母乳低聚糖含量的测定

1食品中低聚糖的测定第1部分：母乳低聚糖含量的测定本文件描述了牛奶、酸奶、奶粉及米粉、果泥、肉泥等食品中6种母乳低聚糖含量的测定方法。本文件的第一法适用于牛奶、酸奶、奶粉及米粉、果泥、肉泥等食品中2’-岩藻糖基乳糖（2’-FL）、3-岩藻糖基乳糖（3-FL）、乳糖-N-四糖（LNT）、乳糖-N-新四糖（LNnT）、3’-唾液酸乳糖（3’-SL）和6’-唾液酸乳糖（6’-SL）含量的测定。第二法适用于牛奶、酸奶、奶粉及米粉、果泥、肉泥等食品中2’-岩藻糖基乳糖（2’-FL）、3-岩藻糖基乳糖（3-FL）和乳糖-N-新四糖（LNnT）含量的测定。其他食品经验证后可参照本文件。本文件不适用于羊乳基的样品。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T601GB/T602GB/T603化学试剂化学试剂化学试剂标准滴定溶液的制备杂质测定用标准溶液的制备试验方法中所用制剂及制品的制备GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4第一法高效液相色谱—荧光检测器法4.1总则本方法中所用的水，在未注明其他要求时，应符合GB/T6682中一级水的规格，所用试剂，在未注明其他规格时，均指分析纯。分析中所用标准滴定溶液、杂质测定用标准溶液、制剂及制品，在没有注明其他要求时，均按GB/T601、GB/T602和GB/T603的规定制备。4.2试剂及材料4.2.1标准样品/标准物质（内标）：甘露三糖或昆布三糖，纯度≥95%。24.2.2对照品：2’-岩藻糖基乳糖（2’-FL）、3-岩藻糖基乳糖（3-FL）、乳糖-N-四糖（LNT）、乳糖-N-新四糖（LNnT）、3’-唾液酸乳糖（3’-SL）和6’-唾液酸乳糖（6’-SL），纯度≥90%。4.2.3水。4.2.4乙腈：色谱纯。4.2.5甲酸：色谱纯。4.2.625%氢氧化铵溶液：色谱纯。4.2.7二甲基亚砜（DMSO）。4.2.82-氨基苯甲酰胺（2-AB）。4.2.92-甲基吡啶硼烷。4.2.10醋酸钠：色谱纯。4.2.11冰醋酸：色谱纯。4.2.12α-淀粉酶：酶活力≥2U/mg。4.2.13β-半乳糖苷酶：来自黑曲霉，酶活力≥240U/mg，或其他等效β-半乳糖苷酶。4.2.14淀粉葡萄糖苷酶：来自黑曲霉，酶活力≥26U/mg，或其他等效淀粉葡萄糖苷酶。4.3溶液配制4.3.1内标储备溶液（1.0mg/mL）：称取50mg甘露三糖（或昆布三糖）于50mL容量瓶中，用水定容至刻度，混匀。该溶液在-18℃下可储存一年。4.3.2内标工作溶液（0.4mg/mL）：移取4.0mL内标储备溶液，置于10mL容量瓶中，用水定容至刻度，混匀。临用现配。4.3.3乳糖-N-四糖标准储备溶液（1000µg/mL称取10mg乳糖-N-四糖对照品于10mL容量瓶中，用水定容至刻度，混匀。4.3.4混合标准储备溶液：分别称取适量2’-岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基乳糖、3’-唾液酸乳糖、6’-唾液酸乳糖、乳糖-N-新四糖于同一容量瓶中，用水定容至刻度，混匀，使得其中2’-FL、3-FL浓度为1500µg/mL，LNnT浓度为1000µg/mL，3’-SL、6’-SL浓度为600µg/mL。4.3.5系列混合标准工作溶液：分别移取0.07mL、0.70mL、1.50mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL混合标准储备溶液于10mL容量瓶中，用水定容至刻度，混匀。系列混合标准工作溶液的浓度如表1。表1系列混合标准工作溶液浓度34.3.6乳糖-N-四糖系列标准工作溶液：分别移取0.07mL、0.70mL、1.50mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL乳糖-N-四糖标准储备溶液于10mL容量瓶中，用水定容至刻度，混匀。4.3.7醋酸钠缓冲液（0.2mol/L，pH4.50±0.05）：称取5.822g醋酸钠，加入7.38mL冰醋酸，再加水稀释至1000mL，醋酸或醋酸钠溶液调节pH至4.50±0.05。4.3.8淀粉葡糖苷酶溶液（70U/mL）：称取适量淀粉葡糖苷酶，加入醋酸钠缓冲液。临用现配。4.3.9混合酶溶液：称取适量淀粉葡糖苷酶、β-半乳糖苷酶于试管中，加入醋酸钠缓冲液。最终浓度分别为60U/mL和800U/mL。4.3.10乙腈水溶液：移取375mL乙腈，加入125mL水，混匀。4.3.11流动相B（甲酸铵溶液：50mmol/L，pH4.40±0.05）：向装有800mL水的烧杯中，加入2.3g±0.1g（1.89mL）100%甲酸。用25%氢氧化铵调节pH至4.40±0.05。定量转移至1000mL容量瓶中，用水稀释至刻度，混匀。4.3.12乙酸DMSO溶液（30%，体积分数分别移取3.0mL冰醋酸于10mL容量瓶中，加入DMSO稀释并定容，混匀。4.3.132-AB衍生溶液：称取286mg2-AB（精确至0.1mg）和625mg2-甲基吡啶硼烷（精确至0.1mg）于10mL烧杯中，加入6.0mL乙酸DMSO溶液，充分溶解并混匀。临用现配。4.4仪器及设备4.4.1高效液相色谱仪，配荧光检测器和柱温箱。4.4.2电子天平：感量0.1mg。4.4.3一次性水系微孔滤膜针筒过滤器：Φ0.22μm。4.4.4容量瓶：10mL、50mL、1000mL。4.4.5离心机：离心力可达10000g。4.4.6恒温水浴锅。4.4.7涡旋混匀仪。4.5参考色谱条件4.5.1色谱柱：酰胺基键合的表面多孔型硅胶色谱柱（5μm，4.6×250mm）或是同等分离效果的色谱柱。4.5.2流动相：乙腈（A）-甲酸铵溶液（B），梯度洗脱程序见表2。4.5.3流速：1.0mL/min。44.5.4激发波长：330nm。4.5.5发射波长：420nm。4.5.6进样量：10μL。4.5.7柱温：50℃。表2梯度洗脱程序4.6分析步骤4.6.1样品制备米粉、奶粉等粉状样品经混匀后，直接称取5.0g进行样品前处理；其他非粉末固体样品粉碎机粉碎后称取5.0g进行样品前处理；酸奶、牛奶等液态样品以及果泥、肉泥等糊状样品，均质后直接称取2.0g进行样品前处理。4.6.2β-半乳糖苷酶对乳糖-N-四糖酶解系数的确认按照附录A进行β-半乳糖苷酶适用性和酶解系数（fi）的确认。4.6.3样品前处理4.6.3.1奶粉等淀粉含量较低的粉末状样品称取5.00g样品（精确至0.001g）于50mL离心管中，加入30.0g水溶解后，50℃水浴下提取20min～30min，期间振荡混匀2次。冷却至室温后全部转移至100mL容量瓶中，以水定容并摇匀。根据待测组分含量二次稀释至适合的浓度范围。4.6.3.2米粉等淀粉含量较高的样品称取5.00g样品（精确至0.001g）于50mL离心管中，加入0.2g淀粉酶，再加入30.0g水溶解后，50℃水浴下酶解60min，期间振荡混匀2次。4000g离心5min后，转移上清液至100mL容量瓶中，再向离心管中加入20mL水，涡旋混匀后4000g离心5min，合并上清液至100mL容量瓶中，最后以水定容并摇匀。根据待测组分含量二次稀释至适合的浓度范围。54.6.3.3牛奶、酸奶等液体样品和果泥、肉泥等糊状样品称取2.00g样品（精确至0.001g）于50mL离心管中，加入10.0g水溶解后，50℃水浴下提取20min～30min，期间振荡混匀2次。冷却至室温后4000g离心5min，转移上清液至25mL容量瓶中，再向离心管中加入10mL水，涡旋混匀后4000g离心5min，合并上清液至25mL容量瓶中，以水定容并摇匀。4.6.4酶解分别移取200µL系列混合标准工作溶液、乳糖-N-四糖系列标准工作溶液和稀释后样品于2mL离心管中，分别加入100µL醋酸钠缓冲液以及100µL混合酶液，混匀并密封后置于60℃±2℃的水浴锅中，孵育60min，随后沸水浴2min。冷却至室温后，加入100µL内标工作溶液，混匀。4.6.5衍生移取100μL4.6.4处理后的酶解液于2mL离心管中，加入100μL2-AB衍生溶液，混匀。密封后再将试管置于60℃±2℃的水浴锅中衍生60min，随后冰水浴冷却至室温。4.6.6净化离心管中加入1.00mL乙腈水溶液，充分混匀后，静置5min。然后10000g离心10min。取约0.8mL上清液，过膜后置于进样瓶中待测。4.6.7标准曲线的绘制4.6.7.1乳糖-N-四糖标准曲线的绘制将4.6.6处理后的乳糖-N-四糖系列标准工作溶液分别进样后，乳糖-N-四糖以标准工作溶液浓度为横坐标，峰面积与内标峰面积比值为纵坐标绘制乳糖-N-四糖标准曲线。如乳糖-N-四糖酶解后产生与乳糖-N-新四糖同一酶解产物，则乳糖-N-四糖以标准工作溶液浓度为横坐标，乳糖-N-四糖产生的酶解产物峰面积与内标峰面积比值为纵坐标绘制乳糖-N-四糖酶解产物标准曲线。4.6.7.22’-岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基乳糖、乳糖-N-新四糖、3’-唾液酸乳糖、6’-唾液酸乳糖标准曲线的绘制将4.6.6处理后的系列混合标准工作溶液分别进样后，2’-岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基乳糖、3’-唾液酸乳糖、6’-唾液酸乳糖以标准工作溶液浓度为横坐标，峰面积与内标峰面积比值为纵坐标绘制标准曲线；乳糖-N-新四糖以标准工作溶液浓度为横坐标，产生的酶解产物峰面积与内标峰面积比值为纵坐标绘制标准曲线。4.6.8测定根据保留时间，对样品溶液中目标物进行定性，根据样品的峰面积与内标峰面积比值，计算目标物含量。4.7结果计算食品中2’-岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基乳糖、3’-唾液酸乳糖、6’-唾液酸乳糖、乳糖-N-四糖含量Xi，按式（1）计算：6xi·························································（1）式中:Xi——样品中2’-岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基乳糖、3’-唾液酸乳糖、6’-唾液酸乳糖、乳糖-N-四糖含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；ci——根据样品溶液与内标峰面积比值在标准曲线查得的某种目标物的浓度，单位为微克每毫升(µg/mL）；V——样品溶液的定容体积，单位为毫升（mL）；n——样品二次稀释倍数；1000——微克与毫克的换算系数；m——样品的质量，单位为克（g）；1000——克与千克的换算系数。食品中乳糖-N-新四糖含量Xj，按式（2）计算：式中:Xj——样品中乳糖-N-新四糖含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；cLNnT——根据样品溶液酶解产物与内标峰面积比值在LNnT标准曲线查得的酶解产物的浓度，单位为微克每毫升(µg/mL）；cLNT’——根据公式（1）计算得出的LNT浓度在LNT酶解产物的标准曲线查得LNT酶解产物峰面积与内标峰面积的比值，再将上述峰面积比值在LNnT标准曲线查得其代表的LNnT浓度，单位为微克每毫升(µg/mLV——样品溶液的定容体积，单位为毫升（mLn——样品二次稀释倍数；1000——微克与毫克的换算系数；m——试样的质量，单位为克（g）；1000——克与千克的换算系数。4.8结果表示试验结果以两次平行测定结果的算术平均值为准，计算结果保留小数点后两位。4.9精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值与算术平均值的比值不大于5.0%。5第二法离子色谱法5.1总则7本方法中所用的水，在未注明其他要求时，应符合GB/T6682中一级水的规格，所用试剂，在未注明其他规格时，均指分析纯。分析中所用标准滴定溶液、杂质测定用标准溶液、制剂及制品，在没有注明其他要求时，均按GB/T601、GB/T602和GB/T603的规定制备。5.2试剂及材料5.2.1无水乙酸钠：纯度≥99.0%。5.2.250%氢氧化钠溶液：色谱纯。5.2.3甲醇：色谱纯。5.2.4磺基水杨酸。5.2.5其余同4.2。5.3溶液配制5.3.1混合标准储备溶液：分别称取适量2’-FL、3-FL、LNnT于同一容量瓶中，用水定容至刻度，混匀，使得其中2’-FL、3-FL浓度为200µg/mL，LNnT浓度为100µg/mL。5.3.2系列标准工作溶液：分别移取0.05mL、0.50mL、1.50mL、2.00mL、2.50mL、5.00mL混合标准储备溶液于10mL容量瓶中，用水定容至刻度，混匀。系列标准工作溶液的浓度如表3。表3系列标准工作溶液浓度5.3.3淋洗液A：水，并通入氮气保护。5.3.4淋洗液B（0.2mol/L氢氧化钠溶液）：移取10.5mL50%氢氧化钠溶液于1000mL容量瓶中，用水定容至刻度，混匀，并通入氮气保护。5.3.5淋洗液C（0.15mol/L氢氧化钠溶液，0.5mol/L无水乙酸钠溶液称取41g无水乙酸钠于1000mL烧杯中，加入500mL超纯水，搅拌溶解后，加入7.9mL50%氢氧化钠溶液。再将上述溶液全部转移至1000mL容量瓶中，用水定容至刻度，混匀，并通入氮气保护。5.3.6磺基水杨酸溶液（100g/L称取10.0g磺基水杨酸，加水溶解并定容至100mL，混匀。临用现配。5.4仪器及设备5.4.1离子色谱仪：配有三元及以上梯度泵，脉冲安培检测器，Au工作电极。5.4.2电子天平：感量0.1mg。85.4.3水系微孔滤膜：Φ0.22μm。5.4.4容量瓶：10mL、50mL、1000mL。5.4.5离心机：离心力可达10000g。5.4.6恒温水浴锅。5.4.7涡旋混匀仪。5.4.8RP净化小柱。5.5参考色谱条件5.5.1色谱柱：可兼容梯度洗脱的高容量阴离子交换色谱柱及保护柱。5.5.2流速：1.0mL/min。5.5.3进样量：10μL。5.5.4柱温：30℃。5.5.5检测器：脉冲安培检测器，工作电极为Au电极，参比电极为Ag/AgCl或Pd。5.5.6波形：三电位或四电位波形。表4梯度洗脱程序00000005.6分析步骤5.6.1标准曲线的绘制将过膜后的系列标准工作溶液从低浓度至高浓度分别进样，并以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。5.6.2样品制备米粉、奶粉等粉状样品经混匀后，直接称取5.0g进行样品前处理；其他非粉末固体样品粉碎机粉碎后称取5.0g进行样品前处理；酸奶、牛奶等液态样品以及果泥、肉泥等糊状样品，均质后直接称取2.0g进行样品前处理。95.6.3样品前处理5.6.3.1奶粉等淀粉含量较低的粉末状样品称取5.00g样品（精确至0.001g）于100mL离心管中，加入50.0mL水溶解后，50℃水浴下提取20min～30min，期间振荡混匀2次。冷却至室温后再加入10.0mL磺基水杨酸溶液，涡旋混匀后，4000g离心5min，转移上清液至100mL容量瓶中，再加入20mL水清洗沉淀，合并上清液于容量瓶中，加水定容并摇匀。5.6.3.2米粉等淀粉含量较高的样品称取5.00g样品（精确至0.001g）于100mL烧杯中，加入0.2gα-淀粉酶，再加入50.0g水，50℃水浴下酶解60min，期间振荡混匀2次。4000g离心5min后，转移上清液至100mL容量瓶中，再向离心管中加入20mL水，涡旋混匀后4000g离心5min，合并上清液至100mL容量瓶中，最后以水定容并摇匀。5.6.3.3牛奶、酸奶等液体样品和果泥、肉泥等糊状样品称取2.00g样品（精确至0.001g）于50mL离心管中，加入10.0g水后，50℃水浴下提取20min~30min，期间振荡混匀2次。冷却至室温后再加入2.0mL磺基水杨酸溶液，涡旋混匀后，4000g离心5min，转移上清液至25mL容量瓶中，再向离心管中加入10mL水，涡旋混匀后4000g离心5min，合并上清液至25mL容量瓶中，以水定容并摇匀。5.6.4净化试样溶液依次通过0.22μm水相滤膜和活化后的净化小柱，弃去前面3倍柱体积洗脱液，收集后面洗脱液待测。5.6.5测定将待测样液进样后，根据保留时间，对待测液中目标物进行定性，根据样品的峰面积，以外标法计算目标物含量。若检测样品浓度超出线性范围，则对该样品进行二次稀释后进样检测。5.7结果计算食品中各目标物含量Xi，按式（3）计算：式中:Xi——样品中各目标物含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；ci——根据样品溶液峰面积在标准曲线查得的某种目标物的浓度，单位为微克每毫升(µg/mL）；V——试样溶液的定容体积，单位为毫升（mL）；f——样品二次稀释倍数；1000——微克与毫克的换算系数；m——试样的质量，单位为克（g）；1000——克与千克的换算系数。5.8结果表示试验结果以两次平行测定结果的算术平均值为准，计算结果保留小数点后两位。5.9精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值与算术平均值的比值不大于5.0%。（规范性）β-半乳糖苷酶的适用性及酶解系数的确认A.1原理商品化的β-半乳糖苷酶试剂含有的其他酶可能对乳糖-N-四糖有一定的酶解，本方法利用酶解前后乳糖-N-四糖峰面积的比值，确定该酶的酶解系数。A.2试剂试剂同4.2。A.3溶液配制A.3