发酵工艺学原理讲义

H:\精品资料\建筑精品网原稿ok（删除公文）\建筑精品网5未上传百度发酵工艺学原理讲义及思考题烟台大学林剑主讲课程绪论§1-1发酵工艺学的基本概念发酵工业的基本概念微生物学中的发酵的定义:微生物发酵工业的概念:1.发酵工业生产的基本模式讲述生物工业的基本生产模式,引出生物技术、生物工程的概念,讲述两者之间的区别与联系2.发酵工业的分类 酿酒业(啤酒、葡萄酒、白酒……)。 厌氧发酵调味品(酱油、醋)。 酵母工业——自然发酵。氨基酸发酵——典型的代谢控制发酵。 抗菌素发酵——次级代谢控制发酵。 酶制剂工业——具有重要的意义,是工业发展 的基础、科学研究的基础有机酸工业—柠檬酸、葡萄酸、乳酸、琥珀酸等。石油发酵——降低石油熔点(石油脱腊)有机溶剂工业——乙醇、丙醇等好氧发酵维生素发酵——VC、VB2生理活性物质——白介——2 环境工业——废水的生物处理,废弃物的生物降解微生物发酵的基本特征1.微生物发酵过程是一个典型的化工过程由于微生物生理特性决定了微生物在发酵过程中需要稳定的环境、特殊的条件以及以氧作为底物的供给,这些多涉及到化工生产的一下领域:质量的传递——氧的供给、代谢物的排泄等热量的传递——微生物呼吸产热,微生物生长于代谢需要稳定的而严格的温度条件。动量的传递——涉及到搅拌轴功率的计算,她与溶氧、气液混合的关系微生物的反应工程——涉及到微生物的生长动力学模型的建立,产物生成动力学模型的建立。2.微生物发酵过程是一个典型的代谢控制发酵从微生物发酵的历史角度看,最早的微生物发酵是一个自然发酵过程,现代微生物工业一般是指微生物的代谢控制发酵?定义:是指利用生物的、物里的、化学的方法,人为的改变了微生物的生长代谢途径,使之合成、积累、分泌我们所需要的产品的过程。以GA发酵为例,建树微生物代谢控制发酵的意义。3.微生物发酵工业又是一个有别于化工过程的一个工业有以下几个特征:反应条件温和一般由于微生物的生理特性,要求温度为30℃-40℃pH值中性偏酸性——酵母、霉菌、放线菌等,pH值中性偏碱性——细菌的发酵无菌发酵整个反应过程要求无菌:培养基无菌、空气无菌、补料和取样要求无菌操作、某些工程菌,其尾气也要求进行无菌处理。非连续性生产微生物的生理特性决定了发酵过程的非连续性大部分的工业发酵是以间歇操作为基础进行的,当前能够实现连续化生产的是:啤酒的连续化生产……§1-2微生物工业发酵的历史及发展方向微生物工业发酵的历史微生物发酵有着悠久的历史,几千年前的酿造实质上就是一个典型的微生物发酵过程,近几十年的来微生物发酵不但在应用领域上更加广泛,更重要的是建立了许多新的微生物发酵理论体系,诸如:代谢控制发酵、基因工程菌发酵等……微生物发酵的发展能够分为以下几个阶段:微生物发酵工业的发展方向微生物发酵工业有着悠久的历史,在国名经济中占有重要的地位,21世纪又是生物的,体现在哪里?从工业领域看微生物发酵将占据越来越重要的地位,具体的讲:经过生物工程解决能源问题能源问题是全球面临的问题,生物工程如何解决?太阳能淀粉、纤维素酶工程G发酵乙醇能源乙烯(当前已取得突破性进展)生物工程作为桥梁,世界产值已达50亿美元取代部分化工工业许多化工产品的生产由于严重的污染和生产效率问题,而为生物工程取代,例如:乙醇、甘油、乳酸等(3)农业:生物农业、农产品加工等方面(4)医药:2.从产品角度看,应围绕下列领域:(1)酶制剂工业:即是生产工具,又是科学研究的工具和基础(2)新型抗菌素工业和维生素行业(3)氨基酸及多肽发酵(4)生物免疫物质:白介素-2、干扰素、抗肿瘤物质等(5)细胞工程及疫苗3.从科学技术角度看底物基质的转变以葡萄糖为底物的发酵转变为以更为广泛的基质为原料,特别是以废弃物为基质的发酵,废弃物资源化是其发展方向。开发新产品利用现代生物技术为基础,开发新产品,新的产品层出不穷,使得微生物发酵向国民经济的各个角落渗透。微生物发酵向着大型化、自动化、连续化的方向发展。英国帝国化学公司,甲烷菌发酵罐的容积已达到3000m2本课程的内容和任务本课程是生物工程专业本科生的专业基础必修课程,是一门以微生物、生物化学、化工原理等课程为基础,以微生物发酵过程中各种单元操作为主线条,对微生物发酵过程中的基本原理进行阐述的课程。其基本内容如下:发酵生产用菌种及其有关知识 菌种选育包括 菌种保藏生产过程中菌种的扩大培养培养基的制备及灭菌包括:工业发酵用原料的选择与处理培养基的灭菌原理和方法工业灭菌的工程计算发酵机制包括:乙醇、甘油、谷氨酸、柠檬酸、赖氨酸、抗生素等发酵过程及控制包括:温度的变化及控制pH值的变化及控制氧传递动力学泡沫的消长规律及控制思考题:能源问题是全球面临的问题,生物工程将如何解决?写出一遍综述。第二章微生物发酵用菌种及其扩大培养§2-1微生物发酵工业用菌种微生物发酵工业用菌种的特点及要求微生物发酵工业用菌种因不同的发酵对其要求各异,就是同一种产品的发酵生产,其菌种的特点和要求因不同的原料和生产设备的不同也有很大差异,例如:GA的发酵:以淀粉质为原料:要求VH-,以糖蜜为原料:因为糖蜜本身含有非常丰富的VH……可是作为工业微生物发酵使用的菌种,一般有下列特点:1.具有稳定的遗传学特性这对于工业化生产是很重要的,一般工业化生产整个周期很长,在一个发周期中,菌体至少应该增殖一次,在增殖过程中,菌体应该保证原菌的遗传学特征,(尽管菌体生长的环境改变了,压力、基质、溶氧等)2.微生物生长和产物的合成对于基质没有严格的要求换言之,能够广泛的使用各种原料作为生产用的底物,某些微生物对于底物有着严格的要求,对于碳源要求单一,这对于微生物的发酵工业提出了严格的要求,增加了生产成本。3.生长条件易于满足在微生物的工业化生产过程中,某些环境条件很难实现。氧的传递和供给就是一个很难完全满足的条件,特别是对于高粘度、高浓度的发酵体系。对于微生物的生长往往存在一个”临界溶氧浓度”,低于这个溶氧浓度,氧就成了微生物生长的限制性因子,这个溶氧浓度越高,说明菌体生长条件越易满足,从另一种意义上讲,工业化的生产成本就越低。pH值:中性偏酸性,偏碱性,强烈的pH值易改变产物和底物的状态。4.对于细菌,希望具有抗Phage的能力。5.具有较高的各种酶活力,能够在一定的范围内提高生长速率和反应速度,进而能够缩短发酵周期,降低生产成本。6.对于胞外产品,细胞膜具有良好的渗透性,或者细胞膜的渗透性能够调节,细胞不易发生菌体自溶。对于胞内产品,要求菌体易分离和收集,菌体易破碎;对于基因工程菌,一般目的产物存在于包含体内,对于包含体,要求在细胞破碎是不易破碎,而在目的产物的分离提出时,则易破碎。二微生物发酵工业用菌种的种类野生型从菌种的遗传学特征上能够把菌种分为:培养:营养缺陷型……从微生物分类学的角度,分为细菌类:短杆菌:GA,Gln,lys……枯草芽孢杆菌:淀粉酶(BF7658)、碱性蛋白酶等地衣芽孢杆菌:HASS(耐高温α-淀粉酶)α-Amylase苏云金芽孢杆菌:BT生物农药……梭状芽孢杆菌:丙酮、丁酸等的发酵酵母菌啤酒酵母:酿酒酵母、辅酶类物质的发酵酒精酵母:汉逊酵母:食品工业,用于乙酸乙酯的发酵假丝酵母:scp生产,石油发酵3.霉菌黑曲霉:柠檬酸工业、酿酒业(UV-11,UV-48)、酶制剂工业(糖化酶)黄曲霉:酱油生产(3042),面酱青霉菌:青霉素的生产红曲霉:红曲制造,用于南方红曲酒(女儿红)的生产;使用红色色素的生产;豆腐乳的生产等赤霉菌:赤霉素的生产,是一种植物生长激素4.放线菌:各种抗生素,链、土、庆大等§2-2微生物用菌种的扩大培养菌种扩大培养的目的1.提供大量而新鲜的、具有较高活力的菌种。目的就是:a、缩短发酵周期降低能耗、减少染菌的机会(空气过滤设备有效时间是有限的)b、为了使培养菌在数量上取得绝正确优势,抑制杂菌的生长。从对数残留定律上看,任何灭菌过程都不能够做到绝对无菌,抑制杂菌生长除了严格环境以外,在数量上让培养菌占绝对优势也是一种方法,往往是一种行之有效的方法。例如:啤酒的发酵……2.让菌种从固试管、液体试管……,逐步适应,例如:啤酒发酵3.菌种经过扩大培养,能够提高生产的成功率,减少”倒罐现象。许多生产菌种往往都是”溶原性”的?经过连续的扩大培养,每一级都要进行严格的检查,对于不合格的严禁使用,无疑增加了生产的可靠性。二、扩大培养的方法一般有两种方法:固体法:用于酿造业(酱油、白酒等),也是源于酿造业,有霉菌的纯培养,也有混合培养如:大曲液体法:液体深层培养,适合于众多发酵行业液体扩培流程固体试管三角瓶大三角瓶一级种子二级种子三级种子发酵罐固体扩培流程固体试管三角瓶种曲麸曲(机械通风制曲)两者的优缺点比较:固体培养(1)酶活力高。(因为菌丝体密度大)(2)生产过程中无菌程度要求不是很严格。(3)对于固体培养,一般见于固体发酵,由于产物浓度大,易于分离,能够有效的降低产品分离成本。缺点:(1)生产劳动强度较大,占地面积大,不宜自动化生产。(2)周期长。(3)培养过程中环境条件控制较难。(4)生产过程中,由于无菌程度较低,其菌种菌类不纯。液体培养(1)生产效率高,便于自动化管理。(2)生产过程中温度、溶氧、pH值等参数能够实现全面控制。(3)一般生产液体种子,整个生产周期较短。缺点:(1)无菌程度要求高,相对生产设备投资较大。(2)对于某些种类的发酵,液体培养因投资大、生产密度大而难以实现。现代生物技术的发展是以基因工程菌为主导的微生物发酵领域,其菌种的培养要求无菌程度高,而且培养过程中的条件要求也非常严格(否则易发生变异导致质粒丢失),从这种意义上讲,固体菌种的制备是难以实现的,因此,应以液体培养为主导方式。应该指出的是:随着生物工程与技术的发展,许多传统的应用微生物工业的菌种已形成了产业化。例如:酒精的生产原生产工艺流程为:……其中以酵母为线条的生产工艺为:以霉菌为线条的生产工艺为:现在:(1)酵母使用粉末酵母鲜压榨酵母固定化酵母细胞(2)霉菌则由各种液化、糖化酶取代三、菌种扩大培养的条件:菌种扩大培养条件因不同的菌种差异是非常大的,一般是与菌种的性质有关的,也与后续的发酵工艺有关。可是,与发酵工艺却有着很大的差别。1.培养基:种子培养基因不同的微生物种类差别是很大的,同一种微生物因不同的扩大培养过程(一级、二级)其培养基往往也有较大差异。例如:啤酒酵母扩大培养用的培养基组成如下:固体试管液体试管三角瓶大三角(无酒花)(有酒花)(有酒花)汉逊罐一般,对于种子用的培养基,摇瓶与种子罐用的培养基也不相同,摇瓶要求培养基用的原材料精细,碳源浓度较低而且是用微生物较易利用的碳源;对于种子罐用培养基,要求使用接近大生产用的原材料,氮源浓度较高,有利于菌体的增殖。例如:HASS(高温淀粉酶)三角瓶用碳源:葡萄糖+乳糖3m3种子罐:液化淀粉2.温度种子扩大培养的温度,从试管到三角瓶到种子罐,其温度也应逐步调整,最后接近大生产的温度,目的在于使菌种逐渐适应。例如:啤酒酵母扩大培养固体液体三角瓶大三角瓶汉逊罐28℃25℃20℃15℃10-15℃需要指出的是:(1)许多微生物其最适生长温度与最适发酵温度往往有差异的,例如:谷氨酸发酵,谷氨酸产生菌的最适合生长温度为:30℃,而产物合成温度为32-34℃(2)种子扩大培养的温度的选择,应该考虑的是菌体的快速增殖上,一方面能够缩短周期,另一方面有利于抑制其它杂菌的生长。3.氧的供给菌种扩大培养的目的就是提供大量的强壮的菌体,因此在扩培过程要求菌体增殖速度越快越好,增殖期消耗的底物葡萄糖越少越好,从这个意义上讲,扩培过程中应提供足够的氧气,无论是厌氧发酵还是好氧发酵。足够的溶氧取决于:搅拌转速、通气量、搅拌轴功率等,后述。4.pH值菌种扩大培养的pH值很重要,直接影响到菌体的正常生长,需要注意以下两点:(1)扩培选择的pH值是菌体的最适生长pH值,往往与发酵最适pH值不同。(2)培养基灭菌后,一般其pH值要下降0.5——1.0个单位,因此,……(三角瓶灭菌后,不能够调整pH值,不宜无菌操作)思考题:1.比较固体培养与液体培养的优缺点。2.说明菌种扩大培养的条件。3.菌种扩大培养的目的和意义是什么?4.工业生产用菌种的基本要求有什么?第三章微生物用培养基及灭菌本章的主要内容:1.培养基的制备2.starch的水解3.培养基的灭菌§3-1培养基的制备及要求一、培养基用原材料及要求微生物发酵领域其本质,也能够理解为物质形式的转化过程,就是利用微生物生长所需的底物转化成特定的产物,在这个过程中,有两个问题是工业化需要解决的:(1)产物的社会效益,(2)物质转变过程中产生的经济效益,即:低价值的原材料、低能耗等对于特定的已知产物,在选择培养基原料时,则应注意以下几个原则:1、培养基原材料的要求(1)价格低廉,易得到(价格低,但不一定易得到,例如:地瓜干)(2)对微生物的生长繁殖和代谢无抑制作用的物质(3)微生物的代谢产物无有害物质。2、培养基用原材料的种类碳源starch及其水解糖液含有starch及其水解产物的废弃物:味精废水、粉丝生产废水等化工石油产品:醋酸、甲醇、乙醇、甲烷等氨水、尿素(有脲酶的微生物),以流加形式使用(NH4)2SO4、NH4NO3、NH4CL等 氮源豆粕、玉米浆、酵母粉、酵母浸出物、鱼粉、菌体蛋白?、玉米蛋白粉等二、培养基的种类固体发酵生产培养基厌氧发酵需氧发酵按用途可分为:种子培养基摇瓶培养基(优化工艺……)检查培养基:HASS发酵用的检查培养基:营养琼脂0.5%—0.55%、Sarch2%,Glucose0.5%平板培养,根据透明圈的大小本章涉及到的培养基为:生产使用的培养基三、培养基的制备1.培养基配制的原则培养基制备是发酵成功与否的第一个要点,制备一个完整而科学的培养基是很重要的,也是非常艰巨的任务。一般制备培养基需要考虑以下几个方面的问题:(1)合适的C/N,不同的微生物、同一种微生物不同的菌株,其对培养基中的C/N要求是不一样的,同一菌株在不同的发酵阶段,其对C/N的要求也不一样。例如:黄源胶(XanthanGum发酵):前期,较低的C/N,目的是强化菌体的生长和增殖:可是,在黄源胶的生物合成期,则需要较高的C/N,假如在这一时期,培养基中氮源依然很高,其导致的发酵结果是,底物消耗了但产物的产率却很低。在大多数情况下,C/N要求在0.2——2.0。对于一些特殊的情况,例如谷氨酸发酵,在谷氨酸生物合成期,则要求C/N为:100/15-21。(2)在确定了C/N的前提下,需要研究的是不同的氮源,对发酵的影响。虽然C/N确定,可是氮源的利用其本质就是:pr肽AA,经过AA而被利用,不同的氮源,其AA的组成与比例也不相同,对其发酵结果的影响也不相同。有人在HASS(高温淀粉酶)的发酵过程中,向培养基中添加某些AA(亮,异亮)则有利于高温淀粉酶的合成基因的表示,发酵液中的酶活力则明显得到提高。(3)大多数的工业培养基都使用玉米浆。玉米浆内含有VH,它是菌体生长和代谢的所必须的一种辅酶,一般玉米浆与:菌体的增殖速度有关与菌体细胞膜的合成有关,从而影响到细胞膜的通透性对于某些菌体,与代谢途径和代谢机制有关。(4)生长因子:大多数菌体的生长因子如下:维生素:大多数维生素是微生物生长的辅酶,需要量很小,1—50µg/L。AA,凡是微生物自身不能合成的AA则必须以游离的AA或者小分子的肽提供,一般,以小分子的肽提供,微生物更易经过细胞膜进入菌体内部?,如果提供外援氨基酸,需要注意的是各种氨基酸的平衡。嘌呤及其衍生物2.培养基的优化方法一种合成培养基的设计,需要考虑的因素是很多的,需要研究的成分也是很复杂的,其中包括碳源、氮源、玉米浆等,即便是碳源还能够是几种碳源的混合体,再加上述几种因素之间的相互影响,要确定一个科学的培养基配方是需要做大量的工作的,采用一个合理的数学方法,就能够在减少工作量的前提下,得到科学的结果。介绍一种数学方法:均匀实验设计方法——旋转正交实验方法.这是在正交实验的基础上发展起来的一种对于多因素、多水平的一种实验设计方法。参考文献:方开泰:均匀正交实验方法雄宗贵:发酵工艺学原理§3-2培养基用材料及处理一、淀粉的水解许多微生物由于其本身的生理生化特性而决定了其代谢所需的底物只能使Glucose等单糖,主要有下列菌种:酵母:G、F、蔗糖、半乳糖、以及部分麦芽糖等大部分的细菌:GA产生菌、Lys产生菌、苏云金芽孢杆菌等其中:地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌则能够以淀粉为原料。霉菌:大部分的霉菌能够直接使用淀粉为原料,她们本身具有淀粉的水解能力。淀粉的水解方法主要有酸法、酶法以及介于这两者之间的酸酶法、酶酸法,分别介绍如下:1.淀粉的水解方法(1)淀粉的酸法水解水解原理:淀粉是由葡萄糖经过α-1,4或α-1,6葡萄糖苷健连接而成的含有多个葡萄糖的大分子长链物质,根据其葡萄糖连接的糖苷健的不同,可分为枝链淀粉和直练淀粉,能够使用重合度来表示淀粉分子的大小,所含有的葡萄糖苷健的数量,称之为淀粉的重合度,用DP来表示。淀粉内部的葡萄糖苷健在一定的温度和酸性的条件下能够水解,而使淀粉分子链断裂,高温可加速葡萄糖苷健的水解速度。水解条件:高温,120℃以上,H+,0.2MPa的压力缺点:反应条件比较强烈,产生的副产物较多.主要有下列副产物:双分子葡萄糖脱水,形成复合二糖,分别是异麦芽糖、龙胆二糖,前者不利于产物的结晶提出,后者对于菌体的生长有抑制作用。一分子葡萄糖脱水,形成5-羟甲基糠醛,对于菌体的生长有抑制作用。一分子葡萄糖和—NH2反应,形成氨糖,是淀粉水解糖液有色物质的主要来源。(美拉得反应)2.酸酶法3.酶酸法4.双酶法:使用两种淀粉水解酶:α-淀粉酶淀粉α-1,4;1,6葡萄糖苷酶。α-淀粉酶:又称为淀粉液化酶,只作用于淀粉α-1,4葡萄糖苷健,其作用特点是能够快速将长链的淀粉水解成短链糊精,液化的含义?其水解速度随着淀粉链长度的降低而变得越来越慢,换言之,该酶不可能将淀粉完全水解成葡萄糖(从水解葡萄糖苷健的种类,水解速度到最后已无工业意义三个方面),因此该酶的淀粉水解产物中以短链的糊精为主,含有少量的葡萄糖。淀粉α-1,4;1,6葡萄糖苷酶,又称为糖化酶,能够水解淀粉分子的α-1,4;或α-1,6葡萄糖苷健,其作用特点是,淀粉的分子链越短水解速度越快,水解产物为葡萄糖。酸法与双酶法的优缺点比较:(1)酶促反应条件温和,水解产生的副产物少,对微生物的生长有利。有的人会问?当前采用的耐高温α-淀粉酶的作用温度也是较高,突破100℃,和酸法水解的温度相差不多。双酶法淀粉水解首先使用耐高α-淀粉酶进行淀粉的液化,此时水解液中的葡萄糖很少,不具备生成副产物的物质条件。(2)正因为上述原因,淀粉水解产率较高,一般糖的转化率能够提高10%以上。这能够给味精、制药的领域带来巨大的经济效益。例如:对于年产10000吨的小型味精厂,年增产100吨味精,直接经济效益可达到:0.8*100=80万元。(3)能够直接使用粮食进行双酶法水解,因为双酶法水解的条件温和,对于粮食中的蛋白质等其它物质的破坏较少。(4)双酶法水解使用的淀粉乳浓度较高,能够达到20Be以上,而采用酸法水解,淀粉乳的浓度一般只有12Be,原因?(副产物)意义?(设备利用率)介绍液体浓度Be的概念:波美度(Be)是表示液体浓度(比重)的一种方法,其和液体比重之间有下列关系:d=λ/λ-Be式中——d:液体的比重λ:模数λ因标定的温度不同可将波美表分为:美国:15.6℃标定,λ=145合理:15℃标定,λ=144.3荷兰:12.5℃标定,λ=144标定方法:轻表:”0”Be的位置,把表放在一定温度下的蒸馏水中的位置;”10”Be的位置,把表放在一定温度下的比重为0.9351的溶液中的位置。重表:”0”Be的位置,该位置是把表放在一定温度下的蒸馏水中;”66”Be的位置,该位置是把表放在一定温度下的比重为1.842的浓硫酸溶液中。表示溶液的比重的方法还能够使用Bx(玻利克斯):定义:某一溶液的Bx,表示该溶液的比重和相同浓度(为Bx%)的蔗糖溶液的比重相等。注意:Bx的概念不同于波美度,她与比重之间是没有计算公式的,可是能够查找有关换算关系。2.淀粉的双酶法水解工艺淀粉调浆液化糖化过滤糖液浆液浓度:20—30Be,调pH值6.0—7.0,添加CaCL2,使用量,0.01mol/L(目的?)液化:耐高温α-淀粉酶,酶的使用量:5—8单位/g淀粉温度:105℃;时间,20—30分钟降温:采用喷射冷却方法:糖化:使用淀粉α-1,4;1,6葡萄糖苷酶;使用量:根据液化淀粉的浓度,30%的浓度,80—100单位/g淀粉温度:65℃终点判断:时间,2—3小时。二、糖蜜的处理1.糖蜜的主要成分糖,49—50%,因不同的原料和生产方法不同而异,主要是蔗糖胶体物质,5—10%,来自于原料灰分,10—12%生物素,1—10mg/Kg(甘蔗),0.04—0.06mg/Kg(甜菜)pH值6.2(甘蔗),7.4(甜菜)对于发酵工业能够利用得的主要成分是:糖和生物素2.用途发酵工业用原料,国内发酵生产的有:味精、酵母当前,国内酵母工业使用进口糖蜜为原料,带来了较大的工业污染,……使用糖蜜生产酒精使用糖蜜生产蒸馏酒——姥姆酒,世界名酒,牙买加的国酒,在西方国家主要用于鸡尾酒的勾兑上。作为添加剂使用,柠檬酸发酵,作为添加剂使用。使用糖蜜发酵生产黄源胶,已有研究报道。3.处理方法处理目的:a.除去胶体性物质,降低糖蜜的粘度,提高发酵液的流动性,有利于改进发酵过程中氧的传递。b.脱色,除去有色物质(有色物质的来源?),对产品的质量有影响,对微生物的生长和代谢有影响。c.中和过量的酸碱性物质,除去部分对pH值有影响的缓冲性物质。方法:a.冷酸通风沉淀法,即加酸后,通风,使之沉淀糖蜜经酸化后主要是除去糖蜜中胶体性物质,通风的目的是除去一些挥发性物质。(教材中提到的通风是为了提高KLa是错误的)b.加絮凝剂(PAM)聚丙烯酰胺(PAM)作为絮凝剂,能够促进大分子物质的沉降,有利于糖蜜的澄清。工艺过程:原溶液(稀释)40Bx调pH值(3—3.8)絮凝静置絮凝剂的用量:8mg/L,静置时间:1小时加热到90℃C.活性炭吸附法能够除去糖蜜中的有色物质,明显的降低糖蜜的色泽,对发酵的产品的提出和产品质量有益。缺点:活性炭的使用量较大,处理成本较高。三、工业培养基的添加剂添加剂一般是指除了培养基中的C、N、无机盐、金属离子以外的其它物质,主要有:1.前驱物质特别是对于某些氨基酸、核苷酸和抗菌素的发酵生产,添加一定量的前驱物质(前体)其作用是非常明显的。基本原理:(1)S前驱物质产物 反馈抑制的存在,需要添加前驱物质不存在抑制或阻遏(2)S前驱物质的和成效很低,需要添加前驱物质(3)SX前驱物质产物存在分枝代谢,不能够很好的解决分枝代谢对X的反馈抑制作用,须要有添加剂注意:前驱物质的使用,因不同的菌种、不同的产物、不同的代谢机制而使用的方法不同,使用的浓度也不同,但都是建立在对其代谢调节机制有从分的了解的基础上的。2.代谢促进剂和代谢抑制剂促进剂主要是指诱导物,在酶的生产;抑制剂主要在抗菌素的生产中使用的较多。例如:(1)四环素发酵过程中,添加NaBr,能够抑制金霉素的生物合成,从而提高四环素的产率。(2)头孢霉素C,添加L—Met,能够抑制头孢霉素N的生物合成,从而提高头孢霉素C的产率。上述这些情况,抑制剂对代谢的抑制作用是发生在代谢链具有分枝代谢上的,如下图所示:SABC产物副产物(X)抑制剂作用点,一般是X的结构类似物§2-3培养基的灭菌一、灭菌原理所谓灭菌就是杀死一切微生物,包括微生物的营养体和芽孢,这一概念不同于消毒。后者是指消灭一切致病微生物(病原体)灭菌的方法很多,在实验室能够使用干热灭菌、对于环境能够使用化学试剂灭菌,但化学试剂的灭菌方法有很大的限制。在工业生产中,对于培养基、管道、设备的灭菌,一般采用蒸汽加热到一定的温度,并保温一段时间的灭菌方法,称之为湿热灭菌?湿热灭菌的显著优点是:使用方便,无污染,而且其冷凝水能够直接冷凝在培养基中,也能够经过管道排出。下述内容就是针对湿热灭菌的。首先讨论几个基本概念:1.微生物的热阻定义:微生物的热阻就是指微生物对热的抵抗能力。其对热的抵抗能力越大,能够理解为热阻越大,衡量不同的微生物对热的抵抗能力的大小,能够使用相对热阻的概念。相对热阻:两种微生物的热阻之比。例如:芽孢/大肠杆菌=3000000/1;病毒/大肠杆菌=1—5/1等2.理论灭菌时间微生物的湿热灭菌过程,其本质上就是微生物细胞内蛋白质的变性的过程。因此,能够把灭菌过程看成是蛋白质的变性的过程,从这个意义上讲,灭菌过程应遵循单分子反应的速度理论,那么,则有下列方程:-dN/dt=k*N式中——-dN/dt:表示灭菌过程中某瞬间活菌的减少速率N:表示表示灭菌过程中某瞬间的活菌数K:表示灭菌过程中菌体死亡的速度常数,K=f(灭菌温度、菌种、培养基等)上式的积分形式为:t=2.303/k*lnN0/NS式中——N0,NS:分别表示灭菌前、灭菌后培养基中菌体的浓度(个/ml)k:意义同上t:表示理论灭菌时间理论灭菌时间的计算需要注意以下几个问题:(1)K值因不同的微生物种类不同、不同的生理状态、不同的外界环境,差别很大,实质上,它是微生物热阻的一种表示形式,微生物的热阻越大,K值也越大。例如:芽孢,在121℃时,K=60/s营养体,在121℃,k=60—6*1010/s(2)在计算过程中,N0,NS如何取值?N0=芽孢性细菌总数+芽孢数灭菌时温度升高,营养体即可变成芽孢对于NS,如果取NS=0,那么,t=∞,这显然是与现实情况不符。对于如何NS取值?一般取NS=10-3,这个数值如何理解?灭菌1000次,有一次是失败的,残留了一个活菌体。这个数值的取值的大小,也间接反应了该生产过程中的技术管理水平。(3)上述灭菌时间,一般称之为理论灭菌时间,只能够用于工程计算中,在实践过程中,因蒸汽的压力问题(不稳定)、蒸汽的流量问题有很大差别,甚至培养基中的固体颗粒的大小、培养基的粘度等因素,都会影响灭菌效果,因此在实际生产中,一般采用经验数值:间歇灭菌,121℃,20—30分钟连续灭菌,137℃,15—30s,在维持罐中保温8—20分钟。3.灭菌温度的选择灭菌温度的选择应考虑的因素主要有:a.微生物的热致死温度,应高于该温度。一般以芽孢为准。何为热致死温度?(10分钟,全部死亡的温度)b.营养成分的破坏,灭菌的过程实质上也是营养成分破环的过程因此,灭菌温度的选择,应是在保证灭菌效果的前提下,尽可能减少培养基中营养成分的破坏。许多实验研究结果表明,培养基在高温灭菌的过程中,其营养成分的破坏在很大程度上能够用一级反应来描述其反应速度:dc/dt=-K,×C式中——dc/dt:表示营养成分破环的速率,C:表示营养成分的浓度K,:为反应速度常数,1/s,K=f(t,……)反应速度常数K,与温度的关系,能够使用阿累尼乌斯公式表示之:K,=A,×e[-E/RT]……(1)式中——K,:反应速度常数,1/SE,:反应的活化能(J/mol)R:气体常数,1.987*4.18J/mol*kT:反应的绝对温度,k同样,灭菌过程中的反应速度常数也能够用下式表示出:K=A×exp[-E/RT]……(2)(1)、(2)式能够改写成下列形式:lg(k,2/k,1)=E,/R×(1/T1–T2)……(3)lg(k2/k1)=E/R×(1/T1–T2)……(4)(3)(4)的意义是指:反应的温度从T1升高到T2,其反应的速度常数分别从k,1增加到k,2;k1增加到k2;培养基的灭菌过程实际上是营养成分破坏、菌体死亡的两个平行性反应,如下所示: BAC对于平行性反应,反应温度的提高,其两个平行性反应的速度常数都增加,但增加的幅度(大小)却不同,其比值能够表示为:lg(k2/k1)/lg(k,2/k,1)=E/E,……(5)实验证明:营养成分为破坏的反应的活化能E的值为E,=8.36—83.6*103J/mol而菌体死亡的活化能E芽孢:E=418*103J/molE=无芽孢:E=209—250*103J/mol显然,(5)式的比值〉1,说明提高温度对于第二个平行反应,即菌体死亡的反应是有利的。提高温度,虽然两个平行性反应的反应速度常数都提高了,可是,达到同样的灭菌效果,所需要的时间却缩短了,由于第一个反应也就是营养成分破坏的反应速度常速增加的少,因此,有利于减少培养基在灭菌过程中营养成分的破坏。换言之,高温短时灭菌对于培养基营养成分是有利的。一般所说的高温短时灭菌能够提高生产效益,其理论根据就在于此。可是高温短时灭菌是需要一定的设备条件的,一般需要连续化的灭菌工艺流程?(高温后的快速冷却在大型的生物反应器内是很难实现的……)这就给中小型生产企业带来了一定的困难,设备投资的增加,技术管理水平的提高(培养基连续灭菌后,后述设备的无菌化管理对于整个体系的无菌操作是必须的……)高温短时灭菌的优点还能够表现在:节省能量上,培养基的预热?二、培养基的工业灭菌方法培养基的工业灭菌一般涉及到以下几个概念:1.空消:意义:由于空消时反应器内的死角少,蒸汽的传热效率高,对于反应器灭菌效果好,一般在较长时间没有使用的反应器、染菌的反应器、更换菌种时都要进行空消。采用培养基连续灭菌的工艺,需要空消。2.实消:定义?优点:不需要特定的设备,操作、管理比较灵活。3.连消:定义?优点:营养成分破坏少,生产效率高热综合利用率高大型企业自动化程度高尽管,高温短时灭菌的优点非常明显,但不能说发酵领域采用高温短时灭菌是唯一的选择。一个生产企业灭菌方法的选择是要从生产工艺、设备、操作、技术管理、固定资产投资等多个方面整体考虑。当前,中国发酵领域依然是以分批操作的实消为主,因此我们的后述内容主要是介绍分批操作的实消灭菌工艺。三、分批灭菌操作要点将配置好培养基打入生物反应器内进行实消,操作要点如下:定期检查设备、管道有无渗漏,主要是:冷却管道,夹套。培养基升温时,打开所有的排气阀门,排掉空气?当培养基的温度升到灭菌温度时,进入保温操作阶段,此时要求与反应器相连的所有管道出于两个状态:进汽或出汽,目的是对管道进行灭菌。讲一下,阀门的特殊性?培养基升温时开动搅拌系统,以使培养基内部传热均匀,当温度升温到100℃时,停止搅拌,一方面是为了保护轴承,另一方面,当培养基的温度升温到100℃时,培养基的沸腾,能够起到搅拌作用。注意辅助设备的灭菌:空气过滤器、计量罐、流加管道与流加液贮罐,空气流量计等。保温期间,要求罐压:0.09—0.10MPa,温度:118—121℃,时间:30分钟。灭菌结束后,需要立即引入无菌空气,保证罐内压力后方可冷却,目的是防止培养基的冷却使罐内形成负压,易染菌。配制培养基时,应充分考虑培养基在灭菌时的稀释(体积的增加),一般体积可增加20%左右,灭菌时间越长,体积增加的越多。四、分批灭菌的工程计算主要介绍一下传热计算(与毕业设计教学环节有关,与将来的实际工作关系更大)。1.升温阶段培养基在反应器内的升温有两种加热方式:(1)使用夹套、冷却排管(2)蒸汽直接加热(1)使用夹套、冷却排管t=W*C/K*F×ln(t1–t2s)/(t1–t2f)式中——t:升温所需要的时间(小时)W:培养基的重量,(Kg)F:总的传热面积,m2t1:加热蒸汽的温度,℃t2s:培养基加热的起始温度,℃t2f:培养基灭菌的温度,℃k:平均传热系数,KJ/m2*hr*℃因为在加热过程中,培养基的温度在不断升温,温差在变化,属于不稳定传热过程,其传热系数k,应取平均值:夹套加热:k=830—1254KJ/m2*hr*℃排管加热:k=1254—1881KJ/m2*hr*℃C:培养基的比热,KJ/Kg*℃比热C的计算方法:采用线性叠加法:C=0.37×4.18*X+4.18×(1-X)醪液中固形物的重量百分数%0.37×4.18:固形物的比热,KJ/Kg*℃任何以谷物、淀粉为原料的醪液,其比热都能够这样计算。(2)蒸汽直接加热加热的速度很快,时间不需要计算,需要计算的是蒸汽的消耗量:S=[W*C((t2f–t2s)+Q1]/(λ–t2f)式中——S:蒸汽的消耗量,KgQ1:发酵罐散失的热量,Q1=Q总×(10——20)%λ:蒸汽的热含,KJ/kg(与蒸汽的压力有关)t2f、t2s:与上述相同2.保温阶段此时,打开发酵罐顶部的所有排气阀门,排蒸汽灭菌:蒸汽的消耗量S计算如下:S=1.19×F×T×(P/γ)0.5式中——S:蒸汽的消耗量,KgF:蒸汽排出口总面积,cm2T:排气的时间,分钟P:罐内绝对压力,MPaγ:蒸汽的比容,m3/kg3.冷却阶段需要计算的是冷却的时间,尽可能快的降温,减少培养基营养成分的损失。T=W*C1/G*C2×(A/1-A)×ln(t1s–t2s/t1f–t2s)式中——W、C1:分别表示培养基的重量和比热,Kg、KJ/Kg*℃G、C2:分别表示冷却水的流量和比热,Kg/hr、KJ/Kg*℃t1s:培养基开始冷却的温度,即灭菌温度,℃t1f:培养基需要冷却到的温度,即接种的温度,℃t2S:冷却水进口的温度,℃A=exp[KF/GC2]×(t1–t2s/t1–t2)式中——G、C2:分别表示冷却水的流量和比热,Kg/hr、KJ/Kg*℃F、K:意义同前t2S:冷却水进口的温度,℃t1:被冷却介质的任何一个温度,℃t2:与被冷却介质温度t1相对应的冷却水的出口温度,℃思考题:1.微生物发酵培养基的碳源主要有哪几种?2.微生物发酵培养基的氮源主要有哪几种?3.淀粉的水解方法主要有什么?试进行有缺点比较?4.双酶法淀粉的水解一般使用哪2种酶?其作用特点分别是什么?5.培养基工业灭菌的方法主要是采用蒸汽灭菌,其灭菌的原理是什么?灭菌过程符合对数残留定律,写出理论灭菌时间的计算公式。6.生物反应器灭菌的操作要点有什么,绘图说明操作过程。7．以化学反应动力学为基础,说明高温短时灭菌能够减少培养基营养成分损失的原因。8．掌握以下几个概念:理论灭菌时间、对数残留定律、实消、空消、连消、波美度第四章发酵机制与代谢控制微生物的代谢产物很多,主要有乙醇、丙酮、乳酸、氨基酸、酶制剂、抗生素等,在这些产物中,乙醇、丙酮、乳酸等,微生物能够在特定的外部环境下生成,这类发酵我们称之为:自然发酵。而有些产物诸如:氨基酸、酶制剂等,正常的微生物是不能在培养基中大量的合成与积累,是需要经过:化学的、物理的、生物的等方法人为的改变其原来的代谢途径,使之能够分泌并积累特定的产物,这类发酵称之为:代谢控制发酵?对于前者,人们能够在简单了解其代谢合成机制的条件下,经过对环境的控制,来提高其产量和产率,而实现大规模的工业生产。(产量和产率?产量是指:一批次的产量;产率是指底物与产物的转化率,产量高不一定产率高;相反,产率高不一定产量高,两者对于大规模的工业化生产都很重要)对于后者,人们不但需要严格的控制环境,一般还需要对其代谢机制有系统地了解,才能够提高其产量和产率。本章的主要内容就是研究微生物的各种代谢调节机制,有助于提高对微生物发酵的本质的认识。§4-1糖的代谢与调节本节主要介绍糖代谢的几条代谢途径,和其调节机制,并简单介绍糖代谢的直接产物:甘油、乙醇等厌氧发酵。一、糖代谢的途径糖代谢的主要途径有:1.糖的酵解途径——EMP途径其产物是:丙酮酸丙酮酸还原:乳酸发酵脱羧,生成乙醛,乙醛还原在有氧的条件下,在厌氧的条件下:生成乙醇2.TCA循环丙酮酸在有氧的条件下,在丙酮酸氧化脱羧酶系(脱氢酶)的作用下,氧化脱羧生成乙酰辅酶A,CH3-CO-SCoA,进入TCA循环,彻底氧化成CO2和H2O。反应式如下:TCA一圈,即每分子乙酰辅酶A氧化,有:C6H12O6=6CO2+6H2O+38ATP+3NAD(P)H3ATP*3=9ATP1FADH2.5ATP1GTP总计:12.5ATP*3=37.5+2ATP(EMP)?3.HMP途径(磷酸戊糖途径)将葡萄糖彻底氧化成CO2和H2O,并有35分子的ATP生成,特点:(1)中间代谢产物中有,C7、C5、C4有利于微生物的合成代谢。(2)只有NADP参入氧化脱氢反应,能够产生大量的NADPH(3)是一条高产能的氧化途径。反应式:C6H12O6=6CO2+6H2O+38ATP4.ED途径常见的是细菌的ED途径,发酵生产乙醇。应式:C6H12O6=2丙酮酸+2TP+NADPH+NADH上述这些代谢途径在许多微生物体内能够同时存在,只有极少数的细菌是以HMP为唯一的有氧氧化途径(醋酸细菌、工业醋酸细菌等)。当EMP、HMP、TCA、ED中的任意两条途径同时存在于同一种微生物体内时,其比例因不同的菌株、同一菌株也因不同的生长和环境条件不同而异。例如:在谷氨酸发酵中,菌体生长期:EMP/EMP=38%GA合成期,EMP/EMP=26%二、糖代谢的调节机制1.糖代谢的能荷调节能荷=[ATP]+1/2[ADP]/[ATP]+[ADP]+[AMP]显然,能荷在0——1之间。G磷酸化酶酸果糖激酶糖原葡萄糖产生ATP,关键酶柠檬酸合成酶异柠檬酸脱氢酶能荷降低,则激活上述关键酶的活性,同时抑制糖原合成酶的酶活性,加速糖分解,产生APTP,使能荷增加;能荷增加,则抑制上述关键酶的活性,使糖的降解速度下降,ATP的生成速度降低,同时激活糖原合成酶的酶活性,糖原合成速度的增加,一方面减少了ATP的生成,又消耗了ATP(糖原合成需消耗能量),糖代谢流发生了转变。因此,能荷对糖代谢的调节是方向性的。2.生物素的调节生物素对糖代谢的调节与能荷的调节是不同的,后者是对糖代谢流的调节,而前者(生物素)的主要作用是对糖降解速率的调节,一般生物素能够促进糖的EPM途径,对TCA循环也有促进作用,对糖的HMP途径也有促进作用,可是,对上述三条途径的促进作用的大小却不同,对EMP途径的促进作用较大……。生物素在微生物发酵领域的作用后述。3.磷酸盐的调节作用三、酵母菌的酒精发酵以淀粉质为原料的酵母菌的酒精发酵曾经是中国轻工业行业的支柱产业,现在由于化学合成法酒精的规模化,使得酵母酒精发酵行业越来越萎缩,但由于白酒生产在中国依然有着较大的市场,这其中就有一部分是由酒精勾兑生产出的,因此,今天比较详细地介绍一下酒精生产工业。四、酵母菌的甘油发酵1.行业简介甘油是重要的工业原料,推动甘油行业快速发展的却是战争,炸药的生产。当前,甘油的用途主要有:在化工领域:环氧氯丙烷,改性醇酸树脂、酚醛树脂等医药工业:添加剂,润滑剂等食品工业:甜味剂、保湿剂,对风味也有独特的影响在造纸、皮革、玻璃、化妆品等行业:约1700多种产品需要。它生产方法:1.天然油脂为原料:天然油脂肥皂,废水回收甘油原烟台第二化工厂生产军用甘油,其副产品……2.以丙烯为原料合成壳牌的氯化法,过乙酸法3.发酵法甘油生产添加亚硫酸盐的甘油发酵法是德国第一次世界大战中研究生产的,随后各国分别采用了许多先进的生产设备,可是甘油发酵的基本原理是相同的都是采用厌氧发酵法。厌氧发酵法甘油的生产,由于发酵过程中添加了亚硫酸盐,酵母的生长和代谢处于碱性的条件下,细胞死亡率较高,因此有人提出了甘油发酵的新方法——好氧发酵法,即是在甘油发酵过程中通风,以减少酵母细胞的死亡率;另一方面,在适当的氧的存在下,酵母细胞能够进行有限的有氧代谢,为其自身的生长提供必须的ATP(甘油发酵不产ATP?),当前各国都在以甘油的好氧发酵为基础,以提高甘油产率、提高酵母的耐渗透压力、提高甘油的总提出率为目标的科技攻关研究。中国”八五”期间,把甘油发酵列为重点科技攻关项目,由无锡轻工业学院和四川省食品发酵工业设计研究院接受了该研究项目。1991年轻工业部组织的鉴定认为:1.产菌种,耐渗较高,糖含量25%,甘油浓度达到,120g/L2.载体蒸馏技术,由无锡轻工业”甘油研究中心”在甘油:糖=1:1的条件下,甘油的提出率可达到80%。为何有这个1:1?)当前,以淀粉为原料的甘油生产已经有工业化装置,全国共20多家生产企业采用发酵法生产甘油。1995年,在无锡轻工业学院成立了”中国发酵工业协会”下属的,”甘油发酵专业委员会”,以推动中国发酵甘油的工业化进程。中国发酵甘油在技术上与国外主要存在以下差距:(1)残糖高,……(2)规模化较少,……中国甘油市场的构成与西方发达国家相比也有较大的差异,如下所示:中国:涂料,49%;医药食品,10%美国:涂料,10%;医药食品,54%以上这种甘油消费市场的差异,导致了当前中国发酵甘油市场的疲软,影响了发酵法甘油生产和技术的快速发展。中国甘油消费的增加速度也非常缓慢,年均消耗量在7——8万吨,与中国的整体经济增长不成比例;与欧洲、美国的使用量也不成比例,欧洲:19万吨;美国:16万吨。2.甘油合成机制酵母细胞内葡萄糖的降解如下:葡萄糖(磷酸化,葡萄糖激酶)(磷酸果糖激酶)ATPATP1,6—二磷酸果糖(醛缩酶)3-磷酸甘油醛磷酸希醇式丙酮酸丙酮酸NAD(P)H磷酸二羟丙酮NADH乙醛α-磷酸甘油NADH(甘油激酶)乙醇甘油(乙醇脱氢酶)(1)在厌氧的条件下乙醇脱氢酶的活性很强,菌体的代谢流流向合成乙醇的方向,而磷酸二羟丙酮又能够迅速的在磷酸丙糖异构化酶的作用下转变成3—磷酸甘油醛,因此,在厌氧的条件下,酵母大量的将葡萄糖转变成乙醇,而产物中只有很少的甘油,在酵母菌的其它厌氧发酵产品中(白酒、葡萄酒、黄酒等),甘油的含量也很少。那么,如何利用上述代谢途径厌氧发酵生产甘油呢?显然需要切断乙醇的合成途径,方法如下:a.向发酵液中添加适量的亚硫酸氢钠(NaHSO3),则有下列反应乙醛+NaHSO3==乙醛亚硫酸氢钠加成物?则,NADH没有受体,使得菌体的代谢流转向合成甘油的方向进行,从而生产大量的甘油。b.在碱性的条件下,则有下列反应(双分子歧化反应)乙醛+乙醛==乙醇+乙酸则,NADH没有受体,使得菌体的代谢流转向合成甘油的方向进行,从而生产大量的甘油。厌氧甘油发酵的能量和转化率的问题:每分子葡萄糖生成双分子的丙糖(两分子C3)的同时,需要2分子的ATP作为酵解的能量(酵解的一、二步反应),其中一分子的C3(3-磷酸甘油醛)经过一系列的生化反应生成一分子的丙酮酸,并伴有底物水平磷酸化生成2ATP;如果,另一分子的C3(磷酸二羟丙酮)被还原生成α—磷酸甘油,进而生成甘油,则整个甘油发酵没有能量产生,那么,菌体不能够保持活力,而趋于死亡。即便是这样,要保持甘油的生成,必须有一分子C3(3-磷酸甘油醛)流向乙醛的生成方向,才能够有2分子的底物水平磷酸化ATP的生成,葡萄糖的降解才能够达到能量平衡。从这个意义上讲,以葡萄糖为原料的甘油的厌氧发酵,产率不可能突破50%的转化率,这也正是著名的?厌氧甘油发酵的缺点:以上分析足能够看出甘油厌氧发酵的缺点:a.菌体死亡率较高,碱性条件;无能量产生;b.转化率较低,按照上述能量平衡计算,糖与甘油的转化率不可能超过50%,加上酵母增殖需要消耗一部分糖,发酵液中残留一部分糖,实际转化率远低于50%。这一转化率,导致了厌氧发酵生产甘油的成本较高。因此,人们正在研究开发新的甘油发酵生产技术——好氧发酵法。(2)好氧发酵在适当(或者说有限的好氧)好氧的条件下,酵母细胞进行有限的好氧呼吸,糖酵解产生的丙酮酸能够经过TCA循环来增加其产能水平,一方面减少3—磷酸甘油醛向乙醛方向进行,增加底物向产物转化的比例;另一方面,增加了细胞能量水平,减少了细胞的死亡率,有利于提高发酵的速率,缩短发酵周期。可是,这种有限的好氧发酵,使得丙酮酸进行TCA循环的同时,也增加了TCA循环过程中的许多中间性产物的产生,这对于甘油的提取带来了不利的影响。当前,甘油的总提取率大约在87%左右,要降低发酵甘油的生产成本,提高甘油的提取率具有很大的潜力。提高甘油的提取率,改进发酵液的组成,降低发酵液中残糖浓度,减少发酵液中副产物的含量,是非常重要的。§4-2柠檬酸发酵机制与代谢调控行业简介:柠檬酸又称为:枸橼酸,是当前由微生物发酵生产应用最为广泛、产量最高的有机酸。其主要用途:食品、饮料、医药、化妆品、洗涤剂、建材等领域。最早的柠檬酸是从柠檬中提取的,故命名为柠檬酸。后来采用发酵法生产。世界上最早的发酵法柠檬酸生产是1923年的比利时,采用浅盘法发酵生产?1952年,美国的Miles公司以淀粉质为原料,经水解后,深层发酵获得成功。中国1953年刚开始也是采用浅盘法发酵生产柠檬酸,60年代后期,开始采用液体深层发酵法生产柠檬酸。当前,中国柠檬酸行业从产量上位居世界第一,从技术上,在国际上也是处于世界领先水平,并远远领先于其它国家,其优势在于:1.中国的柠檬酸发酵采用的菌种(黑曲霉)具有双重功能,当淀粉原料被液化后,即可进行发酵,不需要将淀粉水解成葡萄糖,简化了生产工艺,降低了生产成本。2.尽管采用边糖化边发酵的工艺,但发酵周期只有64小时,生产周期比国外的单边发酵周期还要短。3.柠檬酸的产酸速度大大地高于国外水平。平均产酸速率是国外的2倍。二、柠檬酸的生物合成途径葡萄糖丙酮酸+丙酮酸乙酰辅酶A(CH3CO-CoA)CO2固定反应草酰乙酸+(柠檬酸合成酶)柠檬酸顺乌头酸酶异柠檬酸 异柠檬酸脱氢酶α—KGA 琥珀酸按照正常的微生物菌体的代谢规律,上述途径并不能够积累柠檬酸,而是进入TCA循环,被彻底氧化,柠檬酸产生菌之因此能够大量积累柠檬酸,其产生菌菌种必须具备一定的内在因素,也就是:柠檬酸后述的各种酶,主要是,顺乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶酶的活性丧失或非常微弱,否则,合成的柠檬酸迅速被降解成其它物质。菌体有了上述特点,只是具备了合成并积累一定量的柠檬酸的条件,要想大量的合成柠檬酸,或者说,追求柠檬酸的高产率,还需要解决柠檬酸合成过程中的代谢调节与控制的问题。三、柠檬酸生物合成中的代谢调节与控制柠檬酸是微生物生长代谢过程中的一个中间性产物,在正常的微生物体内不能够积累的,如果有积累的话,与柠檬酸合成有关的各种酶的活性,则会受到抑制或阻遏,那么,柠檬酸发酵过程中,这种抑制或阻遏是如何被克服的呢?分述之:1.磷酸果糖激酶(PFK)活性的调节从葡萄糖柠檬酸的合成过程中,PFK是一种调节酶或者称之为关键酶,其酶活性受到柠檬酸的强烈抑制,这种抑制必须解除,否则,柠檬酸合成的途径就会因为该酶活性的抑制而被阻断,停止柠檬酸的合成,……研究表明,微生物体内的NH4+,能够解除柠檬酸对PFK的这种反馈抑制作用,在较高的NH4+的浓度下,细胞能够大量形成柠檬酸,那么NH4+浓度是如何升高的呢?进一步的研究表明,柠檬酸产生菌——黑曲霉如果生长在Mn+缺乏的培养基中,NH4+浓度异常的高,可达到25mmol/L,显然,由于Mn+的缺乏,使得微生物体内NH4+浓度升高,进而解除了柠檬酸对PFK活性的抑制作用,使得葡萄糖源源不断的合成大量的柠檬酸。Mn+缺乏如何会使NH4+浓度升高呢?当培养基中Mn+缺乏时,NH4+浓度升高,同时微生物体内积累几种氨基酸(GA、GLu、Arg、Oin等),这些氨基酸的积累,意味着体内蛋白质的合成受阻,而外源蛋白质的分解速度则不受到影响,这样NH4+的消耗下降,NH4+浓度就会升高,微生物体内蛋白质和氨基酸的代谢关系能够使用下图示之:氨基酸合成蛋白质分解氨基酸氨基化合成氨基酸2.顺乌头酸酶活性的控制该酶的丧失或失活是阻断TCA循环,大量生成柠檬酸的必要条件。一般柠檬酸产生菌体内该酶的活性本身就要求很弱,但在发酵过程中仍需要控制它的活性。由于该酶的活性受到Fe2+的影响,控制培养基中的Fe2+的浓度,能够使该酶失活。因此,柠檬酸发酵要求采用不锈钢为反应器的材料,目的就是控制培养基中的Fe2+的浓度。可是在柠檬酸发酵过程中,培养基中的Fe2+的浓度有要求不能够低于0.1mg/L,原因当前尚没有搞清楚。3.能荷调节对柠檬酸发酵的影响那么,解决了柠檬酸发酵过程中的上述几个问题:……,是不是就意味着能够将葡萄糖源源不断的转化成柠檬酸呢?提问:根据微生物代谢调节的基本理论,还需要解决什么问题?菌体要大量合成柠檬酸,从葡萄糖经过EMP到柠檬酸整个代谢途径需要畅通,在这个过程中,有一步反应:丙酮酸氧化脱羧,每分子丙酮酸可产生一分子的NADH,在有氧的条件下,每分子的NADH经过呼吸链彻底氧化成H2O,并氧化磷酸化产生3分子的ATP,造成了微生物体内能荷的增加,能荷增加则抑制PFK等关键酶的酶活性,使得从葡萄糖到柠檬酸的代谢停止,怎么能够大量合成柠檬酸呢?如果NADH(还原型)不能够快速的被氧化转变成NAD(氧化型),则整个反应就会因为缺乏作为推动力的氧化型的NAD而停止,依然不能够合成柠檬酸。而实际上,确实柠檬酸产生菌能够在有氧的条件下大量生成柠檬酸,也就是说,NADH即被氧化了,又没有产生ATP。为了解释这种现象,有人提出了一种假设:该菌体内存在一条侧系呼吸链,NAD(P)H经过该呼吸链,能够正常的传递H+,将其氧化为H2O,可是并没有氧化磷酸化生成ATP,能够正常产生ATP的呼吸链称之为标准呼吸链。后来的大量的实验证明,在某些微生物体内确实存在一条这样的侧系呼吸链,该侧系呼吸链中的酶系强烈需氧,如果在柠檬酸的发酵过程中,发酵液的溶氧浓度在很低的水平维持一段时间,或者在这期间中断供氧一段时间(20分钟,根据处理情况如:紧急保压等)则这一侧系呼吸链不可逆的失活,其结果是菌体不再产酸,而是产生了大量的菌体,因为,标准呼吸链的存在使得菌体在代谢过程中产生了大量的ATP,用于菌体自身的生长上,这种现象,在生产上一般称之为:只长菌不产酸,大量的葡萄糖被消耗了,却没有生产出柠檬酸,是一种失败,(大型柠檬酸生产企业需要自己备用的发电系统)。理论能够指导实践,反过来,经过实践能够推动理论研究,丰富理论研究成果。科学研究过程中的许多基本规律是相同的,今天,我们在大学的学习,更多的是学习一种方法或者说一种思维。经过这个例子,我们能够学习到许多专业以外的知识……首先为了解释一种客观想象,提出一种假设,然后经过实验来证明这种假设……四、柠檬酸发酵的产率一个工业化的过程,产率问题是必须研究的问题。按照上述柠檬酸发酵过程中的代谢控制要求,菌体能够将葡萄糖转化成柠檬酸,可是,如果葡萄糖经过EMP途经生成丙酮酸后,丙酮酸在丙酮酸脱羧酶的作用下生成了乙酰辅酶A(CH3CO-CoA),则合成一分子柠檬酸需要3分子的CH3CO-CoA,也就是需要1.5分子的葡萄糖;试想,如果其中