3.1 重组DNA技术的基本工具(第1课时) 课件 高二下学期生物人教版选择性必修3

复习巩固磷酸酯键5'端3'端TTAACGCG5’3’3’5’磷酸二酯键具体结构限制酶切割磷酸二酯键简化磷酸二酯键TATACGCG5’3’3’5’TTAACGCG5’3’3’5’磷酸二酯键简化磷酸二酯键简化—AGTC——TCAG—5’3’3’5’磷酸二酯键第3章人教版选择性必修3基因工程苏云金杆菌毒蛋白基因毒蛋白杀死害虫棉花细胞抗虫棉的培育什么是目的基因？什么是受体细胞？什么是目的基因的表达产物？抗虫棉愿望基因工程:是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。(基因重组)意义：定向改造生物性状；克服远缘杂交不亲和障碍苏云金杆菌毒蛋白基因毒蛋白杀死害虫棉花细胞抗虫棉的培育理论基础1.DNA的基本组成单位相同(四种脱氧核苷酸)2.都遵循碱基互补配对原则3.DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构

1.基因是控制生物性状的结构与功能单位2.遗传信息传递都遵循中心法则3.生物界几乎共用一套遗传密码①不同生物的DNA能够进行拼接吗？②Bt基因在棉花细胞中能够表达？苏-基因1苏-基因2苏-基因3苏-基因4Bt基因苏云金杆菌DNA片段中的部分基因棉-基因1棉-基因2棉-基因3棉-基因4棉花细胞DNA片段中的部分基因苏-基因1苏-基因2苏-基因3苏-基因4Bt基因苏云金杆菌DNA片段中的部分基因你觉得要把Bt基因导入棉花细胞应该怎么操作？棉-基因1棉-基因2棉-基因3棉-基因4棉花细胞DNA片段中的部分基因苏-基因1苏-基因2苏-基因3苏-基因4Bt基因苏云金杆菌DNA片段中的部分基因棉-基因1棉-基因2棉-基因3棉-基因4棉花细胞DNA片段中的部分基因你觉得要把Bt基因导入棉花细胞应该怎么操作？苏-基因1苏-基因2苏-基因3苏-基因4Bt基因苏云金杆菌DNA片段中的部分基因棉-基因1棉-基因2棉-基因3棉-基因4棉花细胞DNA片段中的部分基因“分子手术刀”“分子缝合针”“分子运输车”第3章第1节人教版选择性必修301限制性内切核酸酶—“分子手术刀”171内切核酸酶(许多已经被商业化生产)一限制性内切核酸酶—“分子手术刀”苏-基因1苏-基因2苏-基因3苏-基因4Bt基因苏云金杆菌DNA片段中的部分基因限制性内切核酸酶（限制酶）1、来源：主要是从原核生物（细菌等）中分离纯化出来的2、种类：数千种一限制性内切核酸酶—“分子手术刀”EcoRⅠEscherichiacoli属名(大写)种名(小写)属名的头一个字母种加词的头两个字母大肠杆菌的R型菌株分离来的R型菌株中分离出来的第一种限制酶(许多已经被商业化生产)一限制性内切核酸酶—“分子手术刀”苏-基因1苏-基因2苏-基因3苏-基因4Bt基因苏云金杆菌DNA片段中的部分基因限制性内切核酸酶（限制酶）1、来源：主要是从原核生物（细菌等）中分离纯化出来的2、种类：数千种3、作用：一限制性内切核酸酶—“分子手术刀”苏-基因1苏-基因2苏-基因3苏-基因4Bt基因苏云金杆菌DNA片段中的部分基因限制性内切核酸酶（限制酶）3、作用：一限制性内切核酸酶—“分子手术刀”苏-基因1苏-基因2苏-基因3苏-基因4Bt基因苏云金杆菌DNA片段中的部分基因限制性内切核酸酶（限制酶）能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。第一步第二步3、作用：特点：专一性5’3’5’3’一限制性内切核酸酶—“分子手术刀”例如，EcoRⅠ限制酶的识别序列为从5’→3’方向的识别序列均为GAATTC，并切断G和A之间的磷酸二酯键你知道限制酶是如何精确切割的吗？能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。第一步第二步中轴线大多数限制酶识别序列为6个核苷酸，也有少数由4、8个或其他数量的核苷酸组成。中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的，称为回文序列。5’3’5’3’一限制性内切核酸酶—“分子手术刀”例如，EcoRⅠ限制酶的识别序列为你知道限制酶是如何精确切割的吗？能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。第一步第二步3’5’5’3’黏性末端黏性末端当限制酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA分子的两条链分别切开时，产生的是黏性末端；从5’→3’方向的识别序列均为GAATTC，并切断G和A之间的磷酸二酯键4、结果①：氢键自动断开（裸露出来的核苷酸序列）5’3’5’3’一限制性内切核酸酶—“分子手术刀”例如，SmaⅠ限制酶的识别序列为从5’→3’方向的识别序列均为CCCGGG，并切断C和G之间的磷酸二酯键中轴线5’3’5’3’一限制性内切核酸酶—“分子手术刀”例如，SmaⅠ限制酶的识别序列为从5’→3’方向的识别序列均为CCCGGG，并切断C和G之间的磷酸二酯键平末端当限制酶在它识别序列的中心轴线处切开时，产生的是平末端。3’5’5’3’4、结果②：TTAACGCG5’3’3’5’磷酸二酯键简化磷酸二酯键简化—AGTC——TCAG—5’3’3’5’磷酸二酯键一限制性内切核酸酶—“分子手术刀”推断限制酶切一次：断开

个磷酸二酯键，产生

个游离的磷酸基团，产生

个黏性末端，消耗

分子水。两22两一限制性内切核酸酶—“分子手术刀”写出下列限制酶切割形成的黏性末端BamHⅠ:-G-CCTAG*你从中发现什么现象了？不同的限制酶可能切割形成相同的黏性末端。5'3'5'3'5'3'5'3'3'5'5'3'5'5'3'3'GATCC-G-BglⅡ:EcoRⅠ:-G-CTTAAAATTC-G-形成的黏性末端（从5’往3’读）Hind

Ⅲ:-A-TTCGAAGCTT-A--A-TCTAGGATCT-A-同尾酶一限制性内切核酸酶—“分子手术刀”怎么应用限制酶呢？--ATGCATGCAT……CCAGAATTCCCA……TCCCTAAGAATTCCCATCCCAGATG……CATGCATCCATGC-----TACGTACGTA……GGTCTTAAGGGT……AGGGATTCTTAAGGGTAGGGTCTAC……GTACGTAGGTACG---苏-基因2Bt基因苏云金杆菌DNA片段中的部分基因3’5’5’3’可以用EcoRⅠ限制酶将Bt基因从DNA片段中切割下来！一限制性内切核酸酶—“分子手术刀”限制酶切割特定核苷酸序列的特定部位的磷酸二酯键怎么应用呢？--ATGCATGCAT……CCAGAATTCCCA……TCCCTAAGAATTCCCATCCCAGATG……CATGCATCCATGC-----TACGTACGTA……GGTCTTAAGGGT……AGGGATTCTTAAGGGTAGGGTCTAC……GTACGTAGGTACG---苏-基因2Bt基因苏云金杆菌DNA片段中的部分基因3’5’5’3’可以用EcoRⅠ限制酶将Bt基因从DNA片段中切割下来！你知道切割结果是怎样的？一限制性内切核酸酶—“分子手术刀”苏-基因2Bt基因苏云金杆菌DNA片段中的部分基因3’5’5’3’一限制性内切核酸酶—“分子手术刀”苏-基因2Bt基因苏云金杆菌DNA片段中的部分基因3’5’5’3’5’3’3’5’3’5’5’3’1.要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？要切两个切口，产生四个黏性末端，共产生四个游离的磷酸基团。思考一限制性内切核酸酶—“分子手术刀”2.如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？会产生相同的黏性末端思考①判断两个末端是否为同一种限制酶切割产生的方法：将其中一个末端旋转180度，若与另一个完全相同，则说明两个末端是用同一种限制酶切割②两个末端若是由同一种限制酶切割产生的，则两个片段连接后还具有该种限制酶的识别序列和切割位点-G-CCTAGGATCT-A-GATCC-G-一限制性内切核酸酶—“分子手术刀”3.限制酶能切开RNA分子的磷酸二酯键吗？不能。限制酶只能识别并切开双链DNA分子。思考4.推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么？

原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。一限制性内切核酸酶—“分子手术刀”思考5.为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？

通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中不具备这种限制酶的识别切割序列，或者DNA分子被修饰（甲基化），使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。限制性内切核酸酶（限制酶）02DNA连接酶—“分子缝合针”二DNA连接酶—“分子缝合针”苏-基因2Bt基因5’3’3’5’目的基因切割下来后怎么把它重新连起来呢？某“分子运输车”DNA序列5’3’3’5’某DNA片段……TCCCTAAGGAATTCCATCCCAGATG……CATGCA……CCACATG…………AGGGATTCCTTAAGGTAGGGTCTAC……GTACGT……GGTGTAC……5’3’3’5’用EcoRⅠ限制酶切割该DNA片段二DNA连接酶—“分子缝合针”苏-基因2Bt基因5’3’3’5’某DNA片段5’3’3’5’你知道如何将Bt基因插入下面DNA片段中吗？用EcoRⅠ限制酶切割该DNA片段5’3’3’5’具有相同的黏性末端!二DNA连接酶—“分子缝合针”苏-基因2Bt基因5’3’3’5’DNA连接酶—“分子缝合针”恢复被限制酶切开的磷酸二酯键要形成重组DNA分子，必须使基本骨架之间通过磷酸二酯键“缝”上二DNA连接酶—“分子缝合针”苏-基因2Bt基因5’3’3’5’DNA连接酶—“分子缝合针”恢复被限制酶切开的磷酸二酯键要形成重组DNA分子，必须使基本骨架之间通过磷酸二酯键“缝”上二DNA连接酶—“分子缝合针”DNA连接酶:1、作用：2、种类：将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。一种能够将两个DNA片段连接起来的酶前提:两个DNA片段具有相同的末端即可，不具有专一性类型E.coliDNA连接酶T4

DNA连接酶来源功能缝合____________和_______________缝合__________和_________结果恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的_________________大肠杆菌T4噬菌体黏性末端黏性末端磷酸二酯键平末端(效率低)平末端注意:氢键的形成不需要酶的催化二DNA连接酶—“分子缝合针”1）解旋在能量的驱动下，解旋酶将DNA双螺旋的两条链解开，氢键断裂。解旋酶ATPDNA复制过程:2）合成引物（补充）在引物酶的作用下，产生一小段RNA作为引物,后期引物会被切除引物酶引物5’3’引物的作用简单理解就是引出DNA聚合酶，因为DNA聚合酶必须识别3’端才能结合上去。3）合成子链DNA聚合酶等以解开的每一条母链为模板，以游离的4种脱氧核苷酸为原料，按照碱基互补配对原则，各自合成与母链互补的一条子链。模板模板DNA聚合酶5’3’子链延伸方向子链延伸方向随着模板链解旋过程的进行，新合成的子链也在不断延伸。子链母链母链5’3’5’3’3’3’5’5’子链4）重新螺旋每条新链与其对应的模板链盘绕成双螺旋结构。二DNA连接酶—“分子缝合针”DNA连接酶:一种能够将两个DNA片段连接起来的酶DNA聚合酶:连接的是游离的脱氧核苷酸，需要模板二DNA连接酶—“分子缝合针”DNA连接酶DNA聚合酶相同点作用实质化学本质不同点模板作用对象作用结果用途催化两个脱氧核苷酸之间形成磷酸二酯键都是蛋白质不需要需要DNA的一条链作模板形成完整的重组DNA分子形成DNA的一条链基因工程DNA复制将单个脱氧核苷酸连接到已有的DNA片段上连接两个DNA片段二DNA连接酶—“分子缝合针”名称作用部位作用结果限制酶

DNA连接酶DNA聚合酶DNA(水解)酶解旋酶磷酸二酯键碱基对之间的氢键将DNA切成两个片段,形成黏性末端或平末端磷酸二酯键将两个DNA片段连接为一个DNA分子磷酸二酯键将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端磷酸二酯键将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸将双链DNA分子局部解旋为单链小结：几种相关酶的比较限制性内切核酸酶（限制酶）DNA连接酶03基因进入受体细胞的载体—“分子运输车”三基因进入受体细胞的载体—“分子运输车”为什么不能直接将外源基因送入细胞呢？

游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解，就算可以进行转录并翻译成蛋白质、游离的DNA片段也无法随着细胞分裂而进行复制，导致子代细胞中不再含有目的基因。

若将目的基因插入载体，由于载体可以在细胞内复制，随着细胞分裂，载体会带着目的基因存在于每个子代细胞中。这样，基因工程才有意义。通常是利用质粒作为载体，将基因送入细胞。作用：将目的基因转入受体细胞，在受体细胞内对目的基因进行大量复制。三基因进入受体细胞的载体—“分子运输车”什么是质粒？大肠杆菌细胞拟核DNA质粒质粒通常是一种结构简单的大型裸露环状DNA分子，独立于真核细胞（如酵母菌等）细胞核或原核细胞（如细菌等）拟核DNA之外，携带着细菌的遗传信息，并具有自我复制能力，它的功能是决定遗传性状和传递遗传信息，是重要的遗传物质。复制原点（复制起始的分子开关）三基因进入受体细胞的载体—“分子运输车”标记基因①抗生素抗性基因②荧光蛋白基因三基因进入受体细胞的载体—“分子运输车”总结：运载体需具备的条件：②在受体细胞中稳定存在并能自我复制或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制；①有一个至多个限制酶切割位点，便于插入（携带）目的基因；③具有标记基因，便于筛选含有重组DNA分子的细胞；④对受体细胞无害、易分离。真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不完全具备对载体的要求，例如缺少合适的限制酶切点(如限制酶切点在标记基因内)、缺少启动子和终止子等。因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。现在常用的质粒，都是早期利用天然质粒经历多次改造而成的：如添加抗生素抗性基因(作为标记基因，便于筛选转化成功的细菌)、添加MCS(多克隆位点)区域等。所谓添加MCS，是质粒中的一段碱基序列，由数个酶切位点组成，这些位点在载体上都是单一位点。有时为了提高转录效率，还会插入增强子；也有可能需要剔除对受体细胞有害的基因等。天然质粒为什么要经过人工改造才能被用作载体？（了解）三基因进入受体细胞的载体—“分子运输车”总结：运载体需具备的条件：②在受体细胞中稳定存在并能自我复制或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制；①有一个至多个限制酶切割位点，便于插入（携带）目的基因；③具有标记基因，便于筛选含有重组DNA分子的细胞；④对受体细胞无害、易分离。真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。三基因进入受体细胞的载体—“分子运输车”载体种类质粒动植物病毒噬菌体一种常用载体,大多数质粒的受体细胞是细菌。受体细胞是细菌受体细胞是动植物细胞1.目的基因是要与运载体结合的，那如何

处理质粒？★重组质粒的形成思考讨论

用相同的限制酶切割目的基因和运载体。

产生相同末端，便于连接。思考：如果用一种限制酶分别切割目的基因和质粒，再用DNA连接酶处理后会出现几种产物？(只考虑两两结合)思考讨论思考：如果用一种限制酶分别切割目的基因和质粒，再用DNA连接酶处理后会出现几种产物？(只考虑两两结合)①目的基因-目的基因连接③目的基因-质粒连接（正向连接）②质粒-质粒连接④目的基因-质粒连接（反向连接）（5）目的基因自身环化结论：为避免目的基因和质粒的自身环化及目的基因与质粒的反向连接，可使用两种不同的限制酶切割目的基因和质粒双酶切法（6）质粒自身环化(1)获取目的基因和切割载体时,通常使用同种限制酶,目的是为了

。但是使用该法缺点是容易发生

以及

，为了避免上述情况发生，可采取的措施是

。产生相同的黏性末端，便于连接目的基因与质粒反向连接目的基因、质粒的自身环化分别使用两种限制酶（双酶切法）去切割目的基因和载体思考讨论(2)选择限制酶切割位点的基本原则：①切割目的基因时：

。②切割质粒时：

。能切下目的基因且不破坏目的基因至少保留一个完整的标记基因，便于筛选思考讨论限制酶DNA连接酶载体①对受体细胞无害；②有一个至多个限制酶切割位点；③有特殊的标记基因；④能自我复制或能整合到宿主DNA上。质粒、噬菌体

、动植物病毒基因工程的基本工具作为载体的条件种类:磷酸二酯键来源：主要来源于原核生物特点：作用部位：具有专一性结果：形成黏性末端或平末端连接部位：磷酸二酯键种类：E.coliDNA连接酶、T4DNA连接酶作用：把两条双链DNA片段拼接起来

课堂小结练习与应用一、概念检测1.DNA连接酶是重组DNA技术常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是（）A.能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键B.能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键C.能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键D.只能连接双链DNA片段互补的黏性末端，不能连接双链DNA片段的平末端C练习与应用一、概念检测2.在重组DNA技术中，将外源基因送入受体细胞的载体可以是（）A.大肠杆菌的质粒B.切割DNA分子的酶C.DNA片段的黏性末端D.用来识别特定基因的DNA探针A练习与应用二、拓展应用1.想一想，为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？是因为含有某种限制酶的细胞的DNA分子或者不具备这种限制酶的识别序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶，也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA入侵。2．有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶SpeⅠ进行切割，B片段分别用限制酶HindⅢ、XbaⅠ、EcoRⅤ和XhoⅠ进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点如下。