CN116004533B iNKT细胞的激活扩增方法及其培养基组合 （珠海市丽珠单抗生物技术有限公司）

司本公开涉及一种iNKT细胞的激活扩增方法和培养基组合，所述培养基组合包括APC细胞培基包括以下组分：GM_CSF、IL_4、α_GalCer、CoCl2和NK基础培养基；所述iNKT激活培养基包21.一种用于iNKT细胞激活扩增的培养基组合，其由APC细胞培养基和iNKT激活培养基2的浓度为0.5~4mM；所述iNKT激活培养基中，IL_2的浓度为200~1000IU/mL，IL_7的浓度为1~50ng/mL，2.根据权利要求1所述的培养基组合，所述APC细胞培养基中，GM_CSF的浓度为30~803.根据权利要求2所述的培养基组合，所述APC细胞培养基4.根据权利要求1所述的培养基组合，所述APC细胞培养基中，IL_4的浓度为80~12011.根据权利要求10所述的培养基组合，所述iNKT激活培养基中，IL_2的浓度为40012.根据权利要求1所述的培养基组合，所述iNKT激活培养基中，IL_7的浓度为5~3014.根据权利要求1所述的培养基组合，所述iNKT激活培养基中，IL_21的浓度为5~3015.根据权利要求14所述的培养基组合，所述iNKT激活培养基中，IL_21的浓度为10320.根据权利要求1所述的培养基组合，所述iN将PBMC细胞在权利要求1_21任一项中所述的APC细胞培养基中培养，获得用于激活4由抗原呈递细胞(APC)表面表达的CD1d分子递呈的脂类抗原，其中α_半乳糖神经酰胺(α_Ocampoetal.IL_7DuringAntigenicStimulationUsingAllogeneicDendriticCellsPromotesExpansionofCD45RA_CD62L+CD4+InvariantNKTCellsWithTh_2bloodmononuclearcell，PBMC)作为APC，另一种将辐照后的树突状细胞(dendriticGalCer的培养基中37℃培养1_2h。[0009]通过以上两种方法得到的细胞均在含有GM_CSF和IL_4的培养基中诱导培养5_7天5[0024]将步骤(1)所述的iNKT细胞与步骤(2)所述的APC细胞在所述的iNKT激活培养基中[0025]在另一方面，本公开提供了利用前述的培养基组合和/或前述的方法扩增激活的养的温度为40_50℃同时配合上述培养基进行培养，可以有效抑制APC增殖，保证扩增后[0029]同时，本发明通过采用特定的培养基激活和扩增iNKT细胞，培养基中添加IL_2、6[0043]NKT细胞的定义有广义和狭义两种。广义的NKT细胞是指既表达NK细胞表面标志7[0046]在本公开中使用的术语“CD1d+Jurkat细胞”是指表达CD1d的Jurkat细胞，其中[0050]在本公开的一些实施方案中，所述APC细胞培养基中，GM_CSF的浓度约为20~mL或500～2000U/mL，优选约80～120ng/mL或约800～1200U/mL，更优选约100ng/mL或约[0054]在本公开的一些实施方案中，所述iNKT激活培养基中，IL_2的浓度约为200~8[0067]在本公开的一些实施方案中，所述方法步骤(2)中培养的温度约为37_52℃,优选约40_50℃,更优选42_48℃。[0068]在本公开的一些实施方案中，所述方法步骤(2)中培养时间约为1_8h，优选约1_[0073]在另一方面，本公开提供了利用前述的培养基组合和/或前述的方法扩增激活的[0075]本公开的培养基组合可以制成成套培养基，其中所述APC细胞培养基和所述iNKTPBMC中分选富集iNKT细胞，按照产品说明书进行分选操作，收集iNKT细胞和不含iNKT的分选后不含iNKT的PBMC细胞加入到含有GM_CSF、IL_4、α_GalCer和CoCl2的NK基础培养基9[0093]将组1_5处理后的APC分别与iNKT细胞共培养8天后，检测iNKT激活扩增后的细胞[0101]将组1_4处理后的APC分别与iNKT细胞共培养8天后，检测iNKT激活扩增后的细胞[0115]利用LDH法检测实施例1中扩增后的iNKT细胞对CD1d+靶细胞的细胞毒性，收集对数生长期的CD1d+Jurkat细胞(一种人急性T淋巴细胞白血病细胞，购自ATCC，货号TIB_250g离心4min，吸50μL上清至新的96孔板后添加50μL的CytoToxReagent(购自值–靶细胞自发吸光值×100)/(靶细胞吸光值最大值–靶细胞[0118]实验结果显示，实施例1的方法扩增后的iNKT对CD1d+靶细