俄罗斯引进马铃薯品种的分子身份证构建

俄罗斯引进马铃薯品种的分子身份证构建

甘薯是谷物、蔬菜、饲料和工业材料的主要耕作单位。由于其广泛的种植、高产量和高产

量，它已成为世界第三粮食。其中，具有高产、优质、抗病等特性马铃薯品种的选育与推

广对促进农民增收和维护粮食安全发挥重要作用（盛万民等,2013,马铃薯产业与农村区域

发展，（7）:122-124）。为提高育种效率，人们利用各种技术对其种质资源开展广泛的研究。

随着DNA标记技术的发展、特别是马铃薯SSR标记引物序列的公开，国内外学者对马铃薯

品种遗传基础、种质资源遗传多样性及群体结构的研究陆续有报道,极大促进了马铃薯多

态性研究，为马铃薯品种的鉴定提供广阔的发展前景。卜匕Gregor等（2000）利用5对SSR分

子标记引物有效区分24份南美的马铃薯栽培品种。Norer。等（2002）利用分子标记技术对

欧洲的37份马铃薯品种进行了研究,用3对引物有效区分36份品种。Ghislain等（2004）

利用156对SSR引物中筛选出的18对SSR多态性引物,可直接用于马铃薯种质资源鉴定工

作。徐敏（2007）利用SSR标记技术对我国审定品种203份的马铃薯品种的遗传多样性研究,

发现我国马铃薯品种群体结构遗传基础较单一。段艳风等（2009）筛选出10对性能稳定、

多态性好的SSR引物,检测分析了我国审定的88份马铃薯材料,发现我国同一地点育成的

马铃薯亲缘关系较近,遗传基础狭窄。赵光磊等（2015）从80对引物中筛选出34对多态性

好引物标记对黑龙江省34份马铃薯品种遗传多样性的进行了分析，发现黑龙江省主栽马铃

薯品种的遗传距离小,遗传多样性低。上述研究表明,SSR分子标记技术在马铃薯遗传多样

性研究和品种鉴别方面愈加成熟，特别是国内马铃薯品种的遗传多样性还较低。

黑龙江省是中国马铃薯重要的生产和研发基地,马铃薯己逐渐主粮化，」成为该省的第四大

作物（李成军，2007,作物杂志，（4）:13T6）。但是黑龙江省马铃薯品种的亲本大多数引

自欧洲的栽培种，少数含有原始栽培种和野生种的血缘,遗传基础非常狭窄（张丽娟等，

2014,马铃薯产业与小康社会建设，（7）:107-109）。俄罗斯与黑龙江省相邻，气候和地理

条件相似,具有丰富的抗性基囚及品质性状优良的基囚材料，是黑龙江省马铃著种质资源的

重要引源地（金光辉等，2003,中国马铃薯，17（2）:191T92）。近年来，黑龙江省从俄罗

斯引进的马铃薯品种资源具有品质好，产量高,兼具抗旱、抗病等特点,这些特性非常适合

于黑龙江地区的马铃薯改良，但是有关这部分俄引资源的遗传多样性和群体结构的相关研

究报导还没有。因此，本研究以52份俄引马铃薯品种为试材，选用11份黑龙江省主栽品

种为对照,利用SSR分子标记技术对对其进行多样性和群体遗传结构的分析，以期为黑龙江

省马铃薯育种亲本选择,饵造新种质提供分子遗传学信息。

1结果与分析

1.1ssr位点基因信息分析

分别选取6份黑龙江省和俄罗斯马铃薯品种进行100对合成的SSR引物多态性扩增预筛

选。扩增结果表明，有37对可扩增出清晰稳定的谱带（图1）,有效扩增率为37%其中23

对SSR引物具有多态性，多态性引物占23.0%,分布位于马铃薯4个染色体组的12条染色

体上（表1）。上述引物在63份参试品种中共扩增出86个等位基因，每对引物观测等，立基

因2~5个,平均为3.7个（由于对SSR位点的人为识别较为严格，因此等位基因数相对较

低）。其中STM0020和STI029观测等位基因数最多,STM0029有效等位基因数最

多,STM0025多态性信息含量最高。引物平均有效等位变异为3.6239个，平均有效等位变

异比为0.9649,引物位点的多态信息含量指数（PIC）变幅为0.0339~0.6884,平均多态性

信息含量为0.5285o说明所选用SSR引物在马铃薯上具有较高水平的多态性。

1.2最优k值的确定

利用Structure软件分析俄罗斯马铃薯的基因型群体结构,并且采用两种方法来确定最优K

值。根据Pritchard等（2000）的方法，当K值在6时达到最大值，表明最优K值为6。基于

Evanno等（2005）中提出的方法,当K值为6时，曲线具有最大的拐点:,最优K值即为6（图2）。

根据以上两种方法最终推断出63份马铃薯基因型存在于6个独立亚群中。

1.3有供试材料的

利用主成分分析进一步验证Structure的群体结果。第一和第二主成分分别揭示总变异的

17.9%和2.5%（图3;图4）。来源于俄罗斯的52份马铃薯品种也分为6个群体，黑龙江省

的11份对照品种来源分布于其中的4个群体中。

为了进一步揭示俄罗斯马甘薯品种的群体分化与亲缘关系,用MEGA软件进行聚类分析,构

建了63份供试材料的系统发育树（图5）。所有供试材料可分为6个类群，其中第【和第IV

类中品种最多，分别为15份和19份，第H和HL类中次之，分别12份和9份，而第V和明类

中各只有四个品种。6个类群中都有俄罗斯品种,而黑龙江省的11份对照品种仅存在于其

中的第I、II、【II和IV等4个类群中。其中在第【类群有“克新4号”、“尤金”和

“米拉”三个对照品种，说明这3个品种与俄引的“BE200158-3”、“BE200170T0”和

“俄-13”等12个品种遗传距离较近；在第I【类群中，只有一个对照品种“克新2号”，这

表明，该品种与俄引的“rH6pM乂59/m-56"、“PaHHH丘”和“BMp244”

等11个品种遗传距离较近;在第III类群中“克新17号”、“夏波蒂”和“克新19号”

与俄引的“丫Jia反ap”、“波S”和“俄薯泥”等5个品种遗传距离较近;存在于第

N类群中“克新23号”、“克新1号”、“克新18号”和“克新13号”等四个而照品

种与俄引的“「H6p”以728-6"、“波BR”和“rM6PH只569N”等15个品种

遗传关系较近;在VI和V类群中不存在黑龙江省马铃薯品种，说明其中的8个俄引品种与黑

龙江省主栽马铃薯品种遗传距离较远。这些结果为俄引品种的杂交利用提供了数据信息。

1.4分子身份证构建

根据电泳条带大小用数字依次记录其等位基因，利用WAnalysisl.O软件进行分子身份证

数据录入和分析。主要分为两种，一种是采用引物的特异性基因目标条带划分品种,这类划

分的品种较少,其中，引物STM0046在材料14DEm23中显示特异条带2,引物STL047在材料

14DEM11中显示特异性条带为0。由于在PCR分子检测中具有特异等位基因片段的品种数

量较少，另一种是采用多个引物的等位基因组合来划分品种，研究结果表明，易那余5对不符

合标准的引物,分别为STM0025,STL00i,STL007,STM0038和STL057,1对引物相似系数过高,

为STM0046,最后获得分子身份证引物为STL029、STP0AC58、STMH06、STL047.STM0051、

STM1030及STL004共7对,这曲引物可将供试品种区分开,用于身份证构建（表3）。以参试

俄罗斯马铃薯品种“14DEM01”来说明，它的分子ID身份证是3121433,表示在STL029引物

中存在第3个基因片段、在STPOAC58引物中存在第1个基因片段,在STM1106引物中存在

第2个基因片段,在STL047引物中存在第1个基因片段，以此类推,到第7个STL004引物

中存在第3个基因片段,这些基因片段组成了PCR分子指纹图谱，其数字就构成马铃薯品种

的分子ID。通过软件分析，最终利用引物STL029、STP0AC58、STM1106、STL047、STM005K

STM1030和STL004建立分子指纹图谱（图6）。

利用筛选出的23对引物对每一个马铃薯品种进行扩增,根据扩增片段大小用数字分别依次

记录其等位基因。将这些数据用GeneticsStatistics3.0软件分析，获得63份马铃碧的

特异性指数（表2）。由特异性指数可见，品种间差异较大,介于150.762~273・970之间,平均

为184.921o其中14DEM25特异性指数最低,为150.762,14DEM56特异性指数最高,为

273.970。俄罗斯马铃薯的平均特征值为189.1213,而黑龙江省马铃薯的平均特征值为

165.0627,低于俄罗斯马论薯特征值。特异性指数经k方检验，材料间差异达到极显著水

平。

2群体结构和遗传多样性

本研究选用覆盖全基因组23对SSR标记对俄罗斯马铃萼品种进行遗传多样性分析和电子

身份证构建。在实验中剔除了PCR扩增目标条带不稳定、多态性不高的引物后，最终所选

用SSR引物的目标条带清楚、稳定、多态性好且多态信息含量PIO0.5,这表明这些SSR标

记具有高度的多态性位点,其中STI001、STI007、ST1029.STM0025.STM1106和ST-

POAC58等位点上表现较高的遗传多样性,这些位点能较好地反映了供试马铃薯品种的遗传

多样性,适合应用于俄罗斯马铃薯品种的遗传多样性检洌。

遗传多样性的研究对马铃薯品种选育具有重要的指导意义。遗传多样性决定了马铃薯对环

境的适应能力和利用潜力（李为民等，2012;胡建斌等，2013）o分子遗传信息为育种者充

分了解资源材料的遗传背景，并准确选择杂交亲本，快速培育优良新品种提供了有力支持。

在本研究中俄罗斯的马铃薯的特异性指数为189.12,而3份黑龙省马铃薯的特异性指数为

165.06,低于俄罗斯马铃薯的特征值,虽然,供试的黑龙匚省品种较少，但是从中也可看出，

俄罗斯马铃薯品种的遗传多样性还是比较高的,这与唐铭霞等（2010）研究的结果相一致，而

国内现有的马铃薯品种遗传多样性水平较低，品种间的遗传差异较小，因此，俄罗斯资源的

引进会进一步丰富我国马玲薯遗传基础。

本研究利用STRUCTRURE、主成分分析和MEGA软件聚类分析3种方法对俄罗斯马铃薯进行

群体结构分析,3种方法均显示63份马铃薯可分为6个群体。其中俄罗斯马铃薯品种可

以分为6个亚群，黑龙江省马铃薯分布在其中的4个亚群中，聚类分析显示两国品种的亲

缘关系的远近，反映了品种之间的亲本关系，也可反映品种之间在长期的栽培过程中的存在

基因交流现象。如在第四亚群中（图5）,黑龙江省马铃著DEM49（克新13号）和俄罗斯马铃

薯DEM12（BE20413-22）亲缘关系较近，聚在一起，可以直接反映参试材料的亲缘关系。本实

验采用全基因组均匀分布的23对SSR引物马铃薯分子标记,剔除了大量的SSR引物，从基

因组的覆盖程度和准确程身来说，有了很大的提高，更能够准确地反映供试材料的多样性和

遗传结构的特点。然而若要更全面反映两国马铃薯品种的亲缘关系及群体结构，则应该将

更多的马铃薯品种纳入进来。

3材料和方法

3.1主栽马铃薯品种为

俄罗斯引进马铃薯品种52份，以“克新1号”、“克新2号”和“克新19”等11份黑

龙江省主栽马铃薯品种作为对照。供试材料均由黑龙江省农业科学院作物育种所马铃薯研

究室提供（表3）。

3.2ssr引物的选择

从每份无病菌侵染马铃薯忒管苗中选择5株生长良好的单株，取嫩叶混合后用CTAB法（张

宏纪等,2008）分别提取基因组DNA。5倍稀释后用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，于-80C超

低温冰箱保存。

SSR引物序列信息来源于GrainGenes,在马铃薯栽培种每条染色体上平均选择5-10标记，

共计100对引物，选择标记尽可能均匀分布于马铃薯染色体组（Milboumeetal.,1998;

Feingoldetal.,2005;Bradshawetal.,2008）。上海生工生物工程有限公司合成了

实验所用的SSR引物。

3.3per扩增taqna

使用GeneAmpPCRSystem9700仪进行扩增。反应总体积均为25uL,DNA模板5P