动物细胞融合技术与单克隆抗体高二下学期生物人教版选择性必修3

温故知新：动物细胞培养动物细胞培养动物细胞培养的概念和原理动物细胞培养的条件动物细胞培养的过程原理：细胞的增殖在适当的培养条件下，让这些细胞生长和增殖的技术(1)营养条件(2)无菌、无毒的环境(3)温度、pH和渗透压(4)气体环境取动物组织单个细胞细胞悬液原代培养传代培养人教版高二生物目录CONTENTS动物细胞融合技术1/单克隆抗体及其应用2/第2节

动物细胞工程目标010203结合具体实例，以流程图的形式表示单克隆抗体的制备过程。（科学探究）运用结构与功能观，理解动物细胞融合技术的原理和过程。（生命观念）说明单克隆抗体的特点及应用。（社会责任）学习目标植物体细胞杂交植物细胞融合植物组织培养温故知新：植物体细胞杂交技术问题1:植物体细胞杂交技术可以跨越不同种植物之间生殖隔离的屏障，培育出新的作物类型。那么，有没有技术让不同种动物的体细胞进行杂交，培育出集不同细胞的优势于一身的动物细胞呢？人细胞鼠细胞红色荧光染料标记的膜蛋白绿色荧光染料标记的膜蛋白细胞融合人鼠杂交细胞37°培养40min细胞融合实例：1970年人鼠细胞荧光标记融和实验现在学习：什么是细胞融合？人细胞和小鼠细胞如何融合在一起的呢？以前学习：这一实验以及相关的其他实验证据表明，细胞膜具有流动性。动物细胞融合概念原理诱导方法使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术。细胞膜具有一定的流动性一、动物细胞融合技术物理法：电融合法化学法：聚乙二醇（PEG)生物法：灭活病毒诱导法问题2:灭活病毒诱导细胞融合的原理是什么呢？一、动物细胞融合技术问题2:灭活病毒诱导细胞融合的原理是什么呢？灭活：是指用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，但并不破坏它们的抗原结构。原理：病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞相互凝集，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。细胞融合完成的标志：P49思考：19世纪30年代，科学家曾在肺结核、天花和麻疹等疾病的病人的病理组织中观察到多核细胞。如何解释这一现象？病人体内病毒等诱导多个体细胞融合形成了多核细胞。动物细胞融合结果意义运用形成具有原来两个或多个细胞的遗传信息的杂交细胞突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交成为可能。一、动物细胞融合技术第一第二第三为制造单克隆抗体开辟了新途径。研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和培育生物新品种等的重要手段。至今，种间、属间、科间，甚至动物和植物之间的细胞融合都已获得成功。实战训练

(1)与植物原生质体融合相比，动物细胞融合特有的诱导因素有聚乙二醇(PEG)、灭活的病毒(

)(2)灭活的含义是用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，但并不破坏它们的抗原结构(

)(3)二倍体动物细胞融合后的杂交细胞仍然是二倍体细胞(

)×√1.判断下列正误×二、单克隆抗体及其应用血清（抗体主要分布部位）传统抗体制备方法:向动物体内反复注射某种抗原，使动物产生多种浆细胞分泌抗体，然后从动物血清中分离所需抗体。缺陷：产量低、纯度低，特异性差血清含量有限产量低(一)传统抗体制作方法及缺陷：抗体不纯（１）动物体内产生的特异性抗体种类多达百万种；（２）每个B淋巴细胞（浆细胞）只分泌一种特异性的抗体。科学家发现：单克隆抗体体外培养时，一个B淋巴细胞不能无限增殖需解决问题：遗憾：如何解决这一难题？一个B淋巴细胞B淋巴细胞群克隆二、单克隆抗体及其应用如何获得大量、单一的抗体？单一抗体动物细胞融合融合细胞动物细胞培养单克隆抗体骨髓瘤细胞（癌细胞）能无限增殖一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体二、单克隆抗体及其应用1975年，英国科学家米尔斯坦和德国科学家科勒设计了一个极富创造性的试验方案：既能迅速大量增殖，又能产生专一抗体1975年，米尔斯坦和柯勒1984年，诺贝尔生理学或医学奖产生特定抗体的杂交瘤细胞的获得需要几次筛选？各自筛选的方法和目的是什么？会有几种细胞融合方式？杂交瘤细胞具有什么特点？单克隆抗体制备过程中为什么给小鼠注射特定的抗原蛋白？如何大规模进行培养得到大量的单克隆抗体？234

1合作探究一：请同学们自主阅读教材P48-49，小组合作思考讨论完成问题。

二、单克隆抗体及其应用单克隆抗体的制备过程：注射特定抗原从患骨髓瘤的小鼠体内取骨髓瘤细胞的培养多种已免疫B淋巴细胞骨髓瘤细胞诱导融合小鼠的脾脏中获取二、单克隆抗体及其应用多种杂交细胞2.单克隆抗体的制备过程02杂交瘤细胞（多种）置于选择性培养基上培养第一次筛选融合的细胞B细胞自身融合未融合的B淋巴细胞B瘤骨髓瘤细胞自身融合未融合的骨髓瘤细胞2.单克隆抗体的制备过程B瘤B瘤第一次筛选：用特定的选择培养基，在该培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长。二、单克隆抗体及其应用(三)单克隆抗体的制备过程：第二次筛选：得到能产生所需抗体的杂交瘤细胞

克隆化培养二、单克隆抗体及其应用(三)单克隆抗体的制备过程：第二次筛选：得到能产生所需抗体的杂交瘤细胞

克隆化培养抗原4二、单克隆抗体及其应用(三)单克隆抗体的制备过程：第二次筛选：得到能产生所需抗体的杂交瘤细胞

抗体检测

利用抗原--抗体杂交技术抗体检测呈阳性二、单克隆抗体及其应用(三)单克隆抗体的制备过程：第二次筛选：得到能产生所需抗体的杂交瘤细胞

利用抗原--抗体杂交技术第二次筛选获得产生专一抗体的杂交瘤细胞使用96孔板培养和筛选杂交瘤细胞，每一个孔尽量只接种一个杂交瘤细胞，即将单个杂交瘤细胞单独培养，通过多次克隆化培养和抗体检测，即可获得大量能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。96孔板培养和筛选抗体检测原理：抗原和抗体能够特异性结合第二次筛选获得产生专一抗体的杂交瘤细胞抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞体外培养单克隆抗体体内或体外培养2.单克隆抗体的制备过程注射到小鼠腹腔项目腹腔培养体外培养优点缺点易于控制培养条件（如无需提供无菌环境等），操作简单，成本较低规模小，产量少可大规模培养，大量生产需要人为控制培养条件，成本相对较高二、单克隆抗体及其应用(三)单克隆抗体的制备过程：①技术：动物细胞融合、动物细胞培养2.单克隆抗体的制备过程（9）应用到的细胞工程技术及原理②原理：细胞膜具有一定的流动性、细胞增殖（1）能准确地识别抗原的细微差异，与特定抗原发生特异性结合。（2）可以大量制备。二、单克隆抗体及其应用3.单克隆抗体的优点单克隆抗体杂交细胞杂交瘤细胞体外或体内培养第一次筛选骨髓瘤细胞

诱导融合分泌特异抗体的杂交瘤细胞杂交瘤细胞群提取已免疫的B淋巴细胞动物细胞融合技术动物细胞培养技术特异性强灵敏度高可大量制备注射抗原二、单克隆抗体及其应用单克隆抗体的制备小结选择性培养基上培养第二次筛选克隆化培养抗体检测既能大量繁殖又能产生专一抗体二、单克隆抗体及其应用单克隆抗体的制备小结（1）该过程中应用到的技术_______________________________________（2）原理_______________________________________（3）注射特定抗原的目的______________________________________________（4）诱导融合的方法______________________________________动物细胞特有的诱导融合方法为_______________________动物细胞融合、动物细胞培养细胞膜具有一定的流动性、细胞增殖用特定的抗原对小鼠进行免疫，并从该小鼠的脾中得到能产生特定抗体的B淋巴细胞PEG融合法、电融合法、灭活病毒诱导法灭活病毒诱导法（5）第一次筛选的目的______________________

第一次如何筛选___________________________

筛选原理_________________________________________________________________________________筛选获得杂交瘤细胞用特定的选择培养基进行筛选在选择培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长二、单克隆抗体及其应用单克隆抗体的制备小结（6）杂交瘤细胞的特点__________________________________（7）第二次筛选的目的________________________________________________如何筛选___________________________________________________选择抗体检测呈___性的杂交瘤细胞，即_____________

_____________（8）抗体检测原理_______________________________________获得足够数量的能分泌所需抗体的杂交瘤细胞进行克隆化培养和抗体检测（进行多次筛选）分泌的抗体能与特定的抗原结合抗原和抗体能够特异性结合(分子水平的鉴定）既能迅速大量增殖，又能产生抗体（9）如何获取大量所需杂交瘤细胞__________________________________________（10）如何获取单克隆抗体①体外培养___________________________②小鼠腹腔内培养_________________________（11）单克隆抗体的优点______________________________________________________________________________在体外条件下大规模培养（接种于培养液中）或注射到小鼠腹腔内增殖从细胞培养液中获取从小鼠腹水中获取能准确地识别抗原的细微差异，与特定抗原发生特异性结合，并且可以大量制备阳2．新型冠状病毒可通过表面的刺突蛋白（S蛋白）与人呼吸道黏膜上皮细胞的ACE2受体结合，侵入人体，引起肺炎。单克隆抗体可阻断病毒的粘附或入侵，抗体药物的研发已成为治疗新冠肺炎的研究热点之一。下图为筛选、制备抗S蛋白单克隆抗体的示意图。下列相关叙述，正确的是（）A．研制抗S蛋白单克隆抗体，需先注射刺突蛋白对小鼠进行免疫以获得相应抗体B．在产生免疫反应的小鼠脾脏细胞中提取B淋巴细胞并诱导其与骨髓瘤细胞融合C．经HAT培养基筛选得到杂交瘤细胞经克隆化培养后可直接用于单克隆抗体的生产D．单克隆抗体可用来治疗癌症的原因是单克隆抗体能杀伤癌细胞B3．将由2种不同的抗原分别制备的单克隆抗体分子，在体外解偶联后重新偶联可制备双特异性抗体，简称双抗（如图）。下列说法错误的是（

）A．该过程涉及细胞融合、选择培养基筛选等过程B．单抗也可以与药物、细胞因子等交联，用于靶向治疗肿瘤C．筛选双抗时需使用制备单克隆抗体时所使用的2种抗原D．同时注射2种抗原可得到产双抗的B细胞D植物体细胞杂交动物细胞融合原理细胞融合前的处理方法诱导细胞融合的方法细胞融合成功的标志主要用途意义细胞膜具有一定的流动性、植物细胞的全能性细胞膜具有一定的流动性用果胶酶和纤维素酶去除细胞壁用胰蛋白酶或胶原蛋白酶使细胞分散成单个细胞电融合法、离心法；聚乙二醇（PEG）融合法、高Ca2+-高pH融合法PEG融合法、电融合法、灭活病毒诱导法再生出细胞壁细胞核的融合获得完整的杂种植株主要用于制造单克隆抗体打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育植物新品种突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能9.植物体细胞杂交和动物细胞融合比较①筛选杂交瘤细胞，一般用HAT培养基，由次黄嘌呤（H）、氨基蝶呤（A）、胸腺嘧啶核苷（T），3种关键成分配制而成。②哺乳动物细胞中合成DNA途径有两条：一条是从头合成途径（简称D途径），氨基蝶呤可以阻断细胞利用D途径合成DNA；一条是补救途径（简称S途径），该途径需要次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK），这两种酶可以催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷用来合成DNA。③骨髓瘤细胞是经过人工筛选的基因缺陷型细胞，缺乏HGPRT、TK。当它处于HAT培养基中，合成DNA的D途径被氨基蝶呤阻断。同时，它由于缺乏HGPRT和TK，所以不能利用S途径合成DNA，会很快死亡。④杂交瘤细胞从B淋巴细胞中获得了HGPRT和TK，可以利用S途径来合成DNA。第一次筛选获得杂交瘤细胞细胞合成DNA有D和S两条途径B淋巴细胞及同型融合细胞不能无限增殖，死亡骨髓瘤细胞及同型融合细胞不能合成DNA，死亡杂交瘤细胞能无限增殖，生长B淋巴细胞合成DNAS途径D途径不能分裂增殖骨髓瘤细胞合成DNAD途径能无限增殖一般用HAT培养基筛选出杂交瘤细胞，其中氨基喋呤阻断D途径。第一次筛选获得杂交瘤细胞骨髓瘤细胞是经过人工筛选的基因缺陷型细胞，缺乏HGPRT、TK。二、单克隆抗体及其应用1.作为诊断试剂——最广泛的应用抗人绒毛促性腺激素单克隆抗体比原来诊断方法提前了10d左右，准确率在90﹪以上。具有准确、高效、简易、快速特点诊断优点：（1）广泛用作诊断试剂：例如，利用同位素或荧光标记的单克隆抗体在特定组织中成像的技术，可定位诊断肿瘤、心血管畸形等疾病。4.单克隆抗体的应用结合荧光标记的单克隆抗体药物结合同位素的单克隆抗体药物优点：准确、高效、简易、快速。2.用于治疗疾病和运载药物细胞凋亡ADC的作用机制示意图①ADC被细胞吞噬②⑤ADC抗体药物接头单克隆抗体+接头+药物（如细胞毒素）=ADC实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤。2.用于治疗疾病和运载药物脂质体给药高效

低毒

靶向抗肿瘤药物载体：阿霉素脂质体和顺铂脂质体已在国外上市。（3）用于治疗疾病：单克隆抗体药物已被广泛用于肿瘤、自身免疫病等疾病的治疗，如利妥昔单抗被用于治疗复发难治的低分化B细胞淋巴瘤；曲妥珠单抗被用于治疗乳腺癌等。4.单克隆抗体的应用优点：位置准确、疗效高、毒副作用小。思考

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讨论讨论1：ADC的抗体和药物各具有什么作用？抗体主要发挥靶向运输作用，即通过特异性结合靶细胞表面的抗原，将连接的药物输送到靶细胞；药物发挥治疗效应，如杀伤靶细胞。二、单克隆抗体技术及其应用4.单克隆抗体的应用讨论2：除了细胞毒素，还有哪些物质理论上可以作为ADC偶联的药物？①

可以用放射性同位素标记单克隆抗体进行靶向放疗；②

一些作用于细胞信号转导通路的药物可以通过阻断肿瘤细胞的信号通路来抑制其生长，理论上也可以将这些药物与单克隆抗体结合进行治疗。思考

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讨论二、单克隆抗体技术及其应用4.单克隆抗体的应用讨论3：单克隆抗体诊断试剂盒和ADC在临床应用上各具有什么优势？思考

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讨论二、单克隆抗体技术及其应用4.单克隆抗体的应用①

单克隆抗体诊断试剂盒中的单克隆抗体只与特定的抗原反应，因此检测的特异性和灵敏度大大提高；生产单克隆抗体的杂交瘤细胞可以传代培养、冷冻保存和复苏利用，有利于控制产品的质量和标准化生产诊断试剂盒；②

ADC能够协同发挥抗体特异性识别的靶向作用和细胞毒素对肿瘤细胞的杀伤作用，因此它在临床上具有靶点清楚、毒副作用小等优点。讨论4：你可以课后搜集资料，单克隆抗体在临床上还有哪些应用？思考

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讨论二、单克隆抗体技术及其应用4.单克隆抗体的应用单克隆抗体在临床上的应用涉及治疗、诊断等方面。①单克隆抗体药物已被广泛用于肿瘤、自身免疫病等疾病的治疗，如利妥昔单抗被用于治疗复发难治的低分化B细胞淋巴瘤；曲妥珠单抗被用于治疗乳腺癌等。②在临床诊断方面，单克隆抗体被广泛用于一些感染性疾病的检测、肿瘤的诊断、激素和细胞因子的测定等。以单克隆抗体在诊断肿瘤方面的应用为例，用放射性同位素或荧光标记抗肿瘤表面抗原的单克隆抗体，可以用这些抗体来对体内的肿瘤进行定位，辅助诊断并确定肿瘤的复发与转移等。A.单克隆抗体制备过程中通常将免

疫后得到的B淋巴细胞与骨髓瘤

细胞融合B.用96孔板培养和多次筛选杂交瘤细胞后，在体外大规模培养可获得单克隆抗体C.ADC通过抗体与细胞膜上的受体特异性结合，以主动运输的方式进入肿瘤细胞D.ADC在肿瘤细胞里被溶酶体裂解，释放药物，使肿瘤细胞死亡实战训练

4.抗体—药物偶联物(ADC)通过采用特定技术将具有生物活性的小分子药物连接到能特异性识别肿瘤细胞的单克隆抗体上，实现对肿瘤细胞的选择性杀伤。ADC的结构及其发挥作用的机理如图所示，下列有关说法错误的是()C5.如图是一种“生物导弹”的作用原理示意图，没有与肿瘤细胞结合的“生物导弹”一段时间后被机体清除。阿霉素是一种抗肿瘤药，可抑制DNA和RNA的合成，对正常细胞也有一定毒性。下列说法不正确的是()A.单克隆抗体是由杂交瘤细胞合成和

分泌的B.活化阿霉素能抑制细胞中的DNA复

制和转录过程C.在治疗中，应先注射非活化