T∕CVMA 364-2026 华支睾吸虫病诊断技术

准华支睾吸虫病诊断技术2026-4-1实施2026-4-1实施I本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由吉林大学提出。本文件由中国兽医协会归口。本文件起草单位：吉林大学、中山大学、中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所。本文件主要起草人：刘晓雷、刘明远、唐斌、白雪、王学林、丁静、李辰、金雪敏、徐凝、余新炳、黄艳、洪炀。1本文件适用于鱼类肌肉组织样品中华支睾吸虫囊蚴和哺乳动物粪便样品中华支睾吸仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本GB/T6682分析实验室用水规格和试验NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范dNTP:脱氧核糖核苷三磷酸(deoxyribonucleosidetriphosphate)EB:溴化乙锭(ethidiumbromiPCR:聚合酶链式反应(polymerasechainreaction)25.1.537℃恒温箱。5.1.8试管(10mL)、橡皮塞。5.1.11烧杯(1L)。5.1.12尼龙绢(80目)。5.1.14塑料定量板：中央孔呈圆台形，短径3mm,长径4mm,高1mm,容积为38.75mm³。5.1.15亲水玻璃纸：规格为40μm厚，裁剪成25mm×40mm大小，使用前在透明液中浸泡24h以5.2试剂5.2.3透明液：由纯甘油100mL、3%孔雀绿(或亚甲基蓝)水溶液1mL和蒸馏水100mL配制而成。5.2.5胃蛋白酶(1:3000)。将待检的淡水鱼清洗干净，去除体表黏液，用剪刀挑开鱼背部皮肤，从皮下剪取2份~3份黄豆粒将玻片置于生物显微镜(放大倍数4×10或10×10)下观察有无华支睾吸虫囊蚴。3取样品100g置于1L烧杯中，加入1L胃蛋白酶消化液(见附录B的B.1),搅拌均匀，放入磁力搅显微镜下观察到符合附录A中图A.1特征的华支睾在载玻片中央滴加生理盐水或清水1滴～2滴，用干净竹签挑取少量粪便样品与水滴充分调和，剔测的粪便应该是新鲜的粪便，如果不能立即检测，可先置于4℃环境。每份标本应涂片三张，在生物显微镜下仔细查找虫卵，并将三张涂片全显微镜下观察到符合附录A中图A.2特征的华支睾取1g～2g新鲜粪便，将一块尼龙绢覆盖于粪便样本上，用塑料刮片轻刮尼龙绢，将刮取的粪便置便上，用载玻片轻压，使粪便均匀展开至玻璃纸边缘，至粪膜变透明，透明时间不宜超过2h。4摇匀后静置3min～5min,再加入乙醚2mL,塞紧橡皮塞，摇匀，1000r/min～1500r/min离心3min～5min。管内分为四层，即从上至下分别为乙醚、粪便层、盐酸及细粪渣和虫卵沉淀物，弃去上层，仅保6.2.2ExTaq酶：5U/μL。6.2.4MgCl₂:25mmol/6.2.5电泳缓冲液：1×TAE缓冲液(见附录B.2)。6.2.7电泳加样缓冲液(见附录B.3)。56.2.10阳性对照：选择经验证的华支睾吸虫囊蚴或虫卵DNA,作为阳性对照。6.2.11阴性对照：选择未感染华支睾吸虫的鱼肉样本或动物粪便DNA或蒸馏水，作为阴性对照。根据华支睾吸虫核糖体DNA参考序列设计PCR扩增特异性引物(参考序列见附录C),PCR反应用上、下游引物序列见附录D中D.1。6.5PCR反应体系加样缓冲液混匀后加入一个加样孔。每次电泳同时设DNA分子质量标准、阴性对照和阳性对照，用凝6(规范性)华支睾吸虫形态学方法结果判定示意图华支睾吸虫囊蚴镜下形态判定示意图见图A.1,虫卵形态判定示意图见图A.2。华支睾吸虫囊蚴一般呈椭圆形或卵圆形，平均大小为0.15mm～0.17mm×0.13mm～0.15mm,囊壁有两层，透明，外壁较厚，约3μm～4μm,内壁较薄，囊内有蜷曲活动的虫体，口吸盘和腹吸盘大小相近，排泄囊呈黑色团状。注意鉴别诊断华支睾吸虫囊蚴与东方次睾吸虫囊蚴：东方次睾吸虫囊蚴与华支睾吸虫囊蚴大小差异不明显，囊壁较华支睾吸虫囊蚴囊壁厚，呈双层结构。华支睾吸虫虫卵呈黄褐色，形似芝麻，大小为27μm～35μm×12μm～20μm前端较窄，有小盖和肩峰。后端钝圆，尾部有小疣。图A.1华支睾吸虫囊蚴与东方次睾吸虫囊蚴形态示意图小盖肩峰小疣图A.2华支睾吸虫虫卵形态示意图7(资料性)B.1胃蛋白酶消化液盐酸溶液(36%)10mL消化液现用现配，用前预热至37℃。Na₂EDTA·2H₂O用800mL灭菌去离子水溶解，充分混匀后用灭菌去离子水补齐至1000mL,常温保存备用。溴酚蓝丙三醇(甘油)8(资料性)注：下划线为引物序列。9(资料性)引物序列(5′→3')预期片段大小/bp上游引物F1下游引物R1注：上