细胞培养基本技术课件

细胞培养基本技术细胞培养基本技术细胞培养的基本概念体外培养细胞培养：使用单个细胞悬液组织培养：使用组织块（0.5～1立方毫米）或薄片（厚0.2毫米）器官培养：使用器官原基或器官的一部分或整个器官细胞培养基本技术培养细胞的生命归宿原代培养期传代期衰退期细胞培养基本技术细胞培养基本技术培养细胞的特性

培养细胞的生长方式贴附生长：必须贴附于支持物表面才能生长。悬浮生长：于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。细胞培养基本技术每代贴附生长细胞的生长过程游离期贴壁期潜伏期对数生长期停止期（平台期）细胞培养基本技术游离期：

细胞接种后在培养液中呈悬浮状态。也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。

10分钟一4小时细胞培养基本技术贴壁期：

细胞附着于底物上，游离期结束。细胞株平均在10分钟-4小时贴壁。底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长基质），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子附着。进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团）细胞培养基本技术细胞培养基本技术细胞培养基本技术潜伏期此时细胞有生长活动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为6～24

小时。细胞培养基本技术对数生长期：细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。细胞培养基本技术停止期（平台期）：细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂机制：接触抑制、密度依赖性细胞培养基本技术细胞培养基本技术培养细胞生长的条件1.细胞的营养需要2.细胞的生存环境温度:37℃O2CO2:5%CO2+H2O←→H2CO3←→H++HCO3-pH:7.2-7.4

渗透压

3.无污染

4.无毒细胞培养基本技术实验准备实验用品：仪器：超净工作台压力蒸汽消毒器电热干燥箱CO2培养箱倒置显微镜自动双重纯水蒸馏器纯水仪离心机天平水浴箱液氮罐冰箱酸度计滤器酸缸耗材：培养瓶吸管电动吸引器培养板冻存管等细胞培养基本技术超净台

超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气通过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。

细胞培养基本技术滤器细胞培养基本技术细胞培养基本技术CO2培养箱CO2培养箱设定的条件为37℃，5％CO2

。使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题：①用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。②保持培养箱内空气干净。定期消毒（75%酒精擦拭)。③箱内放置蒸馏水于蒸馏水槽中以保持箱内湿度，避免培养液蒸发。细胞培养基本技术细胞培养基本技术自动双重纯水蒸馏器纯水仪细胞培养基本技术培养板细胞培养基本技术培养瓶细胞培养基本技术清洗与消毒清洗玻璃器皿：

新：浸泡刷洗浸酸冲洗旧：用后立即浸入水中，及时冲洗。胶塞：2%NaOH煮沸10-20min

冲洗1%稀盐酸30min冲洗塑料器皿：2%NaOH浸泡过夜冲洗5%稀盐酸30min冲洗包装：牛皮纸、棉布、铝饭盒细胞培养基本技术消毒紫外线消毒:湿热消毒(高压蒸汽消毒):滤过消毒:大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、酶液等均采化学消毒:新洁尔灭、75％酒精

细胞培养基本技术细胞培养用液及配制水：新鲜配置的双蒸水或去离子水平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+的缓冲液

PBS：NaCl8.0gKCl0.2gNa2HPO4.H2O1.56gKH2PO40.20

加水至1000ml细胞培养基本技术消化液：1.胰蛋白酶胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配制。用滤器过滤除菌。

2.EDTA

化学螯合剂对细胞有一定离解作用3.胶原酶消化作用温和，对细胞损伤小。细胞培养基本技术培养基培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。天然培养基：天然培养基有血清、血浆、组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。优点：营养成分丰富，培养效果好缺点：来源受限成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析易发生支原体污染细胞培养基本技术合成培养基

合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如M199、MEM、RPMI-1640、DMEM、F12等。合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。优点：标准化生产，组分和含量相对固定，成本低。缺点：缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。

人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。细胞培养基本技术血清中含有：①多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）②多种金属离子③激素④促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等⑤各种生长因子⑥转移蛋白⑦不明成分细胞培养基本技术对于血清支持细胞生长的生物学效应已得到证明，但对血清中的复杂成分至今尚未完全清楚．血清中不仅存在促细胞生长因子，同对也存在细胞生长抑制因子或毒性因子，因此在含血清培养基中培养的细胞所反映的生物学特性是细胞和复杂血清因子的综合反应。在生长因子、蛋白质工程、基因表达调控等研究领域，迫切需要用无血清培养基培养细胞．无血清培养基的主要研制策略：在基础培养基中补充各种必需因子，如激素、生长因子、结合蛋白、贴壁和扩展因子等。无血清培养基由基础培养基和替代血清的补充成分组成。细胞培养基本技术

无血清培养基尚处于研究阶段，难以推广。目前，绝大多数人工合成培养基使用时还需添加血清。一般说来．含5％血清的培养基对大多数细胞可以维持细胞不死．但支持细胞生长一般需加10％血清．

血清质量好坏是实验成败的关键。常用血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。血清的灭活（消除补体活性）：56℃，30分钟细胞培养基本技术培养基的配制

RPMI-1640培养粉1袋碳酸氢钠2.0g

青、链霉素各100单位／毫升加双蒸水至1000ml,过滤除菌。

调节pH值至7.2

加血清（终浓度10％）

细胞培养基本技术培养操作基本要领和要求培养前准备：对初学者宜制定操作卡片操作野消毒：多用紫外灯洗手与着装：原则上与外科手术相同火焰消毒：启开或封闭瓶口等应烧灼注意：金属器械烧后需冷却，吸过营养液的吸管不宜烧灼操作：台面上合理布局，操作准、稳、快细胞培养基本技术原代培养细胞操作流程

过滤计数取材剪碎消化离心接种

选择消化液选择瓶或板低温、快轻、快控制时间控制转速控制密度温度时间

PH

浓度细胞培养基本技术细胞传代方法

根据细胞生长的恃点，传代方法有3种。1.悬浮生长细胞传代（干细胞）离心法传代：离心（1000rpm）去上清，加新培养液后再混匀传代。直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除l／2一2／3，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。2.半悬浮生长细胞传代（Hela细胞）此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。3.贴壁生长细胞传代采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。细胞培养基本技术贴壁生长细胞传代方法：

1.吸除培养瓶中的培养液2.加入1-2ml0.25％的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准）静置（显微镜下动态监测）。3.吸去胰蛋白酶液，加入含血清的培养液。4.用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液。5.计数，接种于新的培养瓶内。细胞培养基本技术细胞计数血细胞计数板：将计数板和一张盖玻片擦拭干净，把盖玻片覆在计数板上面，使之稍微移向一侧，露出部分计数板台面，以便滴加细胞悬液。染色：取细胞悬液9滴，台盼蓝1滴，混匀。加悬液：把计数板平放在显微镜台上，立即从计数板边缘轻轻滴1滴已染色的细胞悬液。镜下观察（如图）细胞数/ml原悬液＝4大格细胞总数/4*10000*稀释倍数细胞培养基本技术细胞计数细胞培养基本技术细胞冻存和复苏细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少人力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。细胞培养基本技术

冻存和复苏的原则：慢冻快融

当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。

如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反．结晶就大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。细胞培养基本技术慢冻程序标准程序：当温度在-25℃以上时，1～2℃/min

当温度达-25℃以下时，5～10℃/min

当温度达-100℃时，可迅速放入液氮中细胞冻存器简易程序：将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，-20℃1h,通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，6h，直接投人液氮中。细胞培养基本技术细胞冻存方法1.预先配制冻存液：含20%血清培养基

10%DMSO2.取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液,用吸管吹打制成细胞悬液（1×106～5×106细胞/ml)3.加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。细胞培养基本技术细胞复苏方法

（l）从液氮中取出冷冻管，迅速投入37～38℃水浴中，使其融化（1分钟左右）。（2）5分钟内用培养液稀释至原体积的5倍以上。（3）低速离心10分钟。（4）去上清，加新鲜培