基因工程的工具酶

基因工程的工具酶

■限制性核酸内切的

■DNA连接酶

■DNA聚合醐

■碱性磷酸酶

■末端脱氧核昔酸转移酹

限制性核酸内切酶

是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶。

是体外剪切基因片段的重要工具

限制性核酸内切前不仅是DNA重组中重要的工具，而且还可以用于基因组酶切图谱的

鉴定

防卫机制：

■任何物种都有解除异物、爱护自身的防卫机制

■人：免疫系统

■细菌：限制与修饰系统

寄主限制的限制与修饰现象

限制与修饰系统是细胞的一种防卫手段，各种细菌都能合成一种或几种能够切割DNA双链

的核酸内切酶，它们以此来限制外源DNA存在于自身细胞内，但合成这种酶的细胞自身的

DNA不受影响，因为这种细胞还合成了一种修饰酹，对自身的DNA进行了修饰，限制性

的对修饰过的DNA不能起作用。这种现象被称为寄主限制的限制与修饰现象。

限制酶（restrictionenzyme）

修饰酶（modifyingenzyme）

核酸防切位点：

既可以在3',5'-磷酸二酯键的3'酯键处（A）,

也可以在5'酯键处（B）切断磷酸二酯键

1）核酸限制性内切的的类型

2）核酸限制性内切酶的基本特性

3）同裂的和同尾酹

4）核酸限制性内切的的命名法

5）影响核酸限制性内切酶活性的因素

限制性核酸内切酶的类型及特性

依据限制酶的组成、与修怖酶活性的关系以及切断核酸的状况不同，分为三类:

1型

n型*

in型

第一类（1型）限制性内切酶：

能识别专一的核甘酸依次

并在识别点旁边的一些核昔酸上切割DNA分子中的双链

但是切割的核甘酸依次没有专一性，是随机的

这类限制性内切酶在DNA重组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析DNA结构或

克隆基因

如：&oB、EcoK等

其次类（H型）限制性内切酶：

能识别专一的核甘酸依次（回文对称依次）

并在该依次内的固定位置上切割双链

是DNA重组技术中最常用的工具的之一

这种甑识别的专一核甘酸依次最常见的是4个或6个核甘酸,少数也有识别5个核甘酸以

及7个、8个、9个、10个和11个核昔酸的

回文对称依次：有一个中心对称轴，从这个轴朝二个方向“读''都完全相同

■切割后形成具有粘性天端（cohesiveend）的DNA片段

■切割后形成具有平末端（bluntend）的DNA片段

限制酶在识别序列的对称轴上切割，形成的DNA片段没有突出的单链

第三类（III型）限制性内切险也有专一的识别依次，但不是对称的回文依次,在识别依次旁

边几个核甘酸对的固定位置上切割双链。但这几个核甘酸对不是特异性的。这种限制性内切

酎切割后产生的肯定长度DNA片段，具有各种单链末端，因此不能应用于基因克隆

同裂酶和同尾酶

■同裂酹（同切酎或异源同工前）：

两种限制性内切酶的识别核甘酸依次和切割位置都相同，有时其差别只在于当识别依次

中有甲基化的核甘酸时，一种限制性内切酶可以切割，另一种则不能。

例如：

HpaW和MspI的识别依次都是CCGG

假如其中有51甲基胞啕归则只有HpaW能够切割

■同尾酹：

有时两种酶切割序列不完全相同，但却能产生相同的粘性末端，这类酶被称为同尾醐

可以通过DNA连接酶将这类末端连接起来，但原来的酶切位点将被破坏，有时可能会产

生一个新的能切位点

如：Xba\.Nhel以及Spel切割的DNA序列不同，但均给出相同的“CTAG”粘性末端。这

些粘性末端连接后，以上的萌将不能再切割，但却产生了一个新的4核甘酸的酶切位点，即

Bfa\的酹切位点

限制性核酸内切酶的命名法

■取微生物属名的第一人字母和种名的头两个字母组成三个斜体字母加以表示，遇有

株名，再加在后面。假如同一菌株先后发觉几个不同的酶，则用罗4数字加以表示

■EcoR\

E:表示大肠杆菌属名第一个字母

co:表示种名头两个字母

R:表示菌株名

I:表示该菌中第一个被分别出来的酶

影响核酸限制性内切酶活性的因素

■反应的温度

■DNA的纯度

■溶液中离子浓度及种类

■缓冲液的pH值

■酶切时间

■DNA的分了-结构

限制性内切酶在保温过程中的活性变更(图解)

反应体系

■10XBuffer

■DNA

■酶

■H2O

留意酶的浓度：并不是加得越多越好！

依据DNA的量选取合适的酶量

1个酹单位：以20HL反应体系中反应1小时，使1UgDNA完全消化所须要的酌量

DNA末端长度对限制酶切割的影响

■限制酷切割DNA时对识别序列两端的非识别序列有长度的要求，也就是说，在识

别序列两端必需有肯定数量的核甘酸，否则很难发挥切割活性

■限制性内切酶的Staractivity

是指当酣的反应条件变更时，其在识别序列以外的位点进行切割

修饰酶-甲基化酶

乂称甲基转移酶(methyltransferase)

在真核和原核生物中存在大量的甲基化酶

试验室里大部分大肠杆菌菌株含有3个位点特异的甲基化酶：

■Dam甲基化施，由dm〃基因编码，将S-腺背甲硫氨酸的甲基基团转移到GATC中A的

N6位置上

■Dem甲基化酶，由dem基因编码,以前称Mee甲基化醐，在C5位置修饰CCAGG和

CCTGG的胞啥咤(C)残基，位点256-5l2bp出现一次

■EcoKI甲基化酶，识别AAC(N)6GTGC和GCAC(N)6GTT序列中的A的N6位

置,位点少，约8kb出现一次

■Sssl甲基化酶

从某种Dam+或Dem+的菌株中分别的DNA可能抗从自身分别的限制性内切的的切割

例如:Mbol和Sau3AI识别序列GATC

从Dam+大肠杆菌中分别到的DNA完全不受MboI的切割，但是不抗Sa“3/W

来自原核生物螺原体(Spiroplasmasp),可使CG序列中的C在C5位置上甲基化

SssI甲基化的DNA受E.coli中mcrA,mcrBC和mrr系统的限制

很多酶对此甲基化酶敏感,如：AatII,ClaI,Xho1,SalI

假如将外源DNA引入一个大肠杆菌的宿主,它可能会受宿主细胞中的限制系统的攻击

因此，消退大肠杆菌重组分子宿主菌株中的限制系统具有重要意义

(大肠杆菌的全部限制系统都集中在一个长约14kb的迁移限制区内)

某些菌株在这些基因中的某个上携带突变

如：DH5菌株在加4s基因内有突变，因此是EcoKI内切酶缺陷型的

普遍应用的菌株HB101是整个迁移限制区都缺失，因此缺乏全部的限制活性

DNA连接酶：在体外将目的基因和载体共价连接构成重组DNA分子

T4DNA连接酶

大肠杆菌DNA连接触

反应体系

■5XBuffer(10XBuffer)

■Vector

■DNAFragment

■T4DNALigase

■H2O

连接反应的温度

■平末端

16*C4-16hour

■粘性末端

16C3houror

4℃16hour

DNA聚合酶

不同种类的DNA聚合能在DNA的复制和修复中起到重要的作用

■大肠杆菌DNA聚合酶I

■Klenow大片段

■耐热DNA聚合酶

大肠杆菌DNA聚合酶I的酶活性：

1）5,一3，DNA聚合前活性

2）5，-3，DNA外切酶活性（5,端降解）

3）3,一5，DNA外切酶活性（纠错）

Klenow大片段：

大肠杆菌DNA聚合酶I经蛋白酶处理后产生的大片段活性：

1）5，-3，DNA聚合的活性

2）3,~*5，DNA外切酶活性（纠错）

耐热DNA聚合酶

来自于嗜高温的细菌，主要用于PCR反应

如：TagDNA聚合酶

VentDNA聚合的

PfuDNA聚合酶

PwoDNA聚合醉

TlhDNA聚合酹

碱性磷酸酶

■去除5,磷酸基团

■底物:DNA、RNA、脱氧核糖核甘三磷酸

■应用：a.5,端标记之前的处理

b.处理克隆载体防止载体自连

c.外源DNA片段的末端处理防止片段间的连接

目前常用的有两种：

细菌碱性磷酸酶（BAP）,耐商温，不易失活，要终止和灭活它很困难

小牛肠道碱性磷酸酶（CIP）,可在65C加热45min灭活，活性高，因此更为常用

末端脱氧核昔酸转移酶（TdT）

■从小牛胸腺中分别纯化出来的

特点：（1）不须要DN