【《滩羊肉冷藏期间生物胺含量的快速检测实证分析案例》5900字】

滩羊肉冷藏期间生物胺含量的快速检测实证分析案例目录TOC\o"1-3"\h\u1057滩羊肉冷藏期间生物胺含量的快速检测实证分析案例 115680引言 1186841.1材料与方法 1287191.1.1材料与试剂 131511.1.2仪器 2286581.1.3生物胺含量测定 254871.2结果与讨论 326801.2.1贮藏期内生物胺含量变化 3140341.2.2光谱曲线特征分析 470591.2.3预处理分析 6192821.2.4G2D-CS分析 840381.2.5提取有效波长 10159421.2.6模型效果的比较分析 1167511.3小结 13引言近年来，生物胺作为表征肉类新鲜度的敏感指标受到了越来越多的关注。生物胺按其结构可分为脂肪族、芳香族和杂环族，大多是在微生物分泌的氨基酸脱羧酶的作用下使氨基酸脱羧而产生的，是蛋白质分解变质的产物[99]。由于不同类型的肉中存在不同种类的生物胺，因此肉品新鲜度的评价往往因肉的种类而异。随着消费者对食物新鲜度和安全性的密切关注，实时检测羊肉中与腐败变质相关的生物胺含量具有重要意义。化合物的基团分子键（O-H、C-H、C-O和N-H），在近红外光谱区域受到照射时，会造成分子键振动能的改变，包括拉伸振动和弯曲振动。通过解析波形和频谱强度信息能够实现食物品质的定性或定量检测。到目前为止，使用高光谱成像技术实时监测滩羊肉中生物胺含量的可行性鲜有报道。因此，本章的主要目的是建立滩羊肉冷藏期间生物胺含量的快速检测方法。1.1材料与方法1.1.1材料与试剂标准品：丹磺酰氯、组胺（Histamine，HIS）、酪胺（Tyramine，TYR）、腐胺（Putrescine，PUT）、尸胺（Cadaverine，CAD）、苯乙胺（β-phenylethylamine，PEA）、色胺（Tryptamine，TPY）、精胺（Spermine，SPM）及亚精胺（Spermidine，SPD），上海生物科技有限公司；乙腈和丙酮（色谱纯）、高氯酸、碳酸氢钠、氢氧化钠、氨水（分析纯）、一次性针管（1ml）、滤头（0.22um），天津大贸化学试剂厂。1.1.2仪器N17E-NIR型高光谱成像系统详见2.1.2节；UFLC0303062304型高效液相色谱仪，日本岛津公司。1.1.3生物胺含量测定（1）标准溶液的配制：将色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、亚精胺、精胺标准品制成1mg/mL储备液备用。用超纯水将以上标准品储备液配成终浓度分别为0.5、1.0、2.0、5.0、10、20、50ug/mL的混合标准溶液。铝箔避光，-20℃冰箱保存。（2）样品前处理：准确称取绞碎肉样5g，加入20mL0.4mol/L的高氯酸冰浴条件下提取60s，离心取上清液（6000r/min，10min，4℃），沉淀用上述方法再提取一次。合并两次离心得到的上清液，用0.4mol/L的高氯酸定容到50mL。（3）样品衍生化：取1mL样液和混合标准溶液，加入200uL2mol/LNaOH溶液，接着加入300uL饱和NaHCO3溶液进行缓冲，然后加入2mL丹磺酰氯溶液（10mg/mL，溶剂为色谱级丙酮），40℃水浴暗反应45min后加入100uL的氨水中止反应，去除残留的丹磺酰氯溶液。最后用乙腈定容至5mL，0.22um有机滤头过滤，用于分析检测。（4）色谱条件：采用C18色谱柱在紫外检测器为254nm下进行测定，柱温：40℃，流速：0.8mL/min，进样体积：20uL，流动相：0.05mol/L乙酸铵（A相）和乙腈（B相），表1为洗脱程序。表4-1梯度洗脱程序Table4-1Gradientelutionprogramforbiogenicaminesanalysis洗脱时间/min0min6min15min25min25.1min30min流动相A/%454032105050流动相B/%5560689050501.2结果与讨论1.2.1贮藏期内生物胺含量变化由图4-1a可知，随着冷藏时间的延长，SPM和SPD含量基本无明显变化，分别维持在大约3mg/kg和2mg/kg左右。这可能是因为SPM和SPD是生肉中的天然胺，它们的形成不是由食物变质或发酵所引起的[100]。羊肉中TPY和PEA的平均含量分别为0.50-0.68mg/kg和0.47-0.53mg/kg，且它们的变化在贮藏期内是不规律的。冷藏期间HIS含量几乎保持不变，这可能是因为低温下与HIS形成有关的嗜温性细菌和组氨酸脱羧酶活性较弱[101]。PUT、CAD和TYR含量在整个贮藏期内呈现明显增加的趋势（4-1b）。前7天CAD水平没有明显的增加，羊肉还处于新鲜的状态。当冷藏时间达到第12天时，CAD含量由0.55mg/kg增加至2.37mg/kg。贮藏后期羊肉样品的变质程度加深，CAD浓度在贮藏结束时达到最大值1.54mg/kg。贮藏到第9天时，TYR水平由0.09mg/kg明显增加到1.95mg/kg，第20天时达到1.11mg/kg。整个贮藏期内PUT的浓度值变化比CAD和TYR更加明显，其最大含量为5.41mg/kg。在本研究中，随着羊肉样本腐败程度的增加，TYR、CAD和PUT的水平明显增加。因此，采用这三种生物胺（TBA）的总和来评估冷鲜羊肉的新鲜度和品质。Rokka等[102]报道TYR、PUT和CAD含量可以作为改良气调包装鸡肉的评价指标。Yang等[95]发现随着冷藏过程中熟牛肉腐败程度的加深，TYR、CAD和PUT的含量也呈现增加的趋势。然而，据报道TYR、PUT、CAD和HIS含量的总和经常被用来评估猪肉的新鲜度和肉质[86]。生物胺通常由游离前体氨基酸形成，而它们的类型和水平取决于在肉中生长的微生物菌群和数量。为了验证所建立的校正模型，采用SPXY算法按3:1的比例对整个数据集进行划分。如表4-2所示，校正集中TBA含量的均值和标准差分别为7.20mg/kg和1.74mg/kg，预测集TBA含量的均值和标准差分别为6.39mg/kg和1.61mg/kg。预测集的TBA含量（0.72-15.13mg/kg）在校正集（0.67-16.17mg/kg）范围内，有利于建立稳健的高光谱定量检测模型。图4-1贮藏期内8种生物胺含量变化情况Fig.4-1Changesofthebiogenicaminescontentsinmuttonduringrefrigeratedstorage表4-2样本集TBA含量统计Table4-2ThecontentsofTBAinchilledmuttonDatasetSamplesTBAcontents(mg/kg)MaxMinMeanStandarddeviationCalibrationset13516.170.677.201.74Predictionset4515.130.726.391.611.2.2光谱曲线特征分析如图4-2所示，滩羊肉的近红外光谱中包含丰富的分子泛音和基本分子振动的组合带，其特征是化学键的双频吸收和相对较强的吸收信号[103]。总的来说，光谱轮廓的总体分布趋势是一致的，但在整个光谱区域中反射率的大小不同。光谱差异主要归因于储藏期间羊肉样品的物理性质和化学成分发生了变化。当电磁辐射波与材料发生相互作用时，样品中不同的成分在特定的波段具有典型的反射特征。光谱吸收与肉中主要化学成分（脂肪、蛋白质、水）的含氢官能团有关。具体而言，1430nm与水键基团的O-H和N-H拉伸模式的第一个泛音有关。在1100-1400nm的光谱范围内，最突出的谱带是由C-H拉伸和变形模式引起的。此外，1600-1700nm处的特征是与脂肪有关的C-H拉伸第一个泛音的吸收带，而它们的第二个泛音出现在1200nm附近。图4-2冷鲜滩羊肉原始近红外光谱(900-1700nm)Fig.4-2OriginalNIRspectraofchilledmutton(900-1700nm)1.2.3预处理分析从高光谱图像中提取的光谱包含羊肉样本的主要信息，但也包括由光散射和可变样本属性引起的干扰信息。为了构建更加稳健的校正模型，需要采用一些数学预处理方法校正原始光谱，以去除全光谱数据中的不良信息。分别通过单一和组合预处理方法处理原始光谱数据，图4-3为六种预处理方法得到的羊肉光谱特性曲线。通过PLSR算法将光谱数据与TBA含量相关联，由表4-3可知原始光谱模型显示出评估羊肉中TBA含量的良好性能（Rc=0.89，Rp=0.87，RMSEC=2.12mg/kg，RMSEP=2.31mg/kg，RPD=2.00）。与原始光谱相比，通过MF预处理建立的预测模型具有最高的相关系数来评估TBA含量，其Rc从0.89增加到0.94，Rp从0.87增加到0.88，RMSEP从2.31减少到2.18mg/kg，并且RPD从2.00增加到2.11。MF是一种非线性信号处理技术，对光谱图像具有良好的滤波效果，并且可以保护信号的边缘使之不被模糊[104]。不适合的预处理方法有时候会造校正模型的整体性能下降。表4-3不同预处理方法的PLSR模型效果对比Table4-3ComparisonofPLSRmodelswithdifferentpretreatmentmethodsPretreatmentmethodNo.LVCalibrationsetCross-validationPredictionsetRPDRcRMSECRcvRMSECVRpRMSEPRaw130.892.120.753.180.872.312.00SG160.892.150.743.270.872.351.96MF190.941.600.763.180.882.182.11Baseline130.872.360.673.680.862.292.01Normalize60.802.870.763.110.862.401.92SG+Baseline130.842.580.703.460.892.262.04SG+Normalize150.892.130.763.150.872.312.00图4-3不同预处理方法的光谱曲线Fig.4-3Spectracurveofdifferentpretreatmentmethods1.2.4G2D-CS分析同步和异步二维相关3D立体图如图4-4a和b所示，X轴和Y轴是独立的可变轴，代表波长，相关强度Z轴为因变量轴以形成三维图形。以TBA含量为外扰，对预处理的光谱数据进行G2D-CS分析得到的同步二维相关光谱如图4-4c所示。同步相关光谱关于主对角线对称，指示两个动态频谱信号之间的协同程度，位于对角线和非对角线位置的峰分别称为自动峰和交叉峰。自动峰的强度反映了光谱信号在不同波长下受外部干扰的变化程度，交叉峰表示相应吸收峰之间的相关程度，如果相应位置没有交叉峰，则它们的吸收峰不相关。如图4-4c所示，位于对角线位置上的主要自动峰为1002、1204和1335nm，这些变量处的光谱信号对外部干扰更敏感。（1002，1204）nm，（1204，1335）nm和（1002，1335）nm处有明显的正交叉峰位于非对角位置，这表明在干扰条件下，1002、1204和1335nm处的吸收峰强度在同一方向上同时变化。异步二维相关光谱中只有交叉峰，如果两个波段（v1，v2）处的光谱特征对浓度变化有不同的响应，则交叉峰值可能会出现在异步二维相关光谱中。在异步二维相关光谱图4-4d中观察到了与同步二维相关光谱中相同位置的主要交叉峰对。由图4-4d可知，（1002，1204）nm，（1204，1335）nm和（1002，1335）nm的异步交叉峰大于0。根据交叉峰的符号，可以得出TBA含量波动引起的光谱变化遵循1002nm-1204nm-1335nm的顺序。因此，本文选择1002-1335nm光谱范围内的特征波段作为冷鲜滩羊肉中TBA含量检测的研究区域。(a)((a)(b)(c)(d)Fig.4-4Two-dimensionalcorrelationspectraofTBA:(a)Synchronous3Dstereoplot;(b)Asynchronous3Dstereoplot;(c)Synchronouscontourmap;(d)Asynchronouscontourmap1.2.5提取有效波长为降低校正模型的复杂度，需要确定携带最多特征相关信息的关键性特征波长。分别采用iVISSA、VCPA和CARS算法从全光谱（FS）和G2D-CS分析中选择最优波长，建立简化模型。iVISSA融合了全局搜索和局部搜索的功能，在提取特征波长的过程中优化变量空间以达到选择最佳变量组合的目的。iVISSA从FS中选择了52个特征波长，分别为927、957-975、1028-1031、1046、1157-1174、1216、1309-1312、1347、1365-1419、1595和1651-1678nm；从G2D-CS分析中获得了31个特征波长，分别包括1061、1028、1049-1067、1088-1094、1115-1121、1151-1157、1174-1180、1192-1198、1219-1231、1294和1309nm。VCPA方法通过随机组合的方法考虑变量之间可能存在的相互作用，利用指数递减函数策略去除一些对样本贡献较小的变量。VCPA从FS中选择的特征变量数量为10，分别包括1025、1028、1037、1106、1121、1157、1225、1374、1401和1413nm；从G2D-CS数据中提取的10个特征波长分别为1013、1028、1031、1052、1094、1121、1130、1151、1171和1231nm。CARS方法从全波段光谱中提取代表性特征变量的采样过程如图4-5所示。图4-5a展示了运行过程中，随着采样次数的增加，变量的数量下降由快（粗选）到慢（精选）。图4-5b显示了采样过程中RMSECV值的变化，RMSECV值上升是因为与TBA值相关的关键变量被消除。RMSECV值最低的最佳子集由垂直星号表示（图4-5c）。最终，CARS从FS中获得了18个特征波长，分别包括1028-1031、1115、1136、1139、1168、1264-1267、1314、1368、1416、1466、1478、1514、1550、1660、1666和1672nm。图4-6为G2D-CS-CARS算法提取有效波长的运行过程，操作方式与图4-5相同，CARS从G2D-CS分析中选择的特征变量数量为15，分别为1034、1064、1094、1106、1121、1151、1154、1168、1189、1198、1201、1225、1258、1273和1329nm。图4-5FS-CARS选择变量运行示意图：（a）所选波长变量数量的变化；（b）RMSECV值变化；（c）回归系数随采样次数增加的变化趋势Fig.4-5RunningprocessofselectingoptimalvariablesbyFS-CARSalgorithm:(a)Thechangingtrendofthenumberofselectedwavelengthvariables;(b)ThechangesinRMSECV;(c)Thetrendsintheregressioncoefficientswiththeincreaseofsamplingruns图4-6G2D-CS-CARS选择变量运行示意图：（a）所选波长变量数量的变化；（b）RMSECV值变化；（c）回归系数随采样次数增加的变化趋势Fig.4-6RunningprocessofselectingoptimalvariablesbyG2D-CS-CARSalgorithm:(a)Thechangingtrendofthenumberofselectedwavelengthvariables;(b)ThechangesinRMSECV;(c)Thetrendsintheregressioncoefficientswiththeincreaseofsamplingruns1.2.6模型效果的比较分析为了比较从FS和G2D-CS数据中选择的特征波长的实际预测能力，采用PLSR和LSSVM算法建立了校正模型，然后使用预测集样本验证校正模型的性能。表4-4总结了PLSR和LSSVM预测模型的性能。VCPA算法选择特征波长的数量低于iVISSA和CARS，但建模效果较差，这可能是因为在选择特征波段期间丢失了一些与TBA含量相关的有用信息。使用iVISSA方法，模型仍然包含许多谱带，这对计算速度产生了不利影响。CARS选择了适当的变量数量，校正集中的光谱数据被缩小为135×15（样本×变量）的小矩阵，这不仅减少了变量的冗余信息，还获得了更好的模型性能。如表4-4所示，使用CARS从G2D-CS分析中提取特征波长建立的LSSVM模型比其他方法显示出更好的性能预测羊肉中TBA含量（Rc=0.92，RMSEC=1.59mg/kg，Rp=0.91，RMSEP=1.67mg/kg，RPD=2.76）。G2D-CS-CARS-LSSVM简化模型与全光谱的LSSVM模型相比精度略有降低，但降维有利于建立的简化模型以供在线应用，也使模型更容易被解释。更重要的是，基于所获得模型的准确性和可靠性，本文表明利用CARS在G2D-CS分析中选择的有效波长进行高光谱检测技术是可行的，可以准确无损地评估羊肉中TBA含量，TBA含量的实测值与预测值的线性关系如图4-7所示。LSSVM模型更适合预测冷鲜羊肉的TBA含量，这与先前的研究相似，Kamruzzaman等发现使用HSI技术的LSSVM模型在快速预测肉制品颜色方面比PLSR模型更好更有效[34]。Cheng等研究了HSI结合化学计量学检测K值用于评估鱼片化学变质的潜力，他们发现SPA-LSSVM模型具有良好的预测能力[96]。据报道，与PLSR模型相比，LSSVM模型在评估羊肉中棕榈酸含量方面表现出较好的性能[94]。当光谱信息和因变量存在很强的非线性关系时，所建立的非线性模型的预测能力通常优于线性型。LSSVM算法是一类基于内核的学习方法，适合处理非线性关系和不同类型的复杂数据。LSSVM可以使用非线性映射函数将输入特征变量映射到高维空间，从而将优化问题转化为求解线性代数方程。此外，该方法相对于PLSR的主要优势在于，这种算法具有通用的逼近能力，在处理线性或非线性函数方面具有很大的灵活性[105]。表4-4不同波长提取方法建立的PLSR和LSSVM模型的性能Table4-4TheperformanceofPLSRandLSSVMmodelsbasedondifferentwavelengthextractionmethodsModelExtractionmethodCalibrationsetPredictionsetRPDRcRMSECRpRMSEPPLSRFS0.941.600.882.182.11FS-iVISSA0.882.280.892.162.13FS-VCPA0.842.610.882.351.96FS-CARS0.872.350.892.212.09G2D-CS0.872.270.842.561.80G2D-CS-iVISSA0.852.570.842.691.71G2D-CS-VCPA0.832.650.842.522.05G2D-CS-CARS0.842.540.852.522.83LSSVMFS0.931.520.961.101.19FS-iVISSA0.881.840.971.091.23FS-VCPA0.832.130.971.071.31FS-CARS0.872.030.921.592.90G2D-CS0.891.810.861.982.33G2D-CS-iVISSA0.891.800.881.812.55G2D-CS-VCPA0.832.050.862.012.29G2D-CS-CARS0.921.590.911.672.76图4-7生物胺测量值与预测值的关系注：A表示校正集；B表示预测集Fig.4-7RelationshipbetweenmeasuredvalueandpredictedvalueofbiogenicamineNote:A-Calibrationset;B-Predictionset1.3小结本章节探究了HSI技术与G2D-CS分析相结合快速无损检测羊肉中生物胺含量的可行性，建立了滩羊肉冷藏期间生物胺含量的光学快速检测方法，同时为解释肉样变质过程中光谱的特征变化提供了一种可