生牛乳中病原微生物宏基因组测序鉴定方法

生牛乳中病原微生物宏基因组测序鉴定方法范围本文本标准给出了采用高通量测序技术进行生牛乳微生物宏基因组检测的方法，包括样品的采集、保存，实验室工作程序，样品处理程序及质量控制、测序数据质量控制。本文件适用于利用宏基因组学方法进行生牛乳微生物检测。规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T30989-2014高通量基因测序技术规程GB/T43628-2023空气中病原微生物宏基因组测序鉴定方法T/SZGIA1.2—2018基于高通量测序的环境微生物检测第2部分：人粪便微生物宏基因组检测方法2018-02-01现行GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法GB41918-2022生物安全柜GB/T16568-2006奶牛场卫生规范动物病原微生物宏基因组高通量测序技术规范专家共识（2024版）术语和定义3.1宏基因组metagenome特定环境中全部微生物遗传物质的总和，包含了可培养的和不可培养的微生物的基因组。3.2微生物宏基因组microbialmetagenome微生物宏基因组是以特定环境中整个微生物群落作为研究对象，无需分离培养，直接提取环境样本中全部微生物的DNA，分析其遗传组成、物种分类、系统进化、基因功能及代谢网络等。3.3测序sequencing对核酸分子中核苷酸碱基(腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶)排列顺序和组分的测定。注：序列通常从5'端到3'端表示3.4文库library通过生物来源的、人工合成的或克隆技术等所得到的一个核苷酸亚分子群,如基因组文库和互补DNA文库。3.5病原微生物pathogenicmicroorganism侵入动物体引起感染甚至传染病的微生物，包括细菌、真菌、病毒等。3.6测序片段reads高通量测序平台产生的含有碱基序列和质量值的序列片段。3.7接头adapter用于标记和固定待测序片段的一小段已知序列的DNA片段。缩略词下列缩略语适用于本文件。cDNA：互补DNA(complementarydeoxyribonucleicacid)DNA：脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid)PCR：聚合酶链式反应(polymerasechainreaction)RNA：核糖核酸(ribonucleicacid)原理采集生牛乳样本，对样本中的微生物进行核酸提取、文库制备及宏基因组测序得到微生物的核酸序列，并进行过程质量控制。使用序列分析软件将测序获得的核酸序列与微生物参考基因组数据库序列信息进行比对分析，获得数据库中比对到的微生物信息，根据设定的阈值对样本中微生物进行鉴定。试剂生物学试剂应为分子生物学级别的试剂，化学试剂应为分析纯试剂及以上，实验用水应符合GB/T6682中一级水的要求。6.1采样试剂选择与采样器配套使用的采样液，应无菌、无核酸，如高压高温灭菌水、中性磷酸盐缓冲溶液等。6.2核酸提取试剂采用商业化的核酸提取试剂盒，应满足痕量核酸提取，核酸提取总量不低于50ng。6.3文库构建试剂采用商业化测序平台的建库试剂盒。6.4测序试剂采用商业化测序平台的测序试剂盒。6.5标准物质/标准样品采用的标准物质/标准样品宜选择国家有证标准物质/有证标准样品、质量控制物质。标准物质/标准样品应包含核酸准确量值、标称特性和微生物的谱系信息。仪器设备7.1离心机：最大离心力不小于12000g。7.2涡旋振荡仪。7.3测序仪：测序通量不小于1Gb。7.4－80℃超低温冰箱。7.5水浴锅或金属浴：温度范围为20℃～100℃。7.6Ⅱ级以上生物安全柜：应符合GB41918的要求。采样方法8.1生牛乳提取方法8.1.1手工挤奶刨刷、冲洗牛体。清除牛床上粪便，固定牛尾。使用40℃～45℃温水清洗、并用干净毛巾擦干乳房，乳头严禁涂布润滑油脂。挤奶时，第一、第二把奶应弃去，应防止牛排尿或排粪污染生牛乳。挤奶后应对奶牛乳头逐个进行药浴消毒。8.1.2机器挤奶挤奶机在使用时应保持性能良好，贮奶罐及挤奶机使用前应消毒，使用后应及时清洗干净，按操作规定放置。挤奶前，应检查奶牛是否患病。对病牛尤其是患乳房炎的牛或使用抗生素后未过休药期的牛，不得上机挤奶，应转人手工挤奶，并将挤出的奶单独存放，另行处理。挤奶前用温水清洗乳房和乳头，并用一次性纸巾擦干。挤奶后用消毒液喷淋乳头消毒。 实验步骤9.1核酸提取采用磁珠法对核酸提取试剂盒对样本微生物核酸进行提取，详细提取方法及步骤按照试剂盒说明书或参考附录A。提取核酸时，需加入标准物质/标准样品进行质量控制。选择空白采样液作为阴性对照，微生物标准品作为阳性对照。满足实验要求的DNA样本应置于-20℃以下条件保存，一般不超过7天，超过7天应保存于-80℃超低温冰箱中；RNA样本应置于-80℃条件保存。核酸样本使用时，取样不应超过3次，避免样本反复冻融。9.2DNA质检9.2.1基因组完整性检测取2μl待检测DNA样品，点样于1%琼脂糖凝胶，150V电泳25min，将凝胶放入凝胶成像仪，若只有一条带型，则DNA样品完整性好；若出现轻微降解，则可以尝试风险建库，若降解严重，则建议重新提取DNA。9.2.2纯度检测使用核酸蛋白测定仪检测DNA的纯度，若A260/A280比值在1.7-2.1范围内，且A260/A230比值在1.8-2.2之间，DNA样品纯度符合文库构建的要求。9.2.3定量检测使用双链DNA测定试剂盒，取1μLDNA对样本进行精确定量。9.3文库构建和高通量测序构建文库和测序的标准化流程，按照高通量平台测序过程参见GB/T30989-2014高通量基因测序技术规程。9.4数据分析测序下机数据保存后，进行分析，具体过程参考附录B9.5数据质控要求原始数据下机后会包含带接头或低质量的reads，在进行后续分析前我们需要对其进行过滤，过滤使用的软件为fastp软件，过滤条件如下：(1)去除带接头(adapter)的reads；(2)当测序read中N含量超过该read碱基数的1%时，去除该pairedreads；(3)当测序read中含有低质量(Q<=5)的碱基数超过该条read碱基总数的50%时，去除此pairedreads；(4)当测序read中长度小于100时，去除此pairedreads。通过上述条件对原始数据进行过滤，统计过滤前后的数据量以及数据质量合格测序数据应满足以下条件：碱基质量值大于或等于Q20(碱基识别错误率不大于1%)的占比在90%以上生牛乳病原微生物的鉴定10.1病原微生物参考基因组的数据库选取病原微生物参考基因组数据库是与试验数据比对的参比数据集，可利用在线公共数据库(验证)或者自行构建，参考附录C。选择具有权威性的公共数据库如：NCBIGeneBank、NCBIRefSeq、国家微生物科学数据中心发布的gcPathogen数据库等作为建立数据库的来源，进行整理和过滤；数据库收录信息应能覆盖牛奶中的主要病原微生物。需要对数据库进行定期更新，维护，以保障病原鉴定的准确性和全面性。10.2病原微生物基因组序列比对及鉴定数据质控并去除宿主序列后，对样品数据可进行序列拼接与组装获得叠联群，与参考数据库进行比对，得到参考基因集；将可用高质量测序数据比对到组装好的参考基因集，得到基因水平上的丰度分布情况，将注释到同一物种分类水平的基因序列丰度进行叠加，得到该物种的丰度结果。使用快速序列分类软件将去除宿主后的序列进行物种分类，提取可分类到各病原微生物的序列，比对到核酸数据库。统计阳性样本中检出的微生物，统计阴性样本和待测样本中检出的微生物丰度倍数比例，根据阈值，确定本批次实验的有效性。确定达到3个非重复基因或核酸区域的报出标准。

附录A（资料性）核酸提取方法A.1宏基因组DNA提取宏基因组DNA提取可使用磁珠法或等效的核酸提取试剂盒。核酸提取试剂盒应实现微生物细胞壁破裂、核酸释放、分离、纯化等。磁珠法提取微生物DNA的具体步骤描述如下。在2.0ml的裂解管中加入适量的生牛乳样本，加入蛋白酶K和裂解液b）放入涡旋混匀振荡器振荡30S，56℃恒温水浴锅裂解40min，每隔20min振荡一次c）将裂解完成后的样品放入离心机进行瞬时离心d）加入Lysate（裂解液）、BufferKL（缓冲液）、MagbeadsPN（磁珠PN）溶液e）将SpintipsPack（磁棒套）插入96DW深孔板中，运行程序，完成提取。

附录B（资料性）分析流程B.1分析过程a)保存每个样品的双端序列数据为原始数据，即每个样本有fastq1和fastq2两个文件，为双端测序的原始序列数据，序列按顺序一一对应。b)使用质控软件进行低质量序列过滤后，保存为clean序列数据。使用比对软件（bwa）将clean序列与宿主基因组（牛基因组序列）进行比对，保留去宿主后的序列进行后续分析。c)每个样品分别使用组装软件（Megahit）进行序列的拼接组装。并使用基因预测软件(MetaGeneMark)对拼接结果中的contig进行ORF预测。选择核酸长度大于等于100bp的基因，并将其翻译为氨基酸序列。d)将所有样品预测出来的基因序列，用聚类软件(CD-HIT)进行聚类（参数为：95%identity、90%coverage），每个类取最长的基因作为代表序列，构建非冗余基因集。e)使用比对软件(diamond)将基因集与NR数据库进行比对后获得物种注释，提取注释到病原微生物的预测基因名称。f)同时使用比对软件（SOAPaligner），将每个样品的去宿主后序列与非冗余基因集进行比对,获得各样品中比对到注释为病原微生物基因的序列丰度。g)使用快速序列分类软件（Kraken2）软件下载标准库原始数据，添加牛基因组后，构建包含牛基因组的数据库。使用Kraken2对去除宿主后序列进行物种鉴定，提取分类到病原微生物的序列，并使用比对软件（blast）与NT数据库进行比对。h）以正常检出阳性样本中微生物判定实验有效。去除微生物丰度低于阴性样品中相同微生物一定倍数的微生物分类。最终以各样品中病原微生物检出达到3个非重复基因或核酸区域进行报出。

附录C（资料性）参考基因组数据库和病原微生物的提取C.1公共数据库的选取数据处理时可参考以下数据库（不限于推荐范围）：a)国家生物信息中心(CNCB)/国家基因组科学数据中心(NGDC)的基因组/gwh/b)国家微生物科学数据中心(NMDC)的微生物宏基因组数据库/c)国家微生物科学数据中心(NMDC)的全球微生物菌种目录数据库/d)国家微生物科学数据中心(NMDC)的国家病原微生物数据库/gcpathogen/e)美国国立生物技术信息中心(NCBI)的基因银行数据库/genbankf)美国国立生物技术信息中心(NCBI)的参考序列数据库/refseqg)美国国立生物技术信息中心(NCBI)的微生物基因组数据库/genomes/MICROBES/microbial_growth.htmlh)美国国立生物技术信息中心(NCBI)的物种分类数据库/taxo