氟西汀对海马神经元生长的影响

氟西汀对海马神经元生长的影响

【关键词】氟西汀;细胞培养;海马神

经元;大鼠

氟西汀是5-羟色胺再摄取抑制剂之一,

是应用较广的抗抑郁药。氟西汀除有抗抑郁

作用外，尚可治疗其他中枢神经系统疾病。

有研究表明，氟西汀对海马的神经保护作用

是其发挥抗抑郁效应的机制之一［1］。关

于氟西汀对体外培养的海马神经兀生长的

影响未见报道，本研究初步探讨了氟西汀对

原代培养的海马神经元生长的影响。

1材料与方法1新生大鼠海马神经元

的分离和培养

技术方法在参考文献［2］基础上加以

改进。取出生24h内的新生SD大鼠，无菌

分离出双侧海马，用显微剪剪碎，D-Hank飞

液清洗2或3次，将剪碎的海马组织转移至

离心管中，加入等量%的胰酶，37℃消化

30min,中间振摇1或2次，加入10%的

DMEM/F125ml,轻轻吹打15次，然后1000

r•min-1离心5min,制成单细胞悬液,

置于C02培养箱中，差速贴壁30min,去除

成纤维细胞，吸取未贴壁的细胞，并用200

目的不锈钢滤网过滤，收集过滤后的单细

胞悬液于培养皿中，然后至离心管中，取一

滴单细胞悬液进行计数，并用DMEM/F12将

细胞密度调到lX106m『l,然后接种于200

Ug•ml-1多聚赖氨酸包被的6孔培养板中,

转移至培养箱内培养，4h后换为无血清培

养基，即含2%B27的Neurobasl培养基，

以后每3天半量换液1次。使用培养6d的

神经元进行染色鉴定。2大鼠海马神经元的

鉴定烯醇化酶免疫细胞化学染色

取培养6d6孔培养板中的盖玻片进行

神经元特异的NSE免疫组织化学染色。弃

去培养液,4%多聚甲醛室温固定lh，加入%

H202甲醇去除内源性过氧化氢酶，%

TritonX-100破膜，10%绵羊血清封闭，加入

一抗1：200兔抗鼠NSE抗体，4c湿盒过

夜，mmol•L-1PBS清洗，加入二抗1：200

生物素化的山羊抗兔IgG,放入37℃温箱

孵育60min;mmol•L-lPBS清洗，滴

加SABC过氧化物酶复合物，37℃温箱中孵

育60min,mmol•LTPBS清洗，滴加DAB

显色液作用3〜10min,自来水冲洗后，常

规脱水，透明封片。光镜下观察NSE表达阳

性细胞。尼氏染色

6孔培养板的细胞培养7d时，取出盖玻

片进行尼氏染色。弃去培养液，

mmol-L-1PBS清洗，4%多聚甲醛室温固定

1h,mmol,LTPBS清洗3次，氯仿中1

min,95%.70%乙醇各1min,蒸僚水清洗，

置于1%甲苯胺蓝染液中染色20min,95%乙

醇分化，在显微镜下观察控制，时间以尼氏

体显示清晰为准，37c干燥，二甲苯透明，

中性树脂封片，光学显微镜下观察。

实验分组

在培养的第3天加入氟西汀，根据药物

浓度不同，将实验细胞分为5组，分别加入

1、10、20、40umol•LT氟西汀;正常

对照组加入等体积的培养基。4海马细胞

形态定量分析

倒置相差显微镜下观察加药48h后的

海马神经元形态，每组各孔随机选择20个

视野，记录每个视野内细胞长出突起的神经

元数目，目镜测微尺随机测量15个神经元

突起的长度和胞体的长径。5统计学处理

应用软件进行统计分析，各项检测结果

以x-±s表示。多组比较及组间两两比较采

用方差分析。

2结果

海马神经元形态学观察

倒置相差显微镜下观察，培养1d,细

胞绝大部分贴壁，细胞形态大小不一，以单

突起的小细胞为主。培养6d,神经元胞体

较大，突起进一步增多、延长，并形成稀疏

的网络。培养12d,神经元胞体进一步增大,

突起形成比较稠密的网络。培养24d,神经

元胞体出现空泡，部分神经元死亡，胞体崩

解，突触断裂，

海马神经元鉴定

NSE免疫细胞化学染色:染色后光镜下

观察第6天的神经细胞，胞浆和突起被染成

棕黄色为NSE抗体表达阳性细胞，以3个

视野中阳性神经元的数目占总细胞的比例

为神经元纯度，经鉴定神经元的纯度为90%。

见图2Ao

氟西汀对海马神经元形态学的影响

结果见表1和图3。不同浓度的氟西汀

对海马神经元形态学指标的影响是不同的,

10umol•LT氟西汀组海马神经元与正

常对照组相比，有突起的神经元数目增加、

最长突起长度增长；40nmol-L-1氟西

汀组海马神经元与正常对照组相比，有突起

神经元数目减少，最长突起长度及胞体长

径无显着性差异；1、20umol•LT氟

西汀组海马神经元与正常对照组相比，有

突起神经元数目、最长突起长度及胞体长

径无显着性差异。表1氟西汀对加药48h

海马神经元形态学的影响

3讨论

本实验严格控制胰酶的量和消化时间，

采用了％胰蛋白酶低浓度溶液、30min长时

间消化的方法，尽可能减少分离过程中的化

学损伤。为了避免操作过程中的机械损伤，

分离时动作轻柔，规律换药，每72h半量

换液1次，换液时速度快，以减少对神经元

生长的影响。本实验采用了差速贴壁生长，

去除了成纤维细胞，并采用B27无血清培养

基，可以选择性地促使神经元生长，抑制非

神经元的生长和繁殖[3],从而可以纯化海

马神经元。NSE是神经元分化成熟的特异性

标志酶之一，它主要表达于神经元的胞体、

轴突、树突部分[4],通过NSE免疫细胞化

学染色方法，可以鉴定体外培养的新生大鼠

海马神经元及其纯度。本实验通过NSE免疫

化学染色，发现大部分细胞胞浆和突起被染

成棕黄色，计数阳性细胞百分率为90%。尼

氏体是神经元的特征性结构之一，存在于神

经元胞体和树突内，可被碱性染料染成深色

的颗粒和斑块，它是细胞内的一种蛋白质合

成装置，可作为观察神经细胞功能状态的灵

敏指标。本实验观察到培养的海马神经元胞

质内尼氏体数量较多，说明培养的海马神经

细胞生长良好。NSE免疫细胞化学染色和尼

氏染色结果提示，本实验能培养出纯度较高、

生长良好的海马神经元。氟西汀不仅是广泛

应用的抗抑郁药，而且可以用于治疗癫痫、

偏头痛、认知障碍、焦虑障碍、儿童孤独症

等诸多神经精神疾病。目前研究认为，氟西

汀抗抑郁效应与它对海马的神经保护作用

有关，这种作用可能是通过促进海马细胞增

殖来抵抗神经元的萎缩和丢失来实现的。李

鹏等［1］研究发现，氟西汀在显着改善抑

郁大鼠抑郁行为的同时，增加了海马齿状回

神经前体细胞的数目，其增殖也增强，推

测促进海马神经元再生可能是氟西汀治疗

抑郁症的机制之一。李云峰等［5］通过慢

性应激建立小鼠抑郁模型，认为氟西汀促进

海马齿状回神经元再生可能是抗抑郁剂共

同作用机制之一，并且可能与提高海马BDNF

水平密切相关，一些临床研究的结果也提示

抗抑郁药具有神经保护作用。Santarelli

等［6］

研究发现5-HT再摄取抑制剂能部分逆

转认知功能障碍大鼠海马齿状回神经元增

殖减少及树突萎缩，并能促进海马神经元的

再生和存活。Yatte等［7］通过高分辨率

的MRI和立体定位方法测定海马容量，发现

持续性接受抗抑郁药物治疗与只在发作时

接受治疗的患者相比，海马容量无显着性降

低。

本研究首次以体外培养的新生SD大鼠

海马神经元为模型，通过细胞形态定量分析,

探讨氟西汀对海马神经元生长的影响。

Chiou等［8］通过MTT方法，发现浓度在

55umol,L-1以下的氟西汀可明显促进

海马神经干细胞存活，在20pmol-L-1时

达到高峰。根据Chiou等［8］的研究结果，

本实验选择了浓度分别为1、10、20、40

nmol-L-1的氟西汀来干预海马神经元。

结

果发现不同浓度的氟西汀对海马神经

元形态学指标的影响是不同的，10

umol•L-1氟西汀组海马神经元与正常

对照组相比，有突起的神经元数目增加、最

长突起长度增长;40nmol-L-1氟西汀

组海马神经元与正常对照组相比，有突起神

经元数目减少，最长突起长度及胞体长径无

显着性差异；1、20umol•L-1氟西汀组

海马神经元与正常对照组相比，有突起神

经元数目、最长突起长度及胞体长径无显

着性差异。结果表明氟西汀对海马神经元

生长的影响有浓度依赖性，浓度过低对海马

神经元生长的作用不明显，适当浓度可以促

进海马神经元的生长发育，浓度过高则抑制

海马神经元的生长。本实验中氟西汀浓度为

40umol,L-1即出现对海马神经元的抑

制作用，与Chiou等［8］研究结果不完全

一致，表明氟西汀对海马神经元和神经干细

胞的影响存在差异。氟西汀促海马神经元生

长的机制尚不明了，有研究［9］表明，长

期给予氟西汀后，大鼠海马神经元的脑源性

神经营养因子mRNA表达明显高于对照组,

而BDNF具有很强的刺激和促进神经细胞

生长和分化，维持神经细胞存活和正常功能

的作用，Dwivedi等［10］发现氟西汀不仅

能够增加海马BDNFmRNA的表达，还可以逆

转皮质酮导致的海马BDNFmRNA表达的降低。

据此可以推测，氟西汀促海马BDNF表达可

能是促海马神经元生长的机制之一。非营养

因子家族，包括睫状神经营养因子、胶质细

胞源性神经营养因子、成纤维细胞生长因子

等，都能促进海马神经元的生长，氟西汀是

否也可能通过上调这些因子的表达而促进

海马神经元的生长有待研究。

本实验结果提示，氟西汀可以促进新生

大鼠海马神经元的生长，这为氟西汀治疗与

海马损害有关的神经精神疾病提供实验基

础和理论依据。氟西汀促海马神经元生长的

确切机制尚待进一步探讨。

【参考文献】

[1]李鹏，涂自良，杜士明，等.氟

西汀对实验性抑郁症大鼠抑郁行为及海马

神经元再生的影响[J].医药导报，2006,

25:280-282.

[2]BrewerGandcultureofadult

rathippocampalneurons[J].JNeurosci

Methods,1997,71:143-155.

[3]BrewerGJ,TorricelliJR,

EvegeEK,etsur-vivalofhippocampal

neuronsinB27-supplementalneuron-

basal,anewserum-freemedium

combination[J].JNeurosciRes,1993,

35:567-576.

[4]SchmechelDE,BrightmanMW,

MarangosPswitchfromnon-neuronal

enolasetoneuron-specificenolase

duringdifferentiation[J].BrainRes,

1980,190:195-214.

[5]李云峰，刘艳芹，张有志，等.抗

抑郁剂对慢性应激小鼠海马神经元再生的

影响[J].中国药理学通报，2004,20:

385-388.

[6]SantarelliL,SaxeM,GrossC,

etofhipp-ocampalneurogenesisfor

thebehavioraleffectsof

antide-pressants[J].Science,2003,

301:805-809.

[7]YatteI,ShelineMD,MokhtarH,

etdepressionandhippocampalvolume

loss[J].AmJPsychi