冯了性回春散鉴中钩藤薄层色谱鉴别方法的研究

冯了性回春散鉴中钩藤薄层色谱鉴别方法的研究

目录中文摘要1英文摘要1前言21实验材料31.1试药31.2仪器42实验方法42.1试剂的制备42.2供试品的制备…42.3对照品的制备…………...42.4空白对照液的制备…52.5鉴别实验…53实验结果…64小结与讨论…7参考文献8致谢10-10-中文摘要目的：建立一种更优于中华人民共和国卫生部药品标准（简称“部颁标准”）的冯了性回春散鉴别项下钩藤的薄层色谱鉴别的方法，简化提取流程，选择更优的显色剂，使结果更明显，节省时间，降低鉴别成本，提高鉴别效率。方法：按部颁标准方法及改进法分别对回春散中钩藤药材进行薄层色谱鉴别试验。结果：本文中回春散钩藤药材鉴别的改进方法操作简便、色谱斑点显色清晰、分离效果好。回春散提取的供试品色谱中，在与钩藤药材对照品色谱相应的位置均有相同的橘红色斑点，空白对照无斑点显现。结论：比较部颁标准方法与改进方法实验结果，回春散中钩藤药材鉴别的改进方法具有良好的专属性，重现性,更具有可行性，可用于回春散中钩藤药材的薄层色谱鉴别。从色谱图直观分析，回春散提取的供试品和钩藤药材提取的对照品有共同的橘红色斑点，本研究内容为回春散中钩藤药材的薄层色谱指纹图谱分析奠定了基础，为部颁标准改进以及钩藤有效成分的提取的进一步研究提供了参考。【关键词】钩藤；回春散；薄层色谱；提取工艺

ABSTRACTObject:ToestablishanextractionmethodofUncariaundertheidentificationitemoffenglixinghuichunpowder,whichisbetterthanthedrugstandardissuedbytheMinistryofhealthofthepeople'sRepublicofChina(hereinafterreferredtoasthe"ministerialstandard"),simplifytheextractionprocess,savetime,reducetheidentificationcostandimprovetheidentificationefficiency.Methods:Results:theimprovedmethodofidentificationofUncariainHuichunpowderissimpleandconvenient,thecolorofchromatographicspotsisclear,andtheseparationeffectisgood.InthechromatogramofthetestsampleextractedfromHuichunpowder,therearethesameorangespotsatthecorrespondingpositionsofthechromatogramofthecontrolsampleofuncaria,andtheblankcontrolhasnospots.Results:Inthispaper,theimprovedmethodofidentificationofUncariainHuichunpowderissimpleandeasytooperate,thecolorofchromatographicspotsisclear,andtheseparationeffectisgood.InthechromatogramofthetestsampleextractedfromHuichunpowder,therewerethesameorangespotsatthecorrespondingpositionsofthechromatogramofthecontrolsampleofuncaria,andtheblankcontrolhadnospots.Conclusion:ComparedwiththeexperimentalresultsofthestandardmethodandtheimprovedmethodissuedbytheMinistry,theimprovedmethodforidentificationofUncariainHuichunpowderhasgoodspecificity,reproducibilityandfeasibility.ItcanbeusedforidentificationofUncariainHuichunpowderbyTLC.Fromthedirectanalysisofchromatogram,thetestsampleextractedfromHuichunpowderandthecontrolsampleextractedfromUncariahavethesameorangeredspots.Thisstudylaidthefoundationfortheanalysisofthin-layerchromatogramfingerprintofUncariainHuichunpowder,andprovidedreferencefortheimprovementofministerialstandardandthefurtherstudyoftheextractionofeffectivecomponentsofUncaria.【Keywords】Uncaria;Huichunpowder;TLC;Extractionprocess

冯了性回春散鉴中钩藤薄层色谱鉴别方法的研究

回春散是由国药集团冯了性（佛山）药业有限公司研制生产的纯中药制剂，主要由钩藤等33种药材组成，其中钩藤为主要药材，钩藤为茜草科植物钩藤的干燥带钩茎枝，是中医儿科与现代治疗高血压方剂的常用药材。入药的钩藤一般采用带钩的茎枝，其味甘性微寒，归肝、心包经，功效为熄风定惊、清热平肝，一般可用于治疗头痛眩晕、感冒夹惊、惊痫抽搐、高血压症、妊娠子痫等[1]。钩藤属植物的种类繁多，但2015版《中华人民共和国药典》所收录的主要有钩藤、大叶钩藤、毛钩藤、华钩藤或无柄果钩藤5种种质[2]。近些年的研究表明，钩藤中的主要化学成分包括生物碱类、三萜类、黄酮类、有机酸、酚类、挥发油类等物质[3]。钩藤中含有大量生物碱，钩藤碱和异钩藤碱为其含量较高的生物碱，也是其主要的活性成分[4]。根据现有的文献记载，钩藤总生物碱的提取工艺主要是从2个角度来考虑：其一是选择不同的提取溶剂，其二是选择不同的提取方法[5]。钩藤碱纯化合物外观为白色状结晶（甲醇），分子式表示为Ｃ２２Ｈ２８Ｎ２Ｏ４，分子量为384.46，熔点为216℃，易溶的有机溶剂有氯仿、丙酮、乙醇、苯，微溶于乙醚和乙酸乙酯，几乎不溶于石油醚[6]。异钩藤碱为钩藤碱的立体异构体，外观为白色粒状结晶，熔点为143.5～144.0℃，可溶于氯仿、丙酮、乙醇、乙醚，难溶于正己烷、石油醚[7]。钩藤生物碱的提取工艺中，有机溶剂常用的有：甲醇、氯仿、甲苯、乙酸乙酯、乙醚、石油醚与乙酸乙酯混合溶剂（5∶3）、乙醇和乙酸乙酯－苯等。仲耘等[8]对钩藤总生物碱的提取运用了6种不同有机溶剂进行比较试验，结果表明氯仿为钩藤总生物碱的最佳溶剂。钩藤的提取方法根据所选溶剂及相关处理可分为4种：乙醇提取法、碱化醇提法、碱化苯提法、碱化醚提法，其测定方法常用有3种：毛细管电泳法[9]、色谱法、酸性染料比色法[10]。王瑞俭等[11]对钩藤碱的提取工艺进行了研究，对比分析了乙醇提取法、碱化醚提法、碱化苯提法以及碱化醇提法４种提取方法，其研究发现原料经碱化后用乙醚或苯提取的效率高，用乙醇提取的方法不甚可取。虽然氯仿、乙醚作为提取溶剂时是最佳的有机溶剂，但是氯仿和乙醚为非极性溶剂，毒性大且不安全，反而，在这４种提取方法的乙醇提取法中，其以乙醇具易回收、无毒性、安全、经济等优点，广受大众的欢迎。常规生产制剂中提取钩藤有效成分的方法主要有两种，水煮浓缩法和70％～80％的乙醇提取法[12]。李晓云等[13]提取钩藤中的生物碱则采用乙醇回流提取法，为优化钩藤中钩藤碱的乙醇提取工艺，同时进行正交实验，考察不同工艺条件下总生物碱的提取率，实验结果表明，该提取方法具有许多优点，其操作简单、稳定性好、产率高、生产成本低等，可见工业生产较为适用。根据以上文献参考，本文将以此为基础,对钩藤中钩藤碱的提取方法进行改进，采用碱化醇提法，把加热回流改为碱化后乙醇超声提取，过滤，所得滤液经蒸干，残渣用三氯甲烷溶解作供试品，此工艺可为冯了性回春散鉴别的改善优化以及钩藤药材的钩藤碱提取工艺的进一步研究提供参考。1实验材料1.1试药样品：冯了性生产的回春散（批号：190010、190012、190014）；对照品：冯了性采购的钩藤原药材（批号：F1180402）；阴性：冯了性采购的药材；无水乙醇（来源：西陇科学股份有限公司，生产批号为：190305）；纯化水（来源：冯了姓）；浓氨水（来源：西陇科学股份有限公司，生产批号为：180710）；三氯甲烷（来源：西陇科学股份有限公司，生产批号批号：190314），盐酸（来源：西陇科学股份有限公司）。1.2仪器锥形瓶、玻璃杯、4ml移液管、50ml量筒、蒸发皿、漏斗、球形冷凝管、塑料2ml样品瓶、双圈定性滤纸（来源：通用电气生物科技杭州有限公司）；PH试纸；玻璃点样毛细管（来源：华西医科大学仪器厂）；超声波清洗器（来源：上海科导超声仪器有限公司，生产型号：SK8210HP）；电热恒温水浴锅（来源：北京市永光明医疗仪器厂，仪器型号规格：D2K-W-S-6）；电子天平（来源：广州托利称重设备有限公司，仪器型号：梅特勒-ML204）；电热套（来源：北京科华实验仪器有限公司）；打粉机；筛子。2实验方法2.1试剂的制备2.1.11％盐酸溶液[2]：取盐酸1ml加水稀释至100ml，使盐酸含量为1％。2.1.280％乙醇溶液[2]：取乙醇80ml加水稀释至100ml，使乙醇含量为80％。2.1.3稀碘化铋钾试液[2]：取碱式硝酸铋0.85g加冰乙酸10ml和水40ml溶解，溶解完全后取5ml加5ml碘化钾溶液（4→10）和20ml冰乙酸，用水稀释定容至100ml既得。含0.5％氢氧化钠的硅胶G板（自制）：60g硅胶G、0.5％羧甲基纤维素钠溶液180ml、0.9g氢氧化钠。先用一小部分羧甲基纤维素钠溶液溶解氢氧化钠，再加入硅胶G及剩余羧甲基纤维素钠溶液混合均匀，铺在玻璃板上晾干既得。2.2供试品的制备2.2.1部颁标准方法提取剪开回春散包装分别取三批回春散样品8g于锥形瓶中，加入100ml80％乙醇，放上电热套上加热回流30min，滤过，取滤液于蒸发皿中，放上水浴锅蒸干，残渣用10ml1％盐酸溶液溶解，边用玻璃棒搅拌边逐滴加入浓氨水调节PH至10，溶液倒入分液漏斗，用10ml三氯甲烷震荡萃取，重复萃取两次，合并三氯甲烷液，蒸干，残渣用1ml三氯甲烷溶解作供试品。2.2.2改进方法提取剪开回春散包装分别取三批回春散样品5g于三锥形瓶中，加入30ml80％乙醇后用氨水调节PH至10，塞好塞子放入超声波清洗器中超声40min，取出，过滤弃去滤渣，取滤液于锥形瓶中，放上电热恒温水浴锅蒸干，加入10ml三氯甲烷超声溶解10min，取出、滤过，滤液浓缩至1ml作为供试品。2.3对照品的制备2.3.1部颁标准方法取钩藤对照药材剪碎，打粉，过8号筛，取2.5克粉末于锥形瓶中，以下提取操作同2.2.1项下供试品制备方法.2.3.2改进方法取钩藤对照药材剪碎，打粉，过8号筛，取2.5克粉末于锥形瓶中，以下提取操作同2.2.2项下供试品制备方法。2.4空白对照液的制备根据国家食品药品监督管理局国家药品标准中回春散的配方，将人工麝香、人工牛黄等除钩藤外的32种药材打粉、过筛、混匀。取5g于锥形瓶中，以下提取操作同2.2.1项下供试品制备方法。2.5鉴别实验2.5.1部颁标准方法取含0.5％氢氧化钠的硅胶G板一块放置烘箱中活化半小时，取出冷却，在平行于板一端1cm处，按适当的距离，依次用铅笔画两个点，依次为1,2，取部颁标准提取方法提取的190010批次回春散供试品溶液点样于点1上，取部颁标准方法提取的钩藤对照药材对照品溶液点样于点2上，各15μ1。将板放入展开缸中，以三氯甲烷-丙酮（6：1）为展开剂饱和30min，饱和好后开始展开，展开到板的四分之三处时便可取出，晾干，以稀碘化铋钾溶液为显色剂，轻轻喷一层在展开好的玻璃板上，置日光下检视，如图1。取部颁标准方法提取的190012批次和190014批次回春散供试品按以上方法点样、展开、取出、晾干，喷以稀碘化必钾溶液，置日光下检视。如图2、图3.2.5.2改进方法取含0.5％氢氧化钠的硅胶G板一块放置烘箱中活化半小时，取出冷却，在平行于板一端1cm处，按适当的距离，依次用铅笔画三个点，依次为1,2,3，取改进方法提取的190010批次回春散供试品溶液点样于点1上，取改进方法提取的钩藤对照药材对照品溶液点样于点2上，取空白对照品溶液点样于点3上，各2μl。将板放于含三氯甲烷-丙酮（6：1）为展开剂的展开缸中饱和30min，饱和好后开始展开，展开到板的四分之三处取出、晾干，喷以稀碘化必钾溶液，置日光下检视。如图4。如图4。取改进方法提取的190012批次和190014批次回春散供试品按以上方法点样、展开、取出、晾干，喷以稀碘化必钾溶液，置日光下检视。如图5、图6。3实验结果3.1部颁方法薄层色谱鉴别结果由3批次钩藤的薄层色谱鉴别结果可见，供试品色谱中，在于对照品色谱相应的位置上未能完全显示相同颜色的主斑点，结果薄层图谱所显示的斑点模糊，有拖尾现象，分离度不好，见图1、2、3。图1从左到右依次为图2从左到右依次为图3从左到又依次为190010样品、钩藤对照品190012样品、钩藤对照品190014样品、钩藤对照品3.2改进方法薄层色谱鉴别结果由3批次钩藤的薄层色谱鉴别结果可见，供试品色谱中，在于对照品色谱相应的位置上，在日光下都能显示相同的两个橘红色斑点，而阴性对照液无相应斑点。改进方法斑点分离效果较好，斑点也比较清晰圆整，Rf值较适中，薄层色谱所提供的信息也更加清晰可辩。见图4、5、6。图4从左到右依次为图5从左到右依次为图6从左到又依次为190010样品、钩藤对照品、190012样品、钩藤对照品、190014样品、钩藤对照品、空白对照品空白对照品空白对照品4小结与讨论4.1冯了性药业有限公司的回春散由三十三味中药组成，成分复杂,对比了部颁标准方法的乙醇加热回流，本文改进方法根据钩藤中生物碱的溶解特性，选用碱化醇提取法更加简便。本文改进方法相比部颁方法步骤更简便，结果显示斑点集中，层次清晰,该方法重现性好，稳定可靠，具有可操作性。4.2参照有关文献，钩藤碱的热稳定性较差,在81℃时即有部分分解,其酯键受热易分解,并在极性条件下易转化为异钩藤碱,转化率在60%以上[14]。因此在对比部颁方法和相关文献的提取方法之后，最后样品制备中不采用热回流的方法，而选用碱化醇超声方法提取，减少钩藤碱的受热分解。4.3钩藤主要含生物碱，因此采用生物碱专用显色剂碘化秘钾显色，效果较好。部颁方法中采用的显色剂为碘化铋钾溶液，背景色较深不便观察，因此改进方法采用稀碘化铋钾溶液，显色效果好。

参考文献[1]江芳，郭娜，童文琴，等.钩藤属植物研究进展[J].海峡药学，2017，29(04)：5-13.[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典2015版（一部）[S].北京:中国医药科技出版社,2015.240.[3]ZhangJG,GengCA,HuangXY,etal.ChemicalandbiologicalcomparisonofdifferentofUncariarhynchophylla(Gou-Teng)[J].EuropeanJoumalofMassSpectrometry(Chichester,England),2017,23(1):11-21.[4]刘碧崇，王强.钩藤活性成分研究进展[J].成都大学学报(自然科学版)，2018，37(03)：269-272.[5]王盟，刘卫.钩藤总生物碱的研究进展[J].实用医药杂志，2008，25（03）：360-362.[6]国家医药管理局中草药情报中心.植物药有效成分手册[M].北京：人民卫生出版社，1986．892.[7]刘佳，富志军.钩藤的研究概况[J].海峡药学，2006，18（05）：90-94.[8]仲耘，冯瑞