目的基因（重组DNA分子）是否在受体细胞中稳定存在并遗传？1.利用载体上的标记基因进行筛选；蓝白斑筛选是基因工程中筛选重组目的基因常用的一种方法，表现为培养基上出现蓝白颜色的菌落，可以通过颜色为依据直接筛选。图示选用质粒的LacZ基因编码的酶能催化无色的X﹣gal分解为半乳糖和蓝色的5-溴-4-氯啶，使菌落呈现蓝色，Ampr为氨苄青霉素抗性基因。1.实验小组用BamHⅠ和BlgⅡ两种限制酶切割目的基因和质粒，若要筛选成功导入

目的基因的重组质粒，培养基中应加入的物质有

和

。2.成功导入重组质粒的大肠杆菌菌落显

，若大肠杆菌菌落显蓝色，说明

导入

______________，没有导入任何外源DNA的大肠杆菌

（填“能”或“不能）在该培养基上生存。复制起点AmprLacZBamHⅠBlgⅡ青霉素X-gal白色不含目的基因的载体不能四.

检