多指标正交实验法优化复方黄芪生津消渴口服液的超声波提取工艺研究

多指标正交实验法优化复方黄芪生津消渴口服液的超声波提取工艺研究摘要：目的：优化复方黄芪生津消渴口服液的超声波提取工艺。方法：以总黄酮含量、总皂苷含量和出膏率的综合评分作为考察指标，采用正交实验法，以浸泡时间、提取次数、提取时间、功率、料液比为考察因素，优选出超声波提取最佳条件组合。结果：最佳提取工艺条件为以12倍量水浸泡半个小时，在超声功率85W下提取3次，每次提取50min。结论：多指标正交试验法可以优选出较好的试验方案，可为复方黄芪生津消渴口服液的制备工艺研究提供依据。关键词：复方黄芪生津消渴口服液；超声波提取；出膏率；总黄酮含量；总皂苷含量；正交实验复方黄芪生津消渴口服液是由生山药、生黄芪、炒知母、生鸡内金、葛根、醋五味子、天花粉、茯苓、党参和制山萸肉10味药材组成的复方制剂，具有益气滋阴、生津止渴、固肾补脾的作用，临床上可用于糖尿病多饮、多食、口干、多尿、消瘦、疲乏等病症的治疗。方中黄芪、山药、知母、天花粉、葛根等均为中药处方中治疗糖尿病出现频数较高的补益、清热类中药[[]陈笑媚.治疗糖尿病的中药处方分析[J].中国医药指南,2013,11(16):408-409.DOI:10.15912/ki.gocm.2013.16.043],君药为黄芪、山药补气升阳、生津养血、补肾涩精;臣药为知母、天花粉滋阴清热、、生津止渴;佐使以五味子益气生津，鸡内金涩精止遗，山萸肉收涩固脱，党参养血生津，茯苓健脾安神，葛根清热生津止渴。中药可以降血糖的活性成分为皂苷类，可以有效减慢或修复胰岛细胞的损伤，增加胰岛素的分泌和机体对胰岛素的敏感等起到降糖作用[[]倪青,李卉.中药降糖活性成分及降糖机制研究述评[C].5TH全国中西医结合内分泌代谢病学术大会暨糖尿病论坛论文集.5TH全国中西医结合内分泌代谢病学术大会暨糖尿病论坛论文集.中华中医药学会糖尿病分会,2012:23-29.]，黄酮类化合物可以改善胰岛素抵抗、抑制相关葡糖糖代谢酶活性和抗糖尿病氧化损伤等起到降糖作用[[]蓝晓雪,杨洁.黄酮类化合物降糖功能研究进展[J].安徽农业科学,2016,44(17):255-257.DOI:10.13989/ki.0517-6611.2016.17.082]。对处方中单味药的化学成分和药理作用进行查阅文献得知，山药中山药黄酮、山药皂苷与山药多糖协同降糖，黄芪知母的主要活性成分黄芪皂苷、知母皂苷，以及葛根主要活性成分葛根素等都具有显著的降糖作用[[]何凤玲,叶小利,李学刚,李晓芳,浦东,李平,王小华,冯平.山药中降糖活性成分的筛选与比较[J].食品工业科技，2011,32(06):373-375.[]王玲丽[]陈笑媚.治疗糖尿病的中药处方分析[J].中国医药指南,2013,11(16):408-409.DOI:10.15912/ki.gocm.2013.16.043[]倪青,李卉.中药降糖活性成分及降糖机制研究述评[C].5TH全国中西医结合内分泌代谢病学术大会暨糖尿病论坛论文集.5TH全国中西医结合内分泌代谢病学术大会暨糖尿病论坛论文集.中华中医药学会糖尿病分会,2012:23-29.[]蓝晓雪,杨洁.黄酮类化合物降糖功能研究进展[J].安徽农业科学,2016,44(17):255-257.DOI:10.13989/ki.0517-6611.2016.17.082[]何凤玲,叶小利,李学刚,李晓芳,浦东,李平,王小华,冯平.山药中降糖活性成分的筛选与比较[J].食品工业科技，2011,32(06):373-375.[]王玲丽,丰华玲,杨柯,滕红梅,胡正海.黄芪生物学及化学成分研究进展[J].基因组学与应用生物学,2017,36(06):2581-2585.[]翁丽丽,陈丽,宿莹,许天阳.知母化学成分和药理作用[J].吉林中医药,2018,38(01):90-92.[7]孙华,李春燕,薛金涛.葛根的化学成分及药理作用研究进展[J].新乡医学院学报,2019,36(11):1097-1101.[]赖建有,李兴波.葛根的化学成分和药理作用和用途[J].农业与技术,2018,38(20):36.1仪器及材料仪器名称型号生产厂家紫外-可见分光光度计UV-2401-PC日本岛津公司电子分析天平SartoriousBT25S型北京赛多利斯仪有限公司1/100000电热恒温水浴锅DK-98-ⅡA天津市泰斯特仪器有限公司循环水式多用真空泵SHB-ⅢA郑州长城科工贸有限公司电子分析天平SartoriousBT25S型北京赛多利斯仪有限公司1/10000BT124S电热恒温鼓风干燥箱101-1北京市永兴仪器有限公司高频数控超声波清洗器KQ-250TDB昆山市超声仪器有限公司1.2材料生山药、生黄芪、炒知母、生鸡内金、葛根、醋五味子、天花粉、茯苓、党参、山萸肉饮片均购自兰州惠仁堂。名称批号及生产厂家芦丁批号100080-200707质量分数≥92%中国食品药品检定研究院薯蓣皂苷批号CHB190117质量分数≥98%成都克洛玛生物科技有限公司无水乙醇批号20150603天津市大贸化学试剂厂亚硝酸钠批号0151025天津市大贸化学试剂厂氢氧化钠批号20150409天津市天新精细化工开发中心硝酸铝批号20151101天津市凯信化学工业有限公司高氯酸批号2018016天津市鑫源化工有限公司哇哈哈纯净水批号20170202杭州娃哈哈集团有限公司2方法与结果2.1正交实验设计供试品溶液的制备取处方上所写的药材，按照处方上所写的量精密称取16份，将称取好的药品放置于圆底烧瓶中，按正交设计表条件安排进行超声提取，抽滤，合并滤液，定容至5L所需要的溶剂使用纯净水，得到我们需要的供试品溶液。2.2出膏率的测定使用移液管精密移取我们所得到的供试品溶液25.0ml，在已经恒定质量的蒸发皿中加入已经取好的液体，将蒸发皿放置水浴锅上蒸至没有液体存在后取出，于电热恒温鼓风干燥箱的温度达到105℃时放进去干燥三个小时，干燥完成之后取出，在干燥器中冷却30min，再使用十万分之一天平精密称定其质量，按照公式计算干膏得率。公式为[出膏率=（M1-M0）/mM1为干膏与蒸发皿总质量，M0为空蒸发皿总质量，m为提取药材的质量]2.3总黄酮的含量测定2.3.1对照品溶液的制备使用十万分之一天平精密称取已经干燥好并且重量已经达到恒定的芦丁对照品十毫升，将取好的芦丁对照品置于二十五毫升的容量瓶中,溶解和定容所需要的溶剂使用体积浓度为百分之十的乙醇溶液，然后使用移液管精密量取1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml的芦丁对照品溶液分别置于已经标记好的二十五毫升的容量瓶中使用百分之十的乙醇溶液并定容至刻度。2.3.2标准曲线的制备在二十五毫升的具塞刻度管中使用移液管精密移取2.3.1项下各个对照溶液5ml，先加入零点六毫升百分之十五的亚硝酸钠溶液振摇均匀静置六分钟，再加入一毫升百分之十的硝酸铝溶液振摇匀静置六分钟，最后加入十毫升百分之十的氢氧化钠溶液，定容所需要的溶剂使用蒸馏水并振摇均匀静静放置十五分钟，使用紫外分光光度计于510nm测定吸光度A值。以芦丁对照品浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘制曲线做回归处理，得回归方程ｙ＝11.938x+0.007，R2=0.9991。吸光度随浓度的变化曲线如图1所示。图1芦丁标准曲线2.3.3样品检测分别取2.1项下供试品溶液2ml（每个组平行三份），放置到二十五毫升的具塞刻度管中，先加入零点六毫升百分之五的亚硝酸钠溶液摇晃均匀静静放置六分钟，再加入一毫升百分之十的硝酸铝溶液，摇晃均匀静静的放置六分钟，最后加入十毫升百分之十的氢氧化钠溶液1，定容所需要的溶剂使用蒸馏水之后摇晃均匀静静放置十五分钟，使用紫外分光光度计于510nm处测定吸光度A值，并做空白对照。正交试验测定含量结果见表4。2.4总皂苷的含量测定2.4.1对照品溶液的制备使用十万分之一天平精密称取已经干燥至重量恒定的薯蓣皂苷对照品10mg，将称好的药品放置于25ml容量瓶中，溶解和定容所需要的溶剂为甲醇。使用移液管精密吸取0.1ml、0.2ml、0.3ml、0.4ml、0.5ml分别置于已经标记好的25ml容量瓶中并定容至刻度2.4.2标准曲线的制备使用移液管精密移取2.4.1项下各个对照溶液1ml放置到25ml具塞刻度管中，放置水浴锅上蒸到没有液体存在后精密加入5%香草醛-冰醋酸0.2ml和0.1ml的高氯酸，振摇均匀放于水浴锅温度达到70℃时水浴反应15min之后取出放置冰水浴10min以终止反应，精密加入5ml冰醋酸，振摇均匀，静置冷却10min，在451nm处测定吸光度A值，并做空白对照。以薯蓣皂苷对照品浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘制曲线做回归处理，得回归方程ｙ＝2.5467x+0.0593R2=0.9997。吸光度随浓度的变化曲线如图2所示。图2薯蓣皂苷标准曲线2.4.3样品检测分别取2.1项下供试品溶液0.5ml（每个组平行测定三次），置于25ml具塞刻度管中，水浴锅上蒸至没有液体存在后加入5%香草醛-冰醋酸0.2ml和高氯酸溶液0.1ml，在水浴锅温度达到70℃时水浴反应15min，取出之后放到冰水浴10min，精密加入5ml冰醋酸溶液，摇晃均匀，静静放置冷却10min，在451nm处测定吸光度A值，并做空白对照。正交试验含量测定结果见表22.5超声波提取工艺优选结果以料液比(A)、提取时间(B)、功率(C)、提取次数(D)、浸泡时间（E）为考察因素采用五因素四水平正交表L16（45）安排实验，spss软件进行数据分析，正交因素水平见表1，实验安排及结果见表2，极差分析结果见表3，方差分析结果见表4。表1正交试验因素水平水平料液比提取时间（min）功率（W）提取次数浸泡时间（h）ABCDE11:8304510.521:10406521.031:12507531.541:15608542.表2正交试验设计及结果（%）编号因素出膏率总黄酮含量总皂苷含量综合评分ABCDE11111119.661.983.5262.7321222216.861.163.1045.6831333318.742.017.7084.3241444428.492.304.3477.9252123414.421.885.3467.1362214319.441.602.6351.9372341215.301.235.6959.2182432120.001.602.5751.9993134227.112.525.3485.69103243119.632.436.9887.83113312421.491.774.8667.57123421319.431.224.0853.43134142317.611.652.5851.26144231418.711.541.9747.07154324130.202.485.9190.38164413228.332.196.6888.22注：综合评分=（出膏率÷出膏率最大值）×100×0.2+（总黄酮含量÷总黄酮含量最大值）×100×0.4+（总皂苷含量÷总皂苷含量最大值）×100×0.4表3极差分析结果因素ABCDEK1270.65266.81270.43222.44292.62K2230.26232.51256.31216.50278.26K3294.52301.17269.07327.48240.98K4276.60271.54276.22305.61259.69R64.2668.6619.91110.9851.68表4方差分析结果方差来源离差平方和自由度均方F值显著性A533.2693177.7569.331P＜0.05B748.8883249.62913.104P＜0.05D2803.6383934.54649.059P＜0.01E375.9313125.316.578P＜0.10误差57.149319.05F0.05（3，3）=9.28F0.01（3，3）=29.46以综合评分为考察指标，由表3极差分析可知，各因素对提取工艺的影响顺序为：D＞B＞A＞E＞C。由表4方差分析结果可知因素D影响极显著（P＜0.01），因素A、B影响显著（P＜0.05），因素C、浸泡时间E影响不显著。因此超声波提取最佳工艺条件组合为A3B3C4D3E1,即以12倍水浸泡半个小时，超声功率85W下提取3次，每次提取50min。3.讨论超声波的效应有热效应、空化效应和机械效应，可以增大介质分子的运动速度和穿透力，使得天然药物的有效成分进入溶剂的速度加快。在这些年来人们发现超声波提取有效成时能够节省能源，还能在使用很少溶剂时达到所需要的效果，并且对药物的生理活性影响不大，特点是可以提高有效成分的提取率，所以被广泛应用于中药制剂提取工艺中。超声波提取的主要影响