福州市霍乱弧菌耐药性研究

前言霍乱弧菌（Vibriocholerae）属于弧菌属，为革兰氏阴性菌，菌体短小呈逗点状，有单鞭毛与菌毛，部分有荚膜[1]。根据菌体脂多糖抗原的不同，霍乱弧菌可分为200多种血清型，但只有O1群霍乱弧菌和O139群霍乱弧菌可引起大流行[3,4]，其中O1群霍乱弧菌包括古典生物型和埃尔托（EL-Tor）生物型。霍乱是由霍乱弧菌引起的急性胃肠道疾病，具有发病急、传染性强、流行范围广等特点[5]，主要症状是剧烈的呕吐和腹泻，这将使得机体失去大量水和电解质，导致水和电解质的紊乱，内环境稳态失衡和循环衰竭，其中严重的话可致昏迷或者死亡[6,7]，霍乱是目前我国所规定的甲类传染病之一，也是国际检疫传染病中最严重的一种。自1817年，全球范围一共发生了7次霍乱世界性大流行，给全世界造成及其严重的生命财产损失，目前我们正处在第7次世界性大流行。近年来抗生素等药品的滥用，导致霍乱弧菌流行菌型的变迁以及耐药和多重耐药菌株不断出现[8-10]，使现有部分抗菌药物的临床效果降低甚至无效，给霍乱的防治工作造成一定的困难[11]。福州位于中国\t"/item/%E7%A6%8F%E5%B7%9E/_blank"东南地区，在\t"/item/%E7%A6%8F%E5%B7%9E/_blank"闽江下游，是福建省的省会城市，是中国\t"/item/%E7%A6%8F%E5%B7%9E/_blank"东南\t"/item/%E7%A6%8F%E5%B7%9E/_blank"沿海的重要都市，也是\t"/item/%E7%A6%8F%E5%B7%9E/_blank"海上丝绸之路的门户，拥有发达的经济、繁盛的文化和便利的交通，所以外来人口众多。福州居民餐桌上必不可少的食物便是海产品，沿海地区居民喜欢吃生海产品或腌制半生海产品的饮食习惯，而且外界环境中仍旧在霍乱弧菌的污染，农村地区保留着红白喜事大摆露天宴席的习惯，所以霍乱仍对福州的经济，社会安定和居民人身健康具有一定的影响[12]。为了解福州市场上海产品中霍乱弧菌的污染情况，以及霍乱弧菌的菌株类型、血清型和耐药性，并为福州市霍乱防控提供科学依据，所以，我们针对来自福州市海产品的40株O1群霍乱弧菌进行了血清型实验和耐药性变迁等方面研究。传统的霍乱弧菌检测一般是采用碱性蛋白胨培养液进行增菌培养，再选用具有选择性的硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖（TCBS）琼脂培养分离出菌株[1]，最后进行检测，这些实验方法有很高的灵敏性和特异性，都是霍乱弧菌检测的重要方法。环介导等温扩增（LAMP）、霍乱红试验、V-P实验、实时荧光定量PCR等均是检测霍乱弧菌的快速方法。而且分子生物学领域新发展的一项技术采用PCR检测霍乱弧菌，具有灵敏度高，快捷方便等特点[13]。本研究采用常规培养分离和血清型、生化鉴定以及实时荧光PCR方法检测菌株，并采用全自动微生物鉴定仪对霍乱弧菌进行耐药性分析。1材料与方法1.1.2主要试剂表1实验中使用的主要试剂试剂名称生产厂家碱性蛋白胨水北京陆桥科技有限公司TCBS琼脂北京陆桥科技有限公司霍乱弧菌检测试剂(PCR)深圳市生科源技术有限公司弧菌显色培养基(VA)北京陆桥科技有限公司霍乱弧菌诊断血清宁波天润生物药业有限公司霍乱弧菌生化鉴定试剂北京陆桥科技有限公司（注：所有试剂均在保质期内按照说明书使用）1.1.3主要仪器表2实验中使用的主要仪器仪器名称型号厂家全自动高压灭菌器HV-110HIRAYAMA生物安全柜SG—403美国Baker迷你离心机SpectrafcgeminiLabnet离心机台式高速TCL—16G上海医用分析仪器厂金属浴SB—2台湾电热恒温培养箱DHP—9162上海恒科技有限公司荧光定量PCR仪CXF96美国伯乐公司全自动微生物鉴定仪ViTackⅡ（法国生物梅里埃公司）（注：所有仪器均按照说明书使用）2结果2.1血清凝集实验结果40株菌株进行血清凝集试验，结果呈阳性，全部发生凝集现象，并且在生理盐水对照组中没有出现自凝现象，所以可以判定为霍乱弧菌菌株。2.2实时荧光PCR法检测结果经阴性与阳性对照，40株菌株检测结果均为阳性，Ct值≤30，线性呈标准“S”型或有明显指数增长期。故可以得出结论40株菌株均为霍乱弧菌。总结：40株菌株均可确认为霍乱弧菌，可进行耐药性分析。2.3耐药性检测结果从检测结果来看，40株菌株对大多数抗生素表现为敏感及中敏，但是或多或少都出现了耐药菌株。其中对头孢曲松、头孢替坦、头孢他啶、头孢吡肟、安曲南、亚胺培南、庆大霉素、环丙沙星、左氧氟沙星敏感及中敏率为93%-98%，对氨苄青霉素、哌拉西林、头孢唑林、呋喃妥英、妥布霉素、复方新诺明敏感及中敏率为80-88%，对阿米卡星的敏感及中敏率为78%，对氨苄西林的敏感及中敏率为65%。如表3：表340株霍乱弧菌菌株的耐药性研究结果抗生素菌株数（株）抗生素菌株数（株）敏感中敏耐药敏感中敏耐药ESBL安曲南2893氨苄西林161014亚胺培南14233氨苄青霉素20128阿米卡星20119哌拉西林3127庆大霉素3262头孢唑林15196妥布霉素3055头孢替坦3721环丙沙星3712头孢他啶3622左氧氟沙星3721头孢曲松3721呋喃妥英3415头孢吡肟3712复方新诺明3415厄他培南3讨论3.1福州市霍乱弧菌耐药性研究从耐药性检测的结果来看，菌株所有抗生素都出现了不同程度的耐药性菌株，对头孢吡肟、头孢曲松、亚胺培南、头孢他啶、庆大霉素、安曲南、左氧氟沙星、头孢替坦、环丙沙星的耐药率较低，为2%-8%，对氨苄青霉素、哌拉西林、头孢唑林、呋喃妥英、妥布霉素、复方新诺明耐药率为10%-20%，其中耐药性最强的是氨苄西林，高达35%，其次为阿米卡星，40株菌株对头孢唑啉和亚胺培南表现为中敏的菌株占了50%左右。部分菌株出现多重耐药现象，最多耐药高达8种，这对霍乱的防控工作带来了巨大的影响。在霍乱流行期间，我们应该加强对霍乱弧菌的耐药性的检测和研究分析，提供霍乱弧菌耐药性的最新数据，分析霍乱弧菌耐药性的变迁,预测霍乱弧菌耐药性的发展，为霍乱的预防和治疗工作提供强有力的依据。从当前研究的实验数据来看，头孢曲松、左氧氟沙星等药物是依旧是预防和治疗霍乱的首选药物，但是我们仍然应该控制药物的使用，杜绝药物滥用，以防霍乱弧菌耐药性程度加重。3.2霍乱防控工作霍乱主要是经粪-口传染的肠道传染病，通过水、食物和密切接触等途径传播[15]。霍乱的防治工作必须坚持贯彻“预防为主”的方针，采用第一级预防为主，深入开展健康教育，普及霍乱相关防治知识，充分利用现有资源，发挥各级疾病预防治疗机构的作用，开展“三管一灭”综合性措施，从源头减少和控制霍乱发生和流行的危险因素[16]。3.2.1对传染源的管理在各级医疗机构应该设置专门的肠道门诊，用于接诊腹泻的病人，根据其症状表现等可以及时发现疑似病例并进行确诊。做到“早发现、早报告、早诊断、早隔离、早治疗”，这是迅速控制疫情的首要环节和重要手段。再对病人进行流行病学调查，对于密切接触者进行医学观察，视情况给予相应措施。3.2.2对食物和饮用水的管理霍乱主要是经粪-口传染的肠道传染病，通过水、食物和密切接触等途径传播[15]。根据《中华人民共和国食品安全法》及其相关法规条例，严格加强对食品和饮用水安全的监管，特别是对食堂，农贸市场和饭店等食品经营单位的经常性检查，在每年的夏季霍乱病例高发期应该额外加强对海产品等食物的监测。同时开发食品追踪溯源技术，建立相关制度，保证食品原料、运输渠道、加工和流通环节的监督管理。饮食从业人员应该遵循相关规定，持健康证上岗，相关机构有条件可以对高发区食品从业人员进行采便检查。确保饮用水安全，保证水源安全，另外水厂应该严格按照操作要求对饮用水进行消毒等处理和运输，防止二次污染。相关机构应该按期对饮水水质开展调查和监测。疫苗接种是预防霍乱的有效手段，目前已经有口服疫苗，可针对重点人群使用。再则应该完善规范疫情的报告和管理，做到“早发现、早报告、早诊断、早隔离、早处理”，这是迅速控制疫情的首要环节和重要手段。3.2.3对疫情的监测完备的监测体系是掌握疫情的分布、流行时的动态变化和早期发现疫情的重要保障，是应对疫情采取措施时候的主要依据。应该进一步的完善和加强现有的监测体系。而且在目前许多研究都认为O139霍乱弧菌将会引起霍乱的第八次世界性大流行的情况下，我们更应该投入更多的人力物力，不止对国内，也应该关注国外的流行动态和相关研究。在经济全球化的浪潮下，中国不断地扩大对外开放，国际分工合作进一步加深，旅游、运输等带动了大量的人口流动，2019年新型冠状病毒急性呼吸道疾病引起的世界性大流行，已经表现出前所未有的传播速度的和破坏力，血淋淋的现实为世界各国在疾控方面敲响了警钟。3.2.4加强卫生宣传，进行健康教育健康教育属于一级预防，但是在三级预防中均可以发生作用。我们要对全人群展开广泛的卫生宣传，宣传不良卫生和饮食烹饪习惯的危害，帮助群众养成良好的卫生健康习惯，培养健康的饮食习惯。也应该普及霍乱及其他传染病的相关知识，让大家自觉做好预防工作，从而预防霍乱的发生。3.2.5发生时的相应举措做好样品采集和监测，及时发现传染源和传播途径，做好传染源及其周边的饮用水消毒和粪便处理，教育周围居民减少接触。在检出霍乱弧菌的水体周围如果出现带菌者和病人，要提高注意力，密切观察重点人群和密切接触者，防止出现暴发。在疫情期间，污染水体禁止饮用，禁止捕捞作业，并定期取样检查，直至水体正常。严格管理水（海）产品，一旦出现霍乱弧菌菌株，禁止出售，未出售的按照程序销毁，已经售出的采取追回措施，对接触产品的群众进行观察，早发现早诊断早治疗，并对相关场所进行消毒。3.3展望本研究对福州市海产品中检出的40株霍乱弧菌进行耐药性的检测和分析，菌株对多数药物依旧具有较高的敏感性，但是不容乐观的是，有些菌株已经出现不同程度的耐药，甚至出现多重耐药，这给未来霍乱的防控工作造成一定的困难。在针对霍乱的防控工作中，建议使用头孢曲松、左氧氟沙星，可以较快得取得效果，最好是多种药物配合使用，避免药物滥用加速霍乱弧菌出现新的耐药性的变异。霍乱弧菌是一种容易发生变异的微生物，近年来霍乱弧菌的菌型发生了一些变化，为了阐述霍乱的发生、分布、流行的规律，我们需要充分利用现有的技术条件，以掌握其变化流行趋势，为今后霍乱的防治工作提供科学依据。核心的病原菌分子分型实验室监测网络PuseNet,并且确定了多种细菌的PFGE标准史验方案，实现了不同地区实验室菌株分析和传染病实验室监测的网络化和标准化。PFGE分型技术是目前霍乱流行病学调查中使用最普遍的分子分型方法，在近几年里，一些实验室采用此方法进行流行病学分析，显示了较高的实用价值。4近年各地霍乱弧菌的污染状况霍乱是由Ol群和O139群霍乱弧菌引起的烈性肠道传染病，起病急、传播快、能引起爆发流行。近年来，各地区水体及市场上的海、水产品都存在霍乱弧菌的污染，霍乱弧菌也不断被检出。2013-2017年福建省各级霍乱监测点登记腹泻病人185719人次，检测腹泻病人粪便标本89648份，总检索率为48.27％，共发现6例霍乱病人和5例带菌者。2013-2017年福建省各级霍乱监测点共检测海水产品等食品及水体标本112780份，检出171株O1群和O139群霍乱弧菌，总阳性率为0.16％[11]。2010-2013年湖南省共发生15起霍乱疫情，报告病例28例，发现带菌者13例，常规外环境监测样品142047份，检出霍乱弧菌阳性170份，阳性率为0.12%，其中水产品样62753份，,阳性167份，阳性率为0.24%[12]。2008—2017年，上海市共监测食品、水源等外环境标本224228份，阳性140份，阳性率0.06%，其中水源监测标本813