CN115927029B 一种产大麻萜酚酸的重组酿酒酵母及其构建方法和应用 （森瑞斯生物科技(深圳)有限公司）

道沿山社区南海大道1019号南山医疗WO2022127481A1,2022.06一种产大麻萜酚酸的重组酿酒酵母及其构本申请涉及一种产大麻萜酚酸的重组酿酒酵母，所述重组酿酒酵母由基础酿酒酵母制得，其中所述基础酿酒酵母的以下内源性基因被过码以下酶的外源性基因被过表达：四酮合酶因、香叶基焦磷酸:橄榄油酸酯香叶基转移酶株，选择性地过表达Cs.TKS、Cs.OAC、Cs.PT4、性地敲除pep4，选择性地过表达通过或不通过2酒酵母的外源性基因变体乙酰辅酶合酶Se.ACSL641P被过表达，所述变体乙酰辅酶合酶Se.ACSL641P的核苷酸序列为SEQ的Cs.PT4基因Cs.PT4n还包括将截5.根据权利要求1所述的一种产大麻萜酚酸的重组酿酒酵母，其特征在于，过表达通过pHSP26启动子表达，所述Cs.OAC3序列如SEQIDNO:32所示，Cs.OAC5序6.根据权利要求1所述的一种产大麻萜酚酸的重组酿酒酵母，其特征在于，过表达7.根据权利要求1所述的一种产大麻萜酚酸的重组酿酒酵母，其特征在于，过表达Cs.OAC包括将编码基因通过linker与Cs.TKS连接后插入到基础酿酒酵母基因组上，通过10.根据权利要求1所述的一种产大麻萜酚酸的重组酿酒酵母，其特征在于，所述性基因fas1被下调包括用在半乳糖中不表达的pHXT1来下调f13.一种根据权利要求1~12任一所述产大麻萜酚酸的重组酿酒酵母的构建方法，其特314.权利要求1~12任一所述的产大麻萜酚酸的重组酿酒酵母在大麻萜酚酸生产中的应（2）将重组酿酒酵母种子液转接到合适产大麻萜酚酸的培养基中并培养重组酿酒酵16.权利要求1~12任一所述的产大麻萜酚酸的重组酿酒酵母在大麻萜酚酸的下游大麻4一种产大麻萜酚酸的重组酿酒酵母及其构建以转化为其他多种大麻素，例如，通过相应的酶转化成另外三种大麻素：四氢大麻酸短的香叶基焦磷酸:橄榄油酸酯香叶基转移酶(Cs.PT4n)基因和变体乙酰辅酶合酶5酸酯香叶基转移酶(Cs.PT4n)和Se.ACSL64[0026]在一些实施方案中，所述过表达Cs.OAC包括将编码基因插入到酿酒酵母基因组上游的600bp)或pTDH3启动子(启动子6[0036]在一些实施方案中，所述gal4基因编码参与Gal基因激活的转录调控因子，所述[0042]PCR扩增得到待敲除基因的同源片段，用同源片段替换酿酒酵母基因组上的待敲[0046](2)将重组酿酒酵母种子液转接到培养基中并培养重组酿酒酵母，使其生产大麻麻素生产中的应用。7[0055]图2为在产CBGA菌株yCAN31的基础上，对途径酶Cs.TKS、Cs.OAC、Cs.PT4n、[0065]7.敲除：是用含有一定已知序列的DN[0073](5)在悬浮的细胞中加入醋酸锂转化混合物，经42℃热激40891C的基因组为模板，得到整合位点1622b上游片段1622b_Up、整合位点1622b下游片段1414a上游片段1414a_Up、整合位点1414a下游片段1414a_Down、整合位点106a上游片段TDH1t片段；以包含pGAL1基因的基因组为模板，扩增获得pGAL1片段；以包含pGAL4(OC)_NO:2)或linker(SEQIDNO:3基础酿酒酵母基因组上；以及1414a_Up_pTDH3_Cs.OAC_ENO1t_1414a_Down表达盒，此处Cs.OAC不使用linker，直接基因插入到酿酒酵母基因组；及511b_Up_pGal4(OC)_Gal4_TGal4/pHSP26_Cs.OAC3_linker_Cs.OAC5/pGal1_Cs.OAC4_511b_Down表达盒，此处MasterMix(PhantaDNA聚合酶)进行PCR扩增整合片段。以酿酒酵母CEN.PK2_1C的基因组为模板，扩增获得上游同源臂gal80_Up片段和下游同源臂gal80_Down片段。得到表达盒[0097]其中，下调fas1通过替换fas1启动子实现。通过2×PhantaMaxMasterMix用表4中的引物3和引物4扩增得到启动子pHXT1片段，最终得到pfas1_Up_pHXT1_fas1表达所记载的产CBGA菌株)中。表4中的引物1和引物7用于对构建菌株进行PCR反应，获得菌落[0102]敲除基因pep4通过连接pep4基因的上游和下游实现。通过2×PhantaMaxMaster使用表5中的引物1和引物2扩增获得上游同源臂Pep4_Up片段，使用表5中的引物3和引物4扩增获得下游同源臂Pep4_Down片段。然后将片段的组合转化到高产大麻萜酚酸的菌株[0106]实施例3在高产大麻萜酚酸菌株yG278基因组中过表达编码乙酰辅酶A[0107]通过2×PhantaMaxMasterMix(PhantaDNA聚合酶)进行PCR扩增整合片段。以酿酒酵母CEN.PK2_1C的基因组为模板，使用表6中的引物1和引物2扩增获得整合位点上游以拥有pSeGAL2启动子菌株的基因组为模板，通过表6中的引物3和引物4扩增得到启动子模板，通过表6中的引物5和引物6扩增得到Se.ACSL641P_tADH1片段，最终得到HO_Up_pSeGAL2_Se.ACSL641P_tADH1_HO_Down表达盒片段。然后将HO_Up_pSeGAL2_Se.ACSL641P_[0111]实施例4在高产大麻萜酚酸菌株yG278基因组[0112]通过2xPhantaMaxMasterMix(PhantaDNA聚合酶)进行PCR扩增整合片段。以酿酒酵母CEN.PK2_1C的基因组为模板，使用表7中的引物1和引物2扩增获得整合位点上游及已经整合了终止子tADH1的菌株基因组为模板，通过表7中的引物5和引物6扩增得到将HO_Up_pSeGAL2_Cs.PT4n_SNC1_tADH1_HO_Down表达盒片段转化到高产大麻萜酚酸的菌产物OA及GPP生成目标产物CBGA，实现了大麻素关键前体大麻萜酚酸CBGA高产酵母菌株的[0121](2)将由步骤(1)得到的重组酿酒酵母种子液转接到合适