CN116036303B 一种抗体-药物偶联物及其制备方法和应用 （金麦安博生物制药(苏州)有限公司）

司由贸易试验区苏州片区新泽路1号生物医药产业园三期A区1号楼101、102为为抗HER2抗体曲妥珠单抗；该偶联物通过mAb的链之间。所述抗体药物偶联物对多种肿瘤靶细胞物的制备方法所合成的抗体一药物偶联物PRO1102在对肿瘤细胞的体外细胞毒性、大鼠体2所述偶联物通过所述mAb的链间双硫键经还原后得到的巯基与连接子一依喜替康缀合物LD038发生迈克尔3所述曲妥珠单抗的链间双硫键经还原后得到的巯基与所述LD038发生迈克48.根据权利要求7所述的抗体_药物偶联物的制备方法物38_3和D_葡萄糖反应得到。所述化合物38_1与所述N_羟基丁二酰亚胺(HOSu)混合，加入二氯甲烷以及ED将所述化合物38_2、DIPEA和DMF混合，加入所述化合物38_3，室温511.根据权利要求1_4中任一项所述的抗体_药物偶联物或根据权利要求10所述的药物组合物在制备用于治疗HER2过表达癌症的药6[0002]抗体_药物偶联物(antibodydrugconjugate，ADC)是将单克隆抗体或者抗体片毒性药物对肿瘤的高毒性，故抗体_药物偶联物能更精准地结合肿瘤细胞并降低将对正常[0005]目前，已上市的抗HER2靶向药物主要包括：1、单克隆抗体，例如，曲妥珠单抗trastuzumabderuxtecan(T_DXd)。但仍需要一种疗效更好且更能抑制肿瘤生长的抗HER27发生迈克尔加成得8述抗体_药物偶联物可以包括：所述曲妥珠单抗的链间双硫键经还原后得到的巯基与所述9[0021]iii)将所述化合物38_9与MC_OSu反应，得到所述和D_葡萄糖反应得到。[0030]根据本说明书的再一个方面，提供了所述抗体_药物偶联物或所述药物组合物在[0033]图1是根据本说明书一些实施例所示的采用SEC_HPLC法测定PRO1102含量的色谱[0034]图2是根据本说明书一些实施例所示的采用SEC_HPLC法测定trastuzumab_[0035]图3是根据本说明书一些实施例所示的采用SEC_HPLC法测定trastuzumab_偶联物与乳腺导管癌细胞HCC1954的结偶联物与人胰腺癌细胞Capan_1的结[0040]图8是根据本说明书一些实施例所示的trastuzumab在多个肿瘤靶细胞的内化率[0041]图9是根据本说明书一些实施例所示的PRO1102在多个肿瘤靶细胞的内化率的检[0042]图10是根据本说明书一些实施例所示的PRO1102、trastuzumab和其他trastuzumab偶联物对乳腺导管癌细胞H[0043]图11是根据本说明书一些实施例所示的PRO1102、trastuzumab和trastuzumab偶联物对人卵巢癌细胞S[0044]图12是根据本说明书一些实施例所示的PRO1102、trastuzumab和其他trastuzumab偶联物对乳腺癌细胞[0045]图13是根据本说明书一些实施例所示的PRO1102、trastuzumab和其他trastuzumab偶联物对人胰腺癌细胞C[0046]图14是根据本说明书一些实施例所示的PRO1102、trastuzumab和其他trastuzumab偶联物针对乳腺导管癌细胞HC[0047]图15是根据本说明书一些实施例所示的PRO1102、trastuzumab和其他trastuzumab偶联物针对人卵巢癌细胞SK[0048]图16是根据本说明书一些实施例所示的PRO1102、trastuzumab和其他trastuzumab偶联物针对乳腺癌细胞J[0049]图17是根据本说明书一些实施例所示的PRO1102、trastuzumab和其他trastuzumab偶联物针对人胰腺癌细胞Ca[0050]图18是根据本说明书一些实施例所示的PRO1102、trastuzumab和其他[0072]SMCCDM1：由连接子4(N马来酰亚胺基甲基)环己烷1羧酸琥珀酰亚胺酯(topotecan)、伊立替康(irinotecan；CPT一11)、贝洛替康(belotecan)、依喜替康为和VL区可以进一步分为由相对保守的区域(称为框架区(FR))间隔开的高变区(称为互补决发生迈克尔加成得接依喜替康和曲妥珠单抗的连接子为可裂解的亲水连接子，由于该连接子中含有较多羟基，能提高抗体_药物偶联物的亲水性，从而控制ADC的聚集，使得高负载载荷的ADC药物(DAR＝8)具备良好的物理化学性质。该连接子中包含缬氨酸_瓜氨酸(Val_Cit)二肽结构该二肽结构可以避免小分子药物被过早释放，增加抗体_药物偶[0094]曲妥珠单抗是针对细胞核HER2基因调控细胞表达的P185糖蛋白而研制的重组DNA结合，抑制HER2阳性肿瘤细胞生长。曲妥珠单抗是抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用[0106]iii)将所述化合物38_9与MC_OSu反应，得到所述和D_葡萄糖反应得到。[0114]根据上述制备方法将曲妥珠单抗与依喜替康通过连接子偶联后，得到的ADC产物本说明书抗体_药物偶联物的制备方法所合成的trastuzumab_LD038(PRO1102)在对肿瘤细换或其浓度和比例的修改或替换均在本发明的保在一些实施例中，载体可以保护组合物中的关键成分腈和0.01％TFA水溶液)，合并纯化后的制备液，浓缩后冻干得到化合物38_4(260mg，反应2小时，反应液直接用反相制备法纯化(12gC18柱，流动相为乙腈和0.01％TFA水溶液)，合并纯化后的制备液，浓缩后冻干得到化合物38_5(170mg，0.201mmol，收率为++。相为乙腈和0.01％TFA水溶液)得到化合物LD038(PB038)(11mg，0.005mmol，收率为[0145]向20mg的trastuzumab抗体缓冲液中加入10当量的TCEP_HCl水溶液，缓冲液是的抗体中，偶联反应在25℃反应2小时。多余的LD038及其副产物用50mM的磷酸盐和5mM的EDTA，pH＝6.9的缓冲液超滤去除，超滤后的trastuzumab_LD038偶联物储存在含有6％蔗LD038偶联物的纯度是98采用LCMS测得DAR值是8.0。将得到的trastuzumab_LD038偶联[0147]向20mg的trastuzumab抗体缓冲液中加入10当量的TCEP_HCl水溶液，缓冲液是得trastuzumab_deruxtecan(8)偶联物的纯度是96采用LCMS测得D[0149]向20mg的trastuzumab抗体缓冲液中加入12当量的SMCC_DM1的DMSO溶液，缓冲液中。最终采用SEC_HPLC法测得trastuzumab_e[0151]向20mg的trastuzumab抗体缓冲液中加入2.2当量的TCEP_HCl水溶液，缓冲液为其副产物用50mM的磷酸盐和5mM的EDTA，pH＝6.9的缓冲液超滤去除，将超滤得到的溶液中。最终采用SEC_HPLC测得trastuzumab_vedotin(4)偶联物的纯度是97采用LCMS细胞均购买自科佰生物。Raji(ATCC，商品目录号CCL_86)为淋巴瘤细胞，购买自ATCC，CO2条件下培养这些细胞系。用含10％FBS(Cellmax，商品目录号SA211.02)的RPMI1640(Gibco，商品目录号McCoy's5aModified(Gibco，商品目录号16600082)培养基培养SK_OV_3，用含10％FBS(Cellmax，商品目录号SA211.02)的DMEM(Gibco，商品目录号C11995500BT)培养基培养JIMT_1，用含有20％FBS(Cellmax，商品目录号SA211.02)的IMDM(Gibco，商品目录号蛋白酶消化细胞并确保合理的传代密度。当细胞处于对数生长期且数量满足试验需求时，0.18合活性。在V形底96孔板上以3×105个细胞/孔接种细胞，然后与100μL的trastuzumab或trastuzumab偶联物进行梯度稀释孵育。在4℃下孵育30分钟后，用PBS洗涤细胞两次，在合活性与trastuzumab类似，可以表明偶联后的这些trastuzumab偶联物均并未改变[0166]使用流式细胞仪对trastuzumab及其偶联物PRO1102在HER2阳性肿瘤细胞株的内化能力检测。细胞培养如上述实施例5中(1)所述，使用含10μg/mLtrastuzumab或[0167]内化率的计算方法如下：用4℃下0时间点细胞表面结合抗体的平均荧光强度[0170]细胞培养如上述实施例5中(1)所述。在添加trastuzumab或实施例1一4的将细胞暴露于trastuzumab或trastuzumab偶联物范围为100μg/mL～0.05μg/mL(3倍梯度稀[0175]实施例8抗体_药物偶联物对HER2阳性肿瘤细胞株在小鼠异种移植模型中体内抗(胰腺癌)皮下移植裸鼠，评价了trastuzumab偶联物(trastuzumab_deruxtecan(8)、[0180]根据实验动物护理和使用委员会(IACUC)批准的研究方案进行本研究。在常规监视检查)、体重升高/下降(每周测量2次或3次体响。记录死亡和观察到的临床体征。将观察到处于病情持续恶化状态或肿瘤大小超过生长曲线。相比于trastuzumab_deruxtecan(8)、trastuzumab_emtansine(4)、trastuzumab_vedotin(4)，PRO1102在多个肿瘤模型中显示出更强的肿瘤抑制效果。针对长的抑制显著强于其他偶联物和trastuzuma[0190]雄性SpragueDawley大鼠(n＝3只/组)接受3mg/kgtrastuzumab及其偶联物测方法检测血浆中的总抗浓度并使用Winnon[0192]本说明书实施例中的抗体_药物偶联物PRO110