人工细胞工厂设计构建 课件 第5章 人工细胞工厂测试

第5章人工细胞工厂测试5.1概述5.2微流控分选技术

5.3仪器分析技术人工细胞工厂测试5.1概述人工细胞工厂测试5.1.1细胞工厂性能5.1.2常规培养筛选技术5.1.3微孔板培养筛选技术5.1.4高通量培养分选技术人工细胞工厂测试产量：指人工细胞工厂中生产目标产品的总量，一般按单位体积的产品质量表示或摩尔数表示。得率：指初始原料转化为目标产品的比例，通常以百分比或摩尔比来表示。高得率意味着原料利用率高，废物少，环保压力轻。生产速率：指人工细胞工厂生产目标产品的速度，一般以单位时间内单位体积的质量表示，即时空产率。高生产速率意味着生产周期短，生产效率高。人工细胞工厂生产性能的表征指标：概述5.1.1细胞工厂性能质量：指人工细胞工厂生产目标产品的纯度特性。满足产品的法定质量标准，并确保产品的安全性和有效性。稳定性：指人工细胞工厂具有遗传稳定性和发酵环境中的鲁棒性。微生物细胞工厂要具有抗各种胁迫的性能，包括高浓度底物（葡萄糖、抑制物）、中间代谢物、高浓度产物、胞内微环境(酸胁迫、氧胁迫等)和胞外微环境(盐胁迫、温度胁迫、压强胁迫等)，在发酵中表现良好。经济性：指人工细胞工厂的生产成本和经济效益。优秀的人工细胞工厂应该能够在合理的生产成本范围内实现高产量、高生产速率、高得率和高质量，从而在经济上是可行和可持续的。5.1.1细胞工厂性能人工细胞工厂测试概述摇瓶培养：传统液体培养方式。将菌种接种在摇瓶中，置于摇床内，控制温度，通过摇动来保持供氧、细胞悬浮、营养均匀传质。平板培养：常见的固体培养方式。将菌种接种在固体平板上，置于恒温培养箱内，静止培养。小型反应器培养：介于摇瓶和大型生物反应器之间的一种培养方式，通常容积在ml到L级别。提供氧气和养分传输，具备一定的扩展性，在一定程度上模拟大规模生产的条件。摇瓶培养和平板培养简单，适合小规模实验和初步筛选。小型反应器常用于人工细胞工厂工艺优化研究，为大型发酵工艺提供资料和放大数据。人工细胞工厂测试5.1.2常规培养筛选技术概述微孔板培养是一种高通量的培养方式，在0.1ml到1mL的微孔中培养细胞，以实现对不同细胞或条件的并行处理。每个微孔板的孔数从几十至数百不等。目常见的孔板有24、48、96、384孔板，在一些超高通量筛选过程中会用到1536或3456孔板。优点：具有高度自动化、高通量、低耗材和少样品消耗的特点，在短时间内进行大规模的筛选和优化，适用于高效的生产和高通量的表征研究。缺点：溶氧水平较低、混合效果较差，蒸发效应和热效应较严重，常常导致菌种生长状况差，且差异性大。人工细胞工厂测试5.1.3微孔板培养筛选技术概述微流体培养：基于微尺度通道和微流体控制技术的培养方式。提供高度均质的培养条件，如精确的流速、温度、气体含量等，实现对细胞的高度精准控制和实现高通量处理的目的。特别适用于对细胞进行高度精确的表征、分选和优化。液滴微流控：利用互不相溶的两相产生分散的微液滴并对微液滴进行操作的非连续流微流控技术。微液滴具有体积小、比表面积大，独立无交叉污染等优点，再结合液滴可操控性强以及高通量等优势，可用于微生物的高通量培养、进化和筛选等方面。人工细胞工厂测试5.1.4高通量培养分选技术概述技术通量功能FACS约105细胞/s分选FADS约104液滴/s培养+分选Droplet-FACS

培养+分选GelFACS3000液滴/s培养+分选RADS260细胞/min培养+分选

微生物细胞工厂的高通量表征和筛选技术人工细胞工厂测试概述5.2微流控分选技术人工细胞工厂测试5.2.1荧光激活细胞分选5.2.2荧光激活液滴分选5.2.3拉曼激活单细胞液滴分选微流控分选技术荧光激活细胞分选（Fluorescence-activatedcellsorting，简称FACS)：一种超高通量技术的流式细胞术，用于从混合细胞群中分离特定类型的细胞。根据每个细胞的特定光散射和荧光特性，FACS将生物细胞的异质混合物分选到多个容器中，一次一个细胞。FACS可应用于分选细胞内荧光信号的或膜结合的产物，对于分泌到胞外产物的细胞工厂，难以应用。5.2.1荧光激活细胞分选人工细胞工厂测试FACS是根据细胞大小、形状和表面标记、内部结构等进行分选的，其主要输出测量值是前向散射、侧向散射和荧光信号三个。根据细胞的粒度进行类选：颗粒度较高的细胞进入侧向散射高通道中，颗粒度较小的细胞进入侧向散射低通道中。根据荧光强度对每个细胞施加电荷，以便细胞在离开流动室时被分选为不同的组。分选后的细胞群被收集在试管或96孔平板中，进一步分析。微流控分选技术5.2.1荧光激活细胞分选人工细胞工厂测试荧光激活液滴分选（Fluorescence-activateddropletsorting，简称FADS)：是集成了液滴微流控和细胞分选技术的双重优点而开发的设备，加速了合成生物学检测的环节，使得设计和合成通量相匹配，具有重要应用潜力。FADS的工作原理是单个细胞被分割在乳液液滴中，根据液滴的特定光散射和荧光特性，进行分选。FADS还能够在微型液滴中进行酶反应，并通过荧光信号对酶活性进行高速定量分析和分选，从而应用于超高通量酶活筛选。即可用于胞内酶活性，也可用于细胞表面展示酶活性的筛选。微流控分选技术5.2.2荧光激活液滴分选人工细胞工厂测试经过表型检测分选后，单个细胞仍被包裹在单个液滴中，保持独立性，并能与下游单细胞培养、测序等组学研究无缝衔接。拉曼激活单细胞液滴分选（Raman-activatedsingle-celldropletsorting，简称RADS）是耦合单细胞拉曼光谱技术与液滴微流控技术，能够在无标记、无损的前提下测定活细胞固有的化学组成。采用介电液滴分选技术，RADS 系统是目前已报道全谱分选通量最高的 RACS 系统（Raman-activatedCellSorting，RACS），每分钟通量达数百个细胞。RADS保持了细胞的活力，促进了与下游操作(如单细胞测序和培养)的无缝耦合。RADS的分选通量主要受限于拉曼检测而非系统本身，通过与高灵敏拉曼检测技术（如受激拉曼等）耦合，可实现超高通量分选。微流控分选技术5.2.3拉曼激活单细胞液滴分选人工细胞工厂测试5.3仪器分析技术细胞工厂测试5.3.1高通量质谱技术5.3.2液质联用技术5.3.3光谱技术质谱：测量离子的质量电荷比（m/z）和丰度，由质谱图产生化学相关信息，可用于代谢物的结构定性和产量的定量分析中。原理：质谱仪由耦合到质量分析仪和检测器的电离源组成。离子源将样品分子作为带电离子转移到气相中，然后转移到质量分析仪中。离子根据其m/z分离并检测，从而产生质谱。由于不仅记录了m/z，还记录了检测到的离子数量，因此质谱可以是一种高度定量的技术，线性范围高达~105。仪器分析技术5.3.1高通量质谱技术人工细胞工厂测试四极杆四极杆代表性高通量质谱技术三重四极杆质谱仪：以四极杆质量选择器为主要质量分析的质谱仪，通过将四根极杆分为两组，分别对其施加反相射频高压，离子会根据电场进行振荡，根据设定电压形成指定的电场环境，只有特定荷质比的离子可以稳定地通过电场。四极杆质谱对于简单组分的定性以及定量分析具有一定的实际意义，目前主要与气相色谱技术联用。声波激发耦合质谱系统(EchoMS)：它结合了开放端口接口（OPI）和声学液滴喷射（ADE）两方面的优势。使用声音传感器将超声波脉冲聚焦在少量移动流体样品(通常是纳升级别)上，而无需任何物理接触，从微孔板(96、384或1536)喷射出液滴。液滴被分配到开放端口，再被转移到SCIEX质谱仪离子源进行质谱分析。仪器分析技术5.3.1高通量质谱技术人工细胞工厂测试液质联用（LiquidChromatography-MassSpectrometry，简称LC-MS）是以液相色谱作为分离系统，质谱为检测系统。原理：基于高效液相色谱对于复杂样品的高分离能力得到相对单一的化合物，被离子化后，经质谱的质量分析器将离子碎片按质量数分开，经检测器得到质谱图。结合已知结构化合物的裂解规律，对未知成分进行定性分析，用于分离、鉴定和定量分析复杂的化学和生物样品。仪器分析技术5.3.2液质联用技术人工细胞工厂测试在人工细胞工厂中的应用产品鉴定与定量：用于分析人工细胞工厂产生的目标化合物，对产品进行鉴定和定量分析。底物和中间产物分析：用于监测和分析人工细胞工厂生产过程中的底物消耗和中间产物积累情况，从而帮助优化生产过程，改善产物得率和生产速率。代谢产物分析：用于研究人工细胞工厂的代谢途径和产物谱系，从而深入了解细胞工厂的代谢产物组成和产物变化规律，指导生产过程的优化和产物结构的调整。仪器分析技术5.3.2液质联用技术人工细胞工厂测试不同的液相色谱和质谱检测器联用液相色谱-离子阱质谱：适用于三萜、甾体类分子结构的局部分析。但是存在稳定性差、动态范围窄、质量歧视效应难以规避及软件适配度差等问题。液相色谱-飞行时间串联质谱：分析三萜和甾体及其皂苷的常用方法，在色谱分辨能力上往往不足以分离分子量近似的化合物。由于只能形成二级碎片，对于未知结构化合物的解析尚有不足。液相色谱-三重四极杆质谱：在保留了原四极杆质谱的强定量能力的基础上，提供了串级功能，使质谱的定性能力和效率进一步加强。除一般离子扫描功能外，还具有SＲM、MＲM、母离子扫描等功能，且MSM信噪比也有了明显提高，这对特征基团的结构研究有很大帮助。但在分辨率方面仍有不足，近似m/z离子的干扰比较大。液相色谱－离子淌度质谱：在异构体分析方面具有极大的优势，但缺乏离子迁移主要标准，分析速度受迁移率与质谱仪间界面效率的限制。仪器分析技术5.3.2液质联用技术人工细胞工厂测试光谱检测仪器都由光源、单色器、检测器和信号指示系统等部分组成。仪器分析技术5.3.3光谱技术人工细胞工厂测试光源的功能是发射被测元素的特征共振辐射，供测量用。原子化系统将试样中待测元素变成气态的基态原子。入射狭缝出射狭缝反射镜色散元件单色器：将所需要的共振吸收线分离出来检测系统光电元件：一般采用光电倍增管，其作用是原子蒸气吸收和单色器分光后的微弱信号转换成电信号放大器：它的作用是将光电倍增管输出的电压信号放大后送入显示装置，放大后的信号经对数转换器转换成吸光度信号，经过计录仪电脑直接打印进行读数。显示装置仪器分析技术5.3.3