T∕CVMA 380-2026 猫贫血相关六种病原体实时荧光RAA检测方法

准猫贫血相关六种病原体实时荧光RAA检测方法2026-4-1发布2026-4-1实施I本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由浙江农林大学提出。本文件由中国兽医协会归口。本文件起草单位：浙江农林大学动物科技学院动物医学院、杭州迅灵生物科技有限公司、杭州领与众创生物科技有限公司、山东远大富邦生物工程有限公司。本文件主要起草人：谢作缎、吴芹、孙静、邵春艳、崔心江、陈中炜、付玉和、林淦、胡彬、唐浩、王佳慧、谢铭。型、猫嗜血支原体加州型、猫嗜血支原体苏黎世型六种病原体的荧光RAA检测方法。仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求GB/T27401动物检疫实验室质量控制规范兽医学检测NY/T541兽医诊断样本采集、保存与运输技术规范BHQ1:黑洞淬灭基团1(blackhCTAB:十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrimethylammoniumbromide)DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid)EDTA:乙二胺四乙酸(ethylenFAM:6-羧基荧光素(6-carboxyfluorescein)MMLV:莫洛尼氏鼠白血病逆转录病毒(mRNA:核糖核酸(ribonucleicacid)RAA:重组酶介导链替换核酸扩增(rTris:三(羟甲)基氨基甲烷(tri-methylolaminomethane)工25.1.1除非另有说明，所用试剂均为分析纯，试验用水符合GB/T6682中一级水的要求，所有试剂均用无RNA酶的容器分装。5.1.3CTAB提取缓冲液按附录A.2配制。5.1.4核酸抽提液按附录A.3配制。5.1.670%(体积分数)乙醇。5.1.7TE缓冲液按附录A.4配制。5.1.8PBS缓冲液按附录A.5配制。5.1.9启动剂按附录A.6配制。5.1.10商品化RAA荧光反应单元：包含重组酶、单链结合蛋白、DNA聚合酶的冻干粉。5.1.11商品化RT-RAA荧光反应单元：包含MMLV逆转录酶、重组酶、单链结合蛋白、DNA聚合5.1.12阳性对照。猫免疫缺陷病毒、猫白血病病毒阳性对照的制备见附录A.7;汉塞巴尔通体、猫嗜血支原体俄亥俄型、猫嗜血支原体加州型、猫嗜血支原体苏黎世型阳性对照的制备见附录A.8。5.2.1猫免疫缺陷病毒荧光RT-RAA的引物探针按照附录B中B.1,特异性扩增片段序列见附录C中5.2.2猫白血病病毒荧光RT-RAA的引物探针按照附录B.2,特异性扩增片段序列见附录C.2。5.2.3汉塞巴尔通体荧光RAA的引物探针按照附录B.3,特异性扩增片段序列见附录C.3。5.2.4猫嗜血支原体俄亥俄型荧光RAA的引物探针按照附录B.4,特异性扩增片段序列见附录C.4。5.2.5猫嗜血支原体加州型RAA的引物探针按照附录B.5,特异性扩增片段序列见附录C.5。5.2.6猫嗜血支原体苏黎世型荧光RAA的引物探针按照附录B.6,特异性扩增片段序列见附录C.6。36.8冰箱：2℃~8℃,-20℃或-80℃。用于核酸检测的样品应尽快送检，24h内的样本可置于4℃保存，24h内无法检测的样本应置于-80℃保存，如无-80℃条件，则置于-20℃冰箱保存，保存时间不得超过两个月。8.1.1在样本制备区进行，核酸提取使用CTAB法提取，也可采用其他等效核酸提取方法。8.1.2待检样品、阳性对照和阴性对照的份数总和用n表示，取n个灭菌1.5mL离心管，逐管编号。8.1.3取200μL样品加入600μLCTAB提取缓冲液，涡旋振荡混匀后于70℃孵育15min,期间颠倒离心管2～3次。12000r/min离心5min,取上清液于一新的1.5mL离心管中。8.1.4加入500μL核酸抽提液，上下颠倒离心管2～3次后涡旋振荡混匀，12000r/min离心5min;8.1.5加入0.7倍体积异丙醇，轻柔颠倒离心管2～3次，4℃静置30min,48.1.6加入700μL70%(体积分数)乙醇，重悬沉淀，12000r/min离心1min,小心弃去上清液。4在试剂储存和准备区进行扩增试剂的准备和配置。待检样本、阳性对照和阴性对照的总份数用n猫免疫缺陷病毒(FIV)RT-RAA反应体系和猫白血病D.1。汉塞巴尔通体RAA反应体系、猫嗜血支原体俄亥俄型RAA反应体系、猫嗜血支原体加州型各反应充分混匀后，分装20μL/管至无菌PCR管中，密封后转移至样本制备区，用按GB/T27401中结果质量控制规定执行，阴性对照无荧光对数增长，无相应T值(时间);阳性对照有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的T值(时间)≤15min,实验结果才能如T值(时间)≤15min,则判定被检样品阳性，表述为“检出阳性核酸”。如15min<T值(时间)<20min,则重复一次。如再次检测结果仍然是T值(时间)<20min,则判定被检样品阳性，表如无报告T值(时间)或无荧光对数增长则判定被检样品阴性，表述为“未检出阳性核酸”。5(规范性)将DEPC加入去离子水中至终浓度为0.1%(体积比),充分混合均匀后作用12h,分装，121°C称取Tris121.1g加入800mL超纯水，充分搅拌至完全溶解，缓慢滴加浓盐酸调节pH至8.0,定容至1L。称取Na₂EDTA·2H₂O186.1g,加入800mL超纯水，缓慢加入氢氧化钠颗粒调节pH至8.0并完全溶解，定容至1L。称取氯化钠40.91g与CTAB10.0g,加入800mL超纯水加热搅拌至完全溶解，依次加入1mol/LTris-HC1母液(pH8.0)50mL与0.5mol/LNa₂EDTA母液(pH8.0)20mL,调节pH至8.0定容至1L,高压灭菌后常温保存。A.3核酸抽提液(pH8.0)量取5mL1MTris-HCI(pH8.0)和1mLEDTA于500mL(pH8.0)烧杯中，加入约400mL超纯溶液至7.4,超纯水定容1L,高压灭菌后常温保存。A.6启动剂称取15.0gPEG-3500、6gMg(CH₃COO)₂·4H₂O溶于70mL超纯水，搅拌至完全溶解后，定容100合成猫免疫缺陷病毒、猫白血病病毒装甲RNA假病毒(MS2噬菌体假病毒),将装甲RNA假病毒载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)表达系统后诱导表达纯化获得装甲RNA病毒颗粒，并对提取后装甲RNA病毒颗粒进行逆转录并进行荧光RT-PCR检测。检测阳性的，即为猫免疫缺陷病毒、猫白血病病毒阳性对照母液。将阳性对照母液10倍梯度稀释之后，选取10⁴copies/μL稀释度作为阳性对照。A.8汉塞巴尔通体、猫嗜血支原体俄亥俄型、猫嗜血支原体加州型、猫嗜血支原体苏黎世型阳性对照制备异性扩增片段，克隆至pUC57载体，再转化至DH5α感受态细胞，构建重组质粒，提取重组质粒进行PCR检测和测序分析，结果正确的为阳性重组质粒。利用超微量分光光度计测定阳性重组质粒浓度，并将浓度换算成拷贝数(DNA拷贝/μL)=[6.02×10²³×DNA浓度(ng/μL)×10-9]/(DNA碱6即为用于汉塞巴尔通体、猫嗜血支原体俄亥俄型、猫嗜血支原体加州型、猫嗜血支原体苏黎世型的阳性对照母液。将阳性对照母液10倍梯度稀释之后，选取10⁴copies/μL稀释度作为阳性对照。7(资料性)名称引物/探针序列(5'→3')基因CAGAAATTATGGGTATAGGATTATTGGGCAAACAATCTGTCTATAAAGGCAGCTAGGATGCAGTGTAGAGCATGGTA[FAM-表B.2猫白血病病毒RT-RAA引物探针序列名称引物/探针序列(5'→3')扩增长度基因GCCAAGAACAGTTAAGCCTCGGTGGGGGCTGATGGCTCGTTTTTTGACCAAAGTCCGACCTTCCGCCTCA[FAM-d表B.3汉塞巴尔通体RAA引物探针序列名称引物/探针序列(5'→3')扩增长度基因CGTCAATGCCTATATGAAACTACAACAATGATGATGACCTTATGGTGCGCTTTGAGTTATATAGATTTTGTAATCCC[FAM-8引物/探针序列(5'→3')基因A[THF][BHQ1-dT]ACACGAAAAACCT-C3Spa表B.5猫嗜血支原体加州型RAA引物探针序列名称引物/探针序列(5'→3')扩增长度基因CCAGTAGTCCACGCCGTAAACATTTCTATAGCTTCGCAAAAGAAGTGGTGGAGCATGTTGCTTAATTCGA[FAM-A[THF][BHQ1-dT]ACACGAAAAACCT-C3SpaB.6猫嗜血支原体苏黎世型引物探名称引物/探针序列(5'→3')扩增长度基因CCAGTAGTCCACACCGTAAACAAACATCTCATGACACGAGCTGACGAAGTGGTGGAACATGTTGCTTAATTCGA[FAM-A[THF][BHQ1-dT]ACACGAAAAACCT-C3Spa9(资料性)CGTCAATGCCTATATGAAACTATCGGTTCAATCATATCGCTTTGAGTTATATAGATTTTGTAATCCCTCTTTTGATCGTTTTAAACGCTTTATCCTGATTTAGGGGCCGTAGCTACCTGCTTTGCAAGCAGGGGGTCGTCGGTTCGATCCCGTCCGGCTCCACCATACCAGTAGTCCACACCGTAAACGATGGGTATTAGATATTAGGGCTTGCTTACGCGTTAAATACCCCGCCTGGGTAGTACATATGCAAATATGAAAGGGATCTGAACAAGTGGTGGAGCATGTTGCTTAATTCGATAATACACGAAAAACTTTGACATCCCTCGCAAAGCTATAGAAATATAGTAGAGGTTATCGAGGTCCAGTAGTCCACGCCGTAAACGATGGGTATTAGGTATTTGGTCTAGCTAACGCGTTAAATACCCCGCCTGGGTAGTATATATGCAAATATGAAACTCAAAGAGGGGACCTGAACAAGTGGTGGAGCATGTTGCTTAATTCGATAATACACGAAAAACCTTACCGAGGGGGACCTGAACAAGTGGTGGAACATGTTGCTTAATTCGATAATACACGAAGTTTGACATCCTCTGCAAAGCTATAGAAATATAGTGGAGGTTATCAGAGT(资料性)反应体系和反应程序D.1猫免疫缺陷病毒、猫白血病病毒荧光RT-RAA反应体系猫免疫缺陷病毒、猫白血病病毒荧光RT-RAA反应体系见表D.1。表D.1猫免疫缺陷病毒、猫白血病病毒荧光RT-RAA扩增体系体积(μL)RT-RAA荧光反应单元(25μL反应体系冻干粉)-启动剂正向引物(10μmol/L)反向引物(10μmol/L)总体积D.2汉塞巴尔通体、猫嗜血支原体俄亥俄型