人工细胞工厂设计构建 课件 第6章 人工大肠杆菌细胞工厂

第6章人工大肠杆菌细胞工厂6.1概述6.2常用元件与构建工具

6.3琥珀酸细胞工厂6.4L-苯丙氨酸细胞工厂6.51,4-丁二醇细胞工厂6.6异戊二烯细胞工厂人工大肠杆菌细胞工厂6.1概述概述大肠杆菌细胞工厂6.1.1细胞结构与功能布局6.1.2基因组与遗传特点6.1.3生理与代谢特点6.1.4应用与进展细胞结构与功能布局大肠杆菌包膜结构脂多糖基因组密码子6.1.1细胞结构与功能布局生物学分类大肠杆菌

（Escherichiacoli），又称大肠埃希氏菌，属于细菌界、变形菌门、γ-变形菌纲、肠杆菌目、肠杆菌科、埃希氏菌属、大肠种。常见的底盘菌株人工细胞工厂的应用领域：大肠杆菌K-12的衍生菌株，如MG1655、W3110、BW25113等。重组蛋白质和酶的表达与生物制药领域：大肠杆菌B的衍生菌株，如BL21（DE3）、BL21（DE3）pLysS、BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL等。细胞结构与功能布局大肠杆菌包膜结构脂多糖基因组密码子6.1.1细胞结构与功能布局大肠杆菌的细胞结构与功能拟核、细胞质和包膜组成。拟核是浓缩1000倍的基因组，无核膜包裹，占细胞体积约15%。细胞质呈浆状，含有mRNA、tRNA、核糖体、蛋白质、酶等，是生化反应的主要场所。包膜由细胞膜、胞壁质和外膜组成，维持着细胞的杆状形态。细胞膜由含蛋白质的磷脂双分子层组成，具有选择通透性，调节细胞内外物质交换。大肠杆菌包膜结构周质细胞质细胞结构与功能布局大肠杆菌包膜结构脂多糖基因组密码子6.1.1细胞结构与功能布局大肠杆菌的脂多糖结构脂多糖：脂质A（内毒素）、非重复性核心寡糖和寡糖重复单元，每个重复单元含有2-7个常见和稀有糖残基及其衍生物。脂多糖具有抗原性，称为O抗原，主要成分是由寡糖重复单元组成的多糖。目前鉴定了170余种O抗原。外膜的其他多糖或荚膜多糖也能产生抗原，称为K抗原，已鉴定了80余种K抗原。O-抗原非重复核心寡糖单元脂质A细胞结构与功能布局大肠杆菌包膜结构脂多糖基因组密码子6.1.1细胞结构与功能布局常见工程菌株的抗原性大肠杆菌MG1655：脂多糖合成基因簇中wbbL基因被IS5插入序列破坏失去功能，没有Ｏ抗原，不具备入侵性和致病性。大肠杆菌K-12：没有orfX基因，荚膜多糖合成基因簇不完整，不能合成柯拉酸(colanicacid，荚膜异多糖酸)，没有荚膜，不能产生K抗原。具有鞭毛蛋白基因（fliC），产生H48抗原。大肠杆菌B系列菌株：脂多糖合成基因wbbD被IS1插入序列破坏，没有O抗原。鞭毛生物合成基因簇被敲除，没有鞭毛，不具运动性。II型荚膜生物合成基因kfiB被IS1插入序列所阻断，不能形成荚膜，没有K抗原。基因组与遗传特点大肠杆菌基因组密码子6.1.2基因组与遗传特点大肠杆菌MG1655的基因组是一条环形双链DNA。MG1655基因组为4,641,652bp，编码基因4493个，预测编码蛋白质4314个。大肠杆菌W3110基因组为4,646,332bp，编码基因4510个，预测编码蛋白质4331个。大肠杆菌MG1655和W3110基因组中4453个基因是相同的，都编码22个rRNA基因，86个tRNA基因，其中1个转运硒代半胱氨酸。2403个基因的功能已经被实验证实，占54.1%；预测的功能基因1425个，占32%；616个基因未知功能，占13.9%。绝大部分蛋白质分布在细胞质（2885种，占76.3%）中，其他分布在内膜(670种，占17.7%)、外膜(87种，占2.3%)和周质空间(138种，占3.7%)。结构基因单拷贝、rRNA基因多拷贝，功能相关的结构基因形成操纵子，重复序列少而且短。编码密度高，平均每1000bp左右编码1个基因。基因组与遗传特点大肠杆菌氨基酸密码子频率(‰)tRNA基因数氨基酸密码子频率(‰)tRNA基因数氨基酸密码子频率(‰)tRNA基因数氨基酸密码子频率(‰)tRNA基因数L-苯丙氨酸UUUUUC22.216.502L-酪氨酸UAUUAC16.112.203L-半胱氨酸UGCUGU6.45.110L-蛋氨酸AUG27.86L-色氨酸UGG15.21L-组氨酸CAUCAC13.09.801L-天冬氨酸GAUGAC32.219.103L_天冬酰胺AACAAU21.617.640L-脯氨酸

CCGCCACCUCCC23.48.47.05.51101L-谷氨酰胺CAGCAA29.015.422L-谷氨酸GAAGAG39.718.040L-赖氨酸AAAAAG33.610.360L-缬氨酸

GUGGUUGUCGUA26.318.215.310.90025L-丙氨酸

GCGGCCGCAGCU33.925.720.115.20230L-甘氨酸

GGCGGUGGGGGA29.824.711.07.94011L-苏氨酸

ACCACGACUACA23.514.48.86.92101L-亮氨酸

CUGUUAUUGCUCCUUCUA53.113.813.611.111.03.8411101L-丝氨酸

AGCUCGAGUUCCUCUUCA16.18.98.78.68.47.0110201L-精氨酸

CGCCGUCGGCGAAGAAGG22.321.05.43.52.01.1041011L-异亮氨酸

AUUAUCAUA30.425.24.2032终止密码子UAAUGAUAG2.00.90.2000大肠杆菌中64个遗传密码子的使用频率分布，稀有密码子：20个密码子的使用频率低于1%基因组与遗传特点大肠杆菌基因组是双向等速复制，从复制原点（oriC）开始基因转录与蛋白质翻译偶联，都发生在细胞质中，而蛋白质的修饰和分泌发生在细胞膜上转录和翻译几乎同步，一边转录、一边翻译。在细胞质中，一旦有核糖体结合在新生RNA上，开始翻译。6.1.2基因组与遗传特点生理与代谢特点大肠杆菌生理特性：兼性厌氧生长。好氧条件下生长快，厌氧条件下生长较慢。碳源：各种糖类：葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、木糖等糖类。不能利用淀粉、纤维素、脂肪、长链烷烃等碳源，能利用蛋白胨作为碳源。碳代谢物分解阻遏效应：不能同时利用葡萄和其他糖类，葡萄糖消耗完后，再利用另一种单糖，并表现为二次生长现象。氮源：各种氮源、硝基氮、铵盐、酵母粉等。生长生理与代谢特点大肠杆菌基本生长条件：生长温度范围16-46℃，适宜温度为37℃，最高在42-44℃下仍能生长。大肠杆菌较耐热，60℃下15分钟才能灭活。大肠杆菌生长的适宜pH值偏碱性，范围为pH6.5-8.0。生长裂殖繁殖方式：裂殖方式进行分裂，其细胞周期包括3个阶段第一阶段是从新生细胞到染色体起始复制，B期第二阶段是染色体复制期，C期第三阶段是染色体复制结束到细胞完成分裂，D期应用与进展大肠杆菌主要应用产品：有机酸、氨基酸、短链醇及其衍生物等的生产。产品产量g/L得率g/g葡萄糖年份D-乳酸1850.942016琥珀酸119.21.0820221,3-丙二醇135-20031,4-丁二醇1250.402016苏氨酸82.4

2007缬氨酸84.00.412020苏氨酸116.620.4862020丙氨酸1550.952011赖氨酸193.60.742020苯丙氨酸72.90.2592018色氨酸48.60.2182013色氨酸52.10.1712022酪氨酸55.540.252020组氨酸66.50.232020异戊二烯24.00.26720166.2常用元件与构建工具大肠杆菌细胞工厂6.2.1常用元件6.2.2常用质粒6.2.3遗传转化方法6.2.4构建工具常用元件与构建工具常用元件表达元件质粒途径组装基因组编辑6.2.1常用元件的分类启动子：转录起始信号，被RNA聚合酶的sigma亚基识别核糖体结合位点：能被核糖体识别的位点，核糖体在这一位点上结合mRNA分子，开启蛋白质翻译过程，是控制翻译过程的元件。不同微生物之间核糖体结合位点存在差异，一般不可通用。真核微生物的翻译控制元件与原核微生物不同。终止子：转录结束的位点，终止子一般是可以自我配对形成stem-loop的核苷酸序列。选择标记元件：有效筛选和富集质粒的元件，常用的是抗生素抗性基因。启动子核糖体结合位点终止子常用元件6.2.1.1启动子启动子来源调控蛋白诱导剂启动子特征长度（bp）PT7lacOT7噬菌体LacI乳糖、IPTG来源于T7噬菌体，阻遏调控，与T7RNA聚合酶配合使用，是大肠杆菌中转录强度最强的启动子。19Plac大肠杆菌LacI乳糖、IPTG阻遏调控，受乳糖及类似物的诱导，具有浓度依赖性，同时受葡萄糖的抑制。102PlacUV5大肠杆菌LacI乳糖、IPTG阻遏调控，CRP结合区被去除，-10区存在点突变，启动强度比Plac强69Ptac大肠杆菌LacI乳糖、IPTG阻遏调控，Ptrp与PlacUV5杂合而成的启动子，启动强度比Plac和Ptrp强67Ptrc大肠杆菌LacI乳糖、IPTG阻遏调控，Ptrp与PlacUV5杂合形成的启动子，在-10区和-35区之间额外插入一个碱基，启动强度比Plac和Ptrp强68Para大肠杆菌AraC阿拉伯糖阻遏调控，受阿拉伯糖的诱导，具有浓度依赖性，同时受葡萄糖的抑制，启动强度比Plac弱285Ptet大肠杆菌TetR四环素、脱水四环素阻遏调控，受四环素/脱水四环素的诱导，具有浓度依赖性，一般选用毒性较低的脱水四环素62PL,PRλ噬菌体CI857温度阻遏调控，低温（30℃）下阻遏，高温（37-42℃）诱导表达45，45PFixK2大豆根瘤菌YF1/FixJ光磷酸化与去磷酸化调控，黑暗条件下表达，蓝光抑制表达246启动子按照来源分为：大肠杆菌来源启动子和噬菌体来源等外源启动子常用元件与构建工具常用元件6.2.1.2核糖体结合位点核糖体结合位点（Ribosomebindingsite，RBS）是mRNA中与核糖体30S小亚基中16SrRNA结合的一段序列。典型RBS序列是5’-AGGAGG-3’，由澳大利亚科学家Shine和Dalgarno最早发现，故又称Shine-Dalgarno序列（SD序列）。常用元件与构建工具常用元件6.2.1.2核糖体结合位点核糖体结合位点的结合强度影响蛋白的合成量，结合强度的影响因素：与16SrRNA配对的核苷酸数目、与起始密码子之间的距离。RBS计算器：根据热力学模型分析大肠杆菌中核糖体结合位点与核糖体的相互作用，定量计算具有特定翻译效率的核糖体结合位点序列。常用元件与构建工具常用元件6.2.1.3终止子

终止子（Terminator）转录结束的位点，终止子一般是可以自我配对形成stem-loop的核苷酸序列。终止子的5’端通常有若干多聚T序列，中间序列中一般存在一段大小约20bp、富含GC的反向重复序列，3’端通常有4-8个多聚A序列。终止子被转录形成的mRNA产物易形成发夹结构，终止转录过程。常用元件与构建工具常用元件6.2.1.3终止子

终止子（Terminator）转录结束的位点，终止子一般是可以自我配对形成stem-loop的核苷酸序列。终止子特征长度（bp）T7强终止子，T7噬菌体来源的终止子48rrnBT1T2强终止子，来源于大肠杆菌基因rrnB的终止子序列215Spy强终止子，来源于大肠杆菌基因spy的终止子序列90λ-t1强终止子，来源于λ噬菌体53常用元件与构建工具常用元件6.2.1.4选择标记元件抗生素抗性基因：在培养基中添加一定浓度抗生素，对质粒进行有效筛选和富集。筛选元件筛选机理常用抗生素浓度（μg/mL）AmpR，bla氨苄青霉素（ampicillin，Amp）抗性基因，编码β-内酰胺酶(β-lactamase)，特异性切割β-内酰胺环，从而使抗生素失效100ChlR氯霉素（chloramphenicol，Chl）抗性基因，编码氯霉素乙酰基转移酶，催化生成氯霉素-3-乙酸酯，使氯霉素失效25KanR卡那霉素（kanamycin，Kan）抗性基因，编码氨基糖苷磷酸转移酶，对卡那霉素的羟基进行O-磷酸化修饰，使其无法与核糖体结合而失效50StrR,aadA链霉素（streptomycin，Str）或壮观霉素抗性基因，编码氨基糖苷腺苷转移酶，对抗生素的羟基进行O-腺苷化修饰，从而抑制其与核糖体小亚基的结合50TetR四环素（tetracycline，Tet）抗性基因，编码特异性外排蛋白，阻止四环素通过细胞膜从培养基进入细胞12.5常用元件与构建工具常用质粒质粒拷贝数质粒相容性质粒是一种独立于细菌染色体、可自我复制的环状双链DNA片段，通常含有抗生素抗性基因、重金属抗性基因等特殊片段。大肠杆菌质粒拷贝数从1到几百不等。质粒的拷贝数差异与其复制方式有关，主要取决于质粒的复制起始点（replicationorigin），同时与宿主菌株的种类、培养条件、温度、外界压力等因素密切相关。拷贝数从几十到几百的质粒是多拷贝质粒，多拷贝质粒一般用作克隆载体构建、穿梭质粒构建、表达文库构建；拷贝数为十至几十的，一般称之为低拷贝质粒。常用的表达质粒一般是低拷贝质粒，如pET系列质粒。常用元件与构建工具常用质粒质粒拷贝数复制子启动子终止子筛选标记多克隆位点大小（kb）pSC1012-4pSC101无无TetR一个9.26pETDuet-110-15ColE1PT7lacOTT7AmpR两个5.42pACYCDuet-110-15p15APT7lacOTT7ChlR两个4.0pCDFDuet-120-40ColDF13PT7lacOTT7StrR两个3.78pRSFDuet-1~100RSF1030PT7lacOTT7KanR两个3.83pCoLADuet-120-40CoLAPT7lacOTT7KanR两个3.72pUC18100-300pMB1PlacTlacAmpR一个2.69pKD46~10oriR101ParaTaraAmpR-6.33大肠杆菌中的常用质粒常用元件与构建工具常用质粒温敏型质粒：复制起始蛋白RepA101(ts)（RepA温敏突变体），在低温下（≤30℃）RepA101(ts)的复制功能正常，但是当温度超过37℃时，RepA101(ts)的结构发生改变丧失其功能，导致质粒无法复制常用元件与构建工具常用质粒质粒的相容性：当多个质粒在大肠杆菌中同时存在时，需要考虑质粒间的相容性。具有相同复制子元件的同一类型的两个质粒无法有效共存于一个细胞。所选用的质粒需要含有不同类型的复制子及不同的筛选标记，才能有效维持多个质粒的共存。Duet-1系列质粒：兼容型质粒常用元件与构建工具遗传转化方法转化方法：通过一定的方法将外在的质粒导入到细胞内的方法。化学转化：利用化学试剂如用CaCl2处理提高细胞膜的通透性，使细胞处于感受状态，经过42℃短暂热激（一般为90s），随后在冰上冷却（一般为2-5min），使质粒得以有效进入胞内。电转化：电转化是利用瞬时极高电压的作用在细胞膜上形成孔道，使质粒进入感受态细胞内。转化：化学转化电转化质粒和细胞孵育电击成孔质粒穿孔质粒进入细胞常用元件与构建工具电转化的过程示意图遗传转化方法两种常见转化方法的比较特性化学转化电转化转化效率106-107转化子/μg质粒109转化子/μg质粒质粒制备的难易程度质粒无需特殊处理质粒需要做脱盐处理操作过程简单较简单设备的要求简单设备需要电转仪能够承受质粒大小一般大小的质粒转化超大质粒（30~150kb）常用元件与构建工具构建工具无缝克隆同源重组基因组编辑6.2.4.1无缝组装工具无缝组装（seamlessassembly）工具是基于末端同源序列配对原理开发的多个线性片段克隆和组装一体化技术。基于工具酶的使用，可分为三酶无缝组装和单酶无缝组装。优点：不受限制性内切酶位点、重组位点等限制，无需体外连接反应，一步反应可将多个DNA片段组装在一起，无额外序列残留，操作简单、效率高。缺点：对特异性同源臂序列的设计要求较高，如果粘性末端形成稳定的发夹或茎环等二级结构，则组装效率大大下降。随着DNA片段数量和序列长度的增加，组装效率下降，4个片段以上的组装效率较低。常用元件与构建工具构建工具单酶无缝组装原理示意图三酶无缝组装原理示意图常用元件与构建工具构建工具6.2.4.2同源重组工具功能：重组工具可以在大肠杆菌中完成单碱基修饰、基因敲除和基因插入等操作。基于噬菌体的重组酶，开发了λ-Red、RecET等多种同源重组工具，应用于基因敲除、基因替换、代谢途径的整合，在细胞工厂的构建中广泛使用。优点：λRed/ET重组系统的优点是同源臂序列短，一般情况下只需要50bp就能实现片段之间、片段与载体之间、片段与基因组之间的重组。组装片段长达50kb以上，操作简单，基因打靶敲除和组装的效率高。缺点：需要使用高浓度的敲除或组装片段。同源臂的长度是影响基因敲除的主要因素，不同大肠杆菌菌株的同源重组能力差异较大，有些菌株需要数百bp同源臂，才能有效敲除、插入或替换。常用元件与构建工具构建工具6.2.4.2同源重组工具λ-Red同源重组工具的构成pKD46：含有阿拉伯糖诱导redα-redβ-redγ操纵子、氨苄青霉素抗性、温敏型复制子pKD3：氯霉素抗性基因两侧为FRT序列、氨苄青霉素抗性pCP20：含有温度诱导FLP、氯霉素抗性、温敏型复制子λ-Red同源重组工具的工作原理外切酶Redα具有5’-3’外切活性，切割一条DNA链Redβ结合另一条单链DNA的末端，免受胞内核酸酶的降解，同时启动互补单链退火，引发DNA链间交换反应和重组Redγ结合并抑制大肠杆菌的RecBCD对线性DNA的降解常用元件与构建工具构建工具6.2.4.2同源重组工具应用λ-Red工具敲除基因的流程示意图λ-Red同源重组工具的操作流程1.pKD3为模板，构建含有上游同源臂-FRT-ChlR-FRT-下游同源臂的敲除片段2.导入阿拉伯糖诱导的大肠杆菌（pKD46）感受态细胞，筛选和鉴定氯霉素抗性的阳性菌落3.将质粒pCP20转化到阳性大肠杆菌中，高温诱导表达重组酶Flp，使两个FRT位点发生重组，消除基因组中的氯霉素抗性基因。4.高温下（42℃）丢失温敏型pKD46和pCP20质粒，获得不携带质粒的基因敲除菌株。常用元件与构建工具构建工具6.2.4.3基因组编辑工具基因组编辑工具的构成常用两个质粒表达，一个为低拷贝的切割编辑质粒，含有Cas核酸内切酶、red重组酶表达盒；另一个为高拷贝的供体gRNA质粒。化脓链球菌Cas9是最常用的核酸内切酶。Cas基因组编辑工具的工作原理Cas蛋白在靶标gRNA的介导下特异性切割基因组，在Red重组酶的协助下，同源修复模板被整合到基因组上。IPTG诱导表达靶向切割供体gRNA质粒的sgRNA的合成，被Cas切割后，供体gRNA质粒丢失。然后高温诱导丢失温敏型表达Cas核酸内切酶的质粒，获得基因编辑的无质粒菌株。

常用元件与构建工具构建工具6.2.4.3基因组编辑工具应用CRISPR/Cas9编辑大肠杆菌基因组的流程基因组编辑工具的优势与Red重组工具相比，CRISPR-Cas编辑工具的优势是靶基因gRNA（20bp）和同源修复模板（几十至数百bp）较短，设计构建相对容易，而且是无痕编辑。可同时编辑多个基因。目前大肠杆菌中同时敲除或突变4个基因的效率约30%。缺点是依赖于gRNA的NGG位置，敲除、插入、替换等难以做到期望定位；同时Cas蛋白毒性大，阳性克隆较少，效率偏低。常用元件与构建工具6.3琥珀酸细胞工厂大肠杆菌细胞工厂6.3.1理化性质及应用6.3.2细胞工厂的设计6.3.3细胞工厂的构建6.3.4发酵工艺优化理化性质及应用琥珀酸细胞工厂琥珀酸琥珀酸(Succinicacid)，又名丁二酸，分子式为C4H6O4，分子量118.089琥珀酸作为三羧酸循环的中间产物以及厌氧代谢的终端还原产物，在生物代谢中占有非常重要的地位，广泛存在于人体、动物、植物和微生物中

理化性质及应用琥珀酸细胞工厂琥珀酸－重要的C4平台化合物目前全球市场丁二酸的年需求量超过

3.0

万吨生物合成丁二酸的方法可减少250多种苯基化学制品的生产和消费过程中所产生的污染，拓展丁二酸的应用领域与商品市场，总量将达400

万吨。C4大宗化学品丁二醇、四氢呋喃、

-丁内酯等的市场需求超过200亿元/年。

四氢呋喃、γ-丁内酯、1,4-丁二醇等将超过400万吨/年。

PBS类生物可降解材料将达到100万吨/年。细胞工厂的设计琥珀酸细胞工厂产量相对低成本相对较高生物合成环境友好原料可再生玉米皮玉米芯蔗渣稻草秸秆优点催化加氢合成石蜡材料氧化缺点工艺相对成熟电化学合成技术成熟工业使用广泛催化条件苛刻成本高生产规模受限副产物含量高石油消耗大污染严重研究重点：如何提高琥珀酸产量及转化效率？细胞工厂的设计琥珀酸细胞工厂还原三羧酸途径有氧三羧酸途径乙醛酸循环原核生物合成路径真核生物合成路径次要合成路径细胞工厂的设计琥珀酸细胞工厂琥珀酸的生物合成途径原核生物与真核生物的琥珀酸合成模块有所差异原核生物的琥珀酸生物合成模块都包括糖酵解模块真核生物的琥珀酸合成从丙酮酸开始琥珀酸是真核生物三羧酸循环的中间代谢产物，琥珀酸合成代谢改造的关键步骤是在有氧条件下通过阻断琥珀酸下游分解途径从而积累琥珀酸。真核生物的琥珀酸生物合成模块CO2细胞工厂的设计琥珀酸细胞工厂大肠杆菌厌氧发酵制备丁二酸利用可再生资源，来源广泛、价格低廉反应条件温和、污染小厌氧反应——能耗低，产物收率高原子经济性高，生产1kg丁二酸，固定0.37kgCO2,比传统化学合成工艺节能30-40%，相对葡萄糖理论质量收率>100%

糖酵解模块琥珀酸合成模块高效的绿色生产技术大肠杆菌遗传背景清晰、易操作、生长迅速、营养需要小优势所在细胞工厂的构建琥珀酸细胞工厂琥珀酸合成的代谢工程策略己糖激酶(Glk):当大肠杆菌采用半乳糖协同运输体系时借助半乳糖透性酶运输糖到体内，同时己糖激酶将其磷酸化。此过程需要ATP和质子梯度。磷酸烯醇式丙酮酸转移酶系(Pts):一般认为此途径为更优的糖转运途径，因为不需要质子梯度的辅助。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(Ppc):大肠杆菌内主要的固定CO2的酶丙酮酸羧化酶(Pyc)：在大肠杆菌内不存在这种酶（常外源引入提高CO2固定效率）磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(Pck):其他细菌内固定CO2的酶，可产生一分子ATP大肠杆菌合成琥珀酸途径关键酶细胞工厂的构建琥珀酸细胞工厂琥珀酸合成的代谢工程策略（×表示阻断，∆表示敲除，箭头加粗表示过量表达）为使代谢流流向琥珀酸，常利用代谢工程策略对代谢途径中的关键酶基因进行表达调控1.增强代谢途径中酶基因的表达（失活磷酸烯醇式丙酮酸转运系统）2.过表达外源羧化酶（丙酮酸羧化酶Pyc、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶Pck）消除竞争途径（如甲酸、乙酸、乳酸等副产物）优化辅因子代谢1.采用还原力更强的底物进行发酵（甘油、山梨醇）2.调控胞内辅因子平衡NADH/NAD+3.激活乙醛酸途径增强琥珀酸转运（强化Duc转运系统）发酵工艺优化琥珀酸细胞工厂原料处理发酵分离纯化浓缩结晶玉米粉聚合级丁二酸琥珀酸的发酵生产整体流程发酵工艺优化琥珀酸细胞工厂培养基C源、N源优化1.可利用的发酵底物:葡萄糖、乳糖、甘油及山梨糖醇，促进代谢流向产琥珀酸的方向。2.对培养基组成成分及N源浓度优化pH中和剂选择（Na2CO3、NaOH、K2CO3、KOH和NH3·H2O）CO2供给形式（气体浓度在0~50%区间时，琥珀酸产量随CO2气体浓度增加呈明显上升趋势，但当浓度高于50%后琥珀酸产量增加不明显）双阶段发酵工艺（好氧阶段生长积累菌体，厌氧发酵积累琥珀酸）琥珀酸合成的发酵优化6.4L-苯丙氨酸细胞工厂大肠杆菌细胞工厂6.4.1理化性质及应用6.4.2细胞工厂的设计6.4.3细胞工厂的构建6.4.4发酵工艺优化理化性质及应用L-苯丙氨酸细胞工厂芳香族氨基酸溶解性理化性质常温下为白色结晶或结晶性粉末，干燥状态在空气中稳定。具有左旋光活性。最大吸收波长为260nm。非极性氨基酸，不溶于乙醇和乙醚等有机溶剂，微溶于水，密度1.24g/mL，易溶于稀酸或稀碱市场应用在食品工业：合成食品甜味剂阿斯巴甜的主要原料。L-苯丙氨酸也是生产保健食品的营养强化剂。在医药领域：复方氨基酸注射液和综合氨基酸制剂原料。阿斯巴甜细胞工厂的设计L-苯丙氨酸细胞工厂重点：模块化反馈抑制根据主要中间代谢物和终产物，将生物合成途径分为3个模块：莽草酸（shikimicacid）模块、分支酸（chorismicacid）模块和L-苯丙氨酸模块细胞工厂的设计L-苯丙氨酸细胞工厂莽草酸模块的设计AroG受L-酪氨酸的反馈抑制，需要解除其抑制作用细胞工厂的设计L-苯丙氨酸细胞工厂分支酸模块的设计AroA催化是可逆反应，PEP的充足供给是分支酸模块正向反应和苯丙氨酸高产的前提条件。细胞工厂的设计L-苯丙氨酸细胞工厂苯丙氨酸模块的设计pheA基因转录受到衰减子调控，培养基中L-苯丙氨酸含量丰富时，pheA基因转录终止PheA酶活性受到L-苯丙氨酸的反馈抑制。解除pheA基因的衰减子调控和PheA反馈抑制竞争支路途径：酪氨酸合成。转录调控因子TyrR阻遏调控aroG、aroFtyrA、aroLM、tyrB等合成途径基因转录tyrA酪氨酸合成细胞工厂的构建L-苯丙氨酸细胞工厂重点：解除反馈抑制基本策略与思路解除产物的反馈抑制解除阻遏调控增加前体供给细胞工厂的构建L-苯丙氨酸细胞工厂解除L-苯丙氨酸的反馈抑制AroG的反馈抑制：选择具有L-苯丙氨酸反馈抑制抗性基因突变体，如AroG的单突变体（D146N、P150L、L179A、F209A、F209S）和双突变体（L8I-S180F、L16H-H217L、W215A-H217A）解除PheA的反馈抑制活性：选择PheA的疏水区域单突变体(A310V、L311F、L311S)、亲水性区域单突变体（E329A、R331A）及其他突变体T326P、C374A质粒表达aroG及pheA突变体基因组整合表达aroG及pheA突变体细胞工厂的构建L-苯丙氨酸细胞工厂解除转录因子的阻遏调控敲除tyrA阻断L-酪氨酸的合成：使L-苯丙氨酸代谢流最大化。但缺点是发酵培养基需要添加少量L-酪氨酸或酵母粉，以满足大肠杆菌的正常生长。敲除染色体上全局负调控因子基因tyrR，解除对芳香氨基酸合成主要基因的阻遏调控表达去阻遏但保留激活活性的TyrR突变体（T495I），调控芳香氨基酸转运蛋白基因的激活转录细胞工厂的构建L-苯丙氨酸细胞工厂强化前体供给增加PEP的供应：敲除pyk（编码丙酮酸激酶）基因，过表达ppsA（编码磷酸烯醇式丙酮酸合成酶A），可过表达tktA（编码转酮酶A）敲除PTS系统中葡萄糖特异性转运蛋白基因ptsG或pstHIccr操纵子，节流PEP组成型过表达galP和glk基因，增加6-磷酸葡萄糖的供应葡萄糖培养基上通过实验室适应性进化工程，获得抗ptsG缺陷的菌株改造葡萄糖转运及代谢途径增加PEP及E4P的供给发酵工艺优化L-苯丙氨酸细胞工厂培养基培养基组成对L-苯丙氨酸发酵影响很大，一般使用以葡萄糖为碳源，含有大量元素磷、钾、镁、钠、钙等的培养基，满足渗透压和无机盐的要求。在无机氮源硫酸铵的基础上，添加少量酵母粉等有机氮源，促进细胞生长，满足L-酪氨酸缺陷型种子培养基要比发酵培养基丰富，增加酵母粉的用量，或者添加一定数量的蛋白胨或牛肉膏，以提高种子的质量发酵罐的接种量通常为10%～15%分阶段发酵组成型表达菌株，恒温37℃发酵温度诱导发酵，进行两段控制。对细胞生长温度（一般30-33ºC）、苯丙氨酸生产温度（一般37-42ºC）进行精确实验，确定温度控制范围。发酵过程流加氨水，补充铵离子，同时控制pH6.8-7.0。通气搅拌级联控制溶解氧浓度，一般在30%以上。培养基6.51,4-丁二醇细胞工厂大肠杆菌细胞工厂6.5.11,4-丁二醇的理化性质及应用6.5.21,4-丁二醇细胞工厂的设计6.5.31,4-丁二醇细胞工厂的构建6.5.4发酵工艺优化理化性质及应用1,4-丁二醇细胞工厂1,4-丁二醇分子结构市场用途四氢呋喃γ-丁内酯氨纶纤维聚氨酯材料理化性质常温下为无色粘稠液体，与水混溶，溶于乙醇，微溶于乙醚，密度为1.017g/mL。市场应用基础化工原料全球每年需求量约为300万吨，是合成四氢呋喃、γ-丁内酯等化学品的原料，广泛用于氨纶纤维、聚氨酯、农药、医药产品的生产。细胞工厂的设计模块化还原力推拉阻策略1,4-丁二醇细胞工厂整体设计策略1,4-丁二醇细胞工厂的设计可分为五个模块：1,4-丁二醇合成途径模块竞争途径模块还原力NADH和NADPH模块碳流竞争途径模块前体琥珀酰辅酶A供应模块Trotteretal.,2023细胞工厂的设计1,4-丁二醇细胞工厂1,4-丁二醇合成途径模块的设计1,4-丁二醇与琥珀酰CoA的结构非常相似逆生物合成的分析策略/计算机辅助途径设计1,4-丁二醇合成途径模块的构成琥珀酰半醛脱氢酶Ssadh将琥珀酰辅酶A还原为琥珀酰半醛，消耗NADH或NADPH琥珀酰半醛在4-羟基丁酸脱氢酶4Hbd作用下还原为4-羟基丁酸4-羟基丁酸在乙酰辅酶A活化下，被Cat2转化为4-羟基丁酰辅酶A4-羟基丁酰辅酶A还原酶Ald和醇脱氢酶Adh催化生成1,4-丁二醇细胞工厂的设计1,4-丁二醇细胞工厂竞争途径模块的设计中间产物琥珀酰半醛易被大肠杆菌内源的琥珀酰半醛脱氢酶氧化为琥珀酸：NAD+依赖型琥珀酰半醛脱氢酶（Sad）NADP+依赖型琥珀酰半醛脱氢酶（GabD）中间代谢物4-羟基丁酰辅酶A在大肠杆菌内源硫酯酶（编码基因为ybgC、tesB）催化下形成γ-丁内酯，降低产物产量。敲除这些竞争途径基因促进1,4-丁二醇合成+CoA-SH4-羟基丁酰辅酶Aγ-丁内酯ybgC/tesBNADHNAD+琥珀酰半醛sadNADPHNADP+gabD琥珀酸细胞工厂的设计1,4-丁二醇细胞工厂丙酮酸降解途径的设计目标：强化从中心碳代谢到三羧酸循环的代谢流，增强琥珀酰辅酶A的合成手段：阻断丙酮酸向甲酸、乙醇、乳酸合成途径的代谢流分配。具有双重作用：既有利于增加三羧酸循环的碳代谢流，也为1,4-丁二醇合成途径提供NADH，实现胞内NADH的平衡。细胞工厂的设计1,4-丁二醇细胞工厂强化琥珀酰辅酶A模块的设计围绕糖酵解途径和三羧酸循环进行设计，解除高浓度NADH积累对途径的抑制作用替换或突变柠檬酸合成酶、丙酮酸脱羧脱氢酶、α-酮戊二酸脱氢酶，解除胞内高浓度NADH的抑制作用，保持丙酮酸到乙酰辅酶A及α-酮戊二酸到琥珀酰辅酶A的较高代谢流通量过表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ppc，减少CO2的释放，向三羧酸循环供给更多的草酰乙酸敲除转录抑制因子ArcA，解除对柠檬酸合成酶和异柠檬酸脱氢酶的抑制可敲除苹果酸脱氢酶基因mdh，阻断琥珀酰辅酶A向三羧酸循环下游物质的转化细胞工厂的构建基因敲除基因组整合1,4-丁二醇细胞工厂整体构建策略构建过程主要是从琥珀酰辅酶A到1,4-丁二醇的合成途径表达质粒敲除丙酮酸降解和支路途径基因重构NADH代谢途径强化琥珀酰辅酶A合成途径1,4-丁二醇大肠杆菌细胞工厂的构建。图例：X表示阻断，实线加粗表示强化路径。细胞工厂的构建1,4-丁二醇细胞工厂1,4-丁二醇合成途径的构建筛选代谢途径酶，使每步反应效率最大化最终代谢途径构成：牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonasgingivalis）的ssadh、4hbd、cat2，拜氏梭菌（Clostridiumbeijerinckii）ald和大肠杆菌内源性adh操纵子形式表达代谢途径基因稳定表达形式：整合到基因组，整合位点：敲除基因位点（ldhA、adhE等）、噬菌体受体结合位点（TonA、Lamb）细胞工厂的构建1,4-丁二醇细胞工厂丙酮酸降解途径和支路途径的基因敲除丙酮酸降解途径基因：丙酮酸甲酸裂解酶基因pfl、乙醇脱氢酶E基因adhE、乳酸脱氢酶基因ldhA、乙酸合成途径基因pta和ackA支路途径基因：sad、gabD、ybgC、tesB采用敲除技术：λ-RedET同源重组技术、CRISPR-Cas工具细胞工厂的构建1,4-丁二醇细胞工厂NADH代谢的重构阻断乙醇、乳酸合成途径以及敲除苹果酸脱氢酶基因mdh，促进胞内NADH的积累敲除细胞膜上与NADH与NAD+转化系统相关组分基因-NADH：泛醌氧化还原酶基因ndh及电子传递链组分基因appBC、cydAB，抑制NADH被氧化，使细胞积累NADH耦合1,4-丁二醇合成与还原力NADH的代谢平衡，为合成提供持续的拉动力细胞工厂的构建1,4-丁二醇细胞工厂强化琥珀酰辅酶A的合成途径肺炎克雷伯菌（Klebsiellapneumonia）来源的lpdA基因替换大肠杆菌lpdA突变柠檬酸合成酶基因gltA(R163L)，解除高浓度NADH对酶活性的抑制解除转录因子ArcA对三羧酸循环的全局阻遏过表达ppc强化草酰乙酸的合成发酵工艺优化分段发酵微氧发酵1,4-丁二醇细胞工厂总体发酵策略第一阶段：采用有氧发酵，细胞快速生长和大量繁殖第二阶段：改变通气量使细胞处于微氧状态。微氧条件可使胞内大量积累NADH，有利于代谢流进入1,4-丁二醇合成途径。在发酵过程中流加碳酸钠为细胞补充碳源，加强草酰乙酸的供应，促进琥珀酰辅酶A的积累及1,4-丁二醇的合成。6.6异戊二烯细胞工厂大肠杆菌细胞工厂6.6.1异戊二烯的的理化性质及应用6.6.2异戊二烯细胞工厂的设计6.6.3异戊二烯细胞工厂的构建6.6.4发酵工艺优化理化性质及应用异戊二烯细胞工厂生物橡胶单体生物橡胶理化性质常温下是一种无色、易挥发、有刺激性气味的油状液体，沸点较低（34℃），能与乙醇、乙醚和丙酮等有机溶剂混溶，易燃易爆，具有很强的毒性。市场应用基础化工原料工业上合成橡胶的重要单体，约95%的异戊二烯原料被用来合成工业橡胶，特别是异戊橡胶、丁基橡胶和热塑性塑料等。异戊二烯也被广泛应用于医药、农药、黏结剂及香料生产等领域。细胞工厂的设计杂合MVA途径异戊二烯细胞工厂整体设计策略从植物中挖掘异戊二烯合成酶（IspS），筛选并应用到大肠杆菌底盘细胞中加强前体物二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）供给大肠杆菌的萜类合成途径以中间代谢物磷酸甲基赤藓糖醇（MEP）命名，简称MEP途径葡萄糖MEP途径DMAPPIspS异戊二烯异戊二烯细胞工厂的设计异戊二烯细胞工厂异戊二烯合成酶基因的设计筛选不同来源的IspS编码基因，优化密码子，对酶进行定向进化等，提高IspS的活性植物IspS定位于叶绿体，具有信号肽，也不利于在大肠杆菌中表达。需要在生物信息预测软件的辅助下，切除IspS的信号肽。细胞工厂的设计异戊二烯细胞工厂DMAPP合成途径的设计内源性DMAPP途径的强化：过表达关键基因dxs、ispC和idi酵母来源甲羟戊酸（MVA）途径的引入将不同生物来源的MVA途径组合是大肠杆菌合成萜类的最佳选择粪肠球菌（Enterococcusfaecalis）细菌的mvaE和mvaS分别取代酵母的ACCT基因、HMGS基因甲烷八叠球菌来源的mvk取代酵母同源基因，酿