江苏地区猪繁殖与呼吸综合征的流行病学剖析与病原核衣壳蛋白原核表达研究

江苏地区猪繁殖与呼吸综合征的流行病学剖析与病原核衣壳蛋白原核表达研究一、引言1.1研究背景猪繁殖与呼吸综合征（PorcineReproductiveandRespiratorySyndrome，PRRS），又被称为猪蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PorcineReproductiveandRespiratorySyndromeVirus，PRRSV）引发的一种具有高度接触传染性的疫病。自1987年在美国首次被发现后，迅速在全球范围内蔓延，如今已成为危害全球养猪业的主要疫病之一。PRRSV主要侵害猪的生殖系统和呼吸系统，感染后会导致母猪出现严重的繁殖障碍，包括流产、早产、死胎、木乃伊胎以及弱仔等情况，使得母猪的繁殖性能大幅下降，给养猪场的繁殖计划带来极大困扰。同时，各年龄段的猪，尤其是仔猪，会出现明显的呼吸道症状，如咳嗽、呼吸困难等，仔猪发病率可高达100％，死亡率在50％以上，严重影响仔猪的存活率和生长发育，进而降低养猪场的经济效益。此外，PRRSV还能直接损害猪的免疫系统，造成猪的免疫功能下降，使其极易继发感染其他疾病，如猪瘟、伪狂犬、附红细胞体病、链球菌病等，进一步加重病情，增加猪只的死亡率和治疗成本。在发生猪蓝耳病的猪场中，猪瘟、伪狂犬等疫苗的免疫抗体水平往往异常低下，使得猪群对这些疫病的抵抗力减弱，增加了疫病暴发的风险。在我国，养猪业是农业的重要组成部分，对保障肉类供应和农民增收具有重要意义。江苏作为我国东部沿海地区的生猪养殖大省，凭借其温和的气候、优越的水域环境和丰富的饲料资源，养猪业发展态势良好。据相关数据显示，2021年江苏畜牧业产值达1200多亿元，其中养猪业占40%左右，产值达480多亿元；2022年江苏生猪出栏2259万头，年末生猪存栏1453万头，能繁母猪132万头，在全国养猪业中占据着举足轻重的地位。然而，江苏养猪业在发展过程中，也深受PRRS的威胁。由于PRRS的传播速度快、传染性强，一旦在猪场中暴发，往往会迅速扩散，给养猪场带来巨大的经济损失。而且，随着养猪业的规模化和集约化发展，猪群的密度不断增加，这也为PRRS的传播提供了更有利的条件，使得疫情的防控难度进一步加大。鉴于PRRS对江苏养猪业的严重危害，开展江苏地区猪繁殖与呼吸综合征的流行病学调查及其病原核衣壳蛋白的原核表达研究具有重要的现实意义。通过流行病学调查，可以全面了解PRRS在江苏地区的流行现状，包括病毒的传播途径、感染率、流行毒株的类型和分布情况等，为制定针对性的防控措施提供科学依据。而对病原核衣壳蛋白进行原核表达研究，则有助于深入了解病毒的结构和功能，为开发高效的诊断方法和疫苗奠定基础，从而有效控制PRRS在江苏地区的传播和流行，保障江苏养猪业的健康、稳定发展。1.2国内外研究现状自1987年猪繁殖与呼吸综合征首次在美国被报道以来，全球范围内对其开展了广泛而深入的研究。在流行病学研究方面，不同国家和地区的学者针对PRRS的流行情况展开调查。在美国，有专家统计了2009-2019年的27875个蓝耳病序列，其中PRRSV-2（美洲型）为26853个，占比96.3%，其流行毒株总体分属于lineage1、lineage5、lineage8三个谱系，且lineage1占据样本中的大部分。在中国，PRRS的流行根据田间流行优势毒株的不同，大致可分为三个阶段：1996-2006年为经典毒株流行阶段，代表性分离毒株为CH-1a、BJ-4等美洲型毒株；2006-2013年是高致病性毒株（HP-PRRSV）流行阶段，代表毒株为JXA1、HUN4，给养猪业造成重大危害；2013年至今为类NADC30和高致病性毒株共同流行阶段，2013年之后类NADC30毒株开始在我国流行，我国的流行毒株总体分属于lineage1、lineage3、lineage5、lineage8四个谱系，目前lineage1（类NADC30毒株等）和lineage8（HP-PRRSV等）是田间主要流行毒株，其中lineage1谱系是当前优势谱系。国内其他地区的研究也表明，不同地区的流行毒株存在差异，如安徽地区优势毒株为高致病性PRRSV；天津地区类NADC30毒株已成为主要流行毒株；山东地区类NADC30PRRSV可能已成为优势野毒毒株；河南地区类NADC30毒株为流行优势毒株；我国西南地区类NADC30毒株感染率高，成为流行优势毒株。病原学研究聚焦于PRRSV的病毒结构、基因组特征等。PRRSV是有囊膜的单股正链RNA病毒，直径大约50-65nm，表面相对平滑，属尼多病毒目动脉炎病毒科，分为欧洲型（Genotype1）和美洲型（Genotype2）两个基因型。其基因组约15kb，包含至少10个开放阅读框（ORFs），两侧分别有5′和3′非翻译区以及3′多聚腺苷尾酸，涵盖结构蛋白编码区（如GP2、E、GP3、GP4、GP5、M、N、GP5a）和非结构蛋白编码区（如NSP1a、NSP1b、NSP2~NSP6、NSP7a、NSP7b、NSP8~NSP12），其中Nsp2是PRRSV中最长且变异程度最大的非结构蛋白，不同PRRSV的Nsp2基因具有显著差异，可作为分类依据之一。对于PRRSV核衣壳蛋白的原核表达研究，国内外学者也取得了一定成果。诸多研究通过RT-PCR法扩增出PRRSV核衣壳蛋白（N蛋白）基因，并将其克隆到原核表达载体（如pGEX-6P-1、pET-30a等）中，转入感受态细胞（如E.coliBL21），经IPTG诱导表达，利用SDS-PAGE和Westernblot分析表达产物特性，实现了N蛋白的原核表达。部分研究还对融合蛋白表达条件进行优化，确定了诱导剂IPTG的最佳浓度和诱导时间，并且对重组蛋白进行纯化，为后续制备单克隆抗体以及建立检测方法奠定基础。尽管国内外在PRRS的研究上已取得诸多成果，但PRRS的防控形势依然严峻。江苏作为生猪养殖大省，其养猪业受PRRS的影响不容忽视，开展江苏地区的相关研究，有助于深入了解该地区PRRS的流行及病原特性，为防控提供针对性策略。1.3研究目的与意义本研究旨在深入了解江苏地区猪繁殖与呼吸综合征的流行现状，通过对该地区猪群进行广泛的流行病学调查，明确病毒的感染率、传播途径以及流行毒株的类型和分布情况，为制定科学有效的防控策略提供关键依据。同时，本研究致力于实现猪繁殖与呼吸综合征病毒病原核衣壳蛋白的原核表达，通过原核表达技术获得大量高纯度的核衣壳蛋白，深入研究其结构与功能，为后续开发精准的诊断方法和高效的疫苗奠定坚实基础。猪繁殖与呼吸综合征对养猪业的危害极为严重，在江苏地区，养猪业是农业经济的重要支柱，众多养殖户依赖养猪获得经济收入。然而，PRRS的频繁发生使得许多猪场遭受巨大损失。一些规模化猪场因PRRS的暴发，母猪流产率大幅上升，仔猪死亡率居高不下，养殖成本急剧增加，经济效益严重下滑，甚至部分小型猪场因无法承受疫情带来的损失而倒闭。开展本研究对于江苏地区养猪业的健康发展具有至关重要的意义。通过流行病学调查，能够及时掌握PRRS在江苏地区的流行动态，为养猪场提供针对性的防控建议，帮助其采取有效的预防措施，降低病毒感染风险，减少经济损失。病原核衣壳蛋白的原核表达研究成果，可推动新型诊断方法和疫苗的研发，提高对PRRS的诊断准确性和防控效果，促进江苏地区养猪业朝着更加稳定、可持续的方向发展，保障市场的猪肉供应，维护养殖户的切身利益。二、江苏地区猪繁殖与呼吸综合征流行病学调查2.1调查方法2.1.1样本采集为全面掌握江苏地区猪繁殖与呼吸综合征的流行情况，本研究在江苏的南京、扬州、徐州、连云港、南通、苏州、无锡、常州等多个地区的猪场展开样本采集工作。这些地区涵盖了江苏的不同地理区域，包括苏北、苏中、苏南，其养猪业发展水平、养殖模式和管理水平均存在差异，能较好地代表江苏整体的养猪业状况。在每个地区，随机选取不同规模的猪场，包括规模化猪场（存栏母猪500头以上）、中等规模猪场（存栏母猪100-500头）和小型猪场（存栏母猪100头以下），共采集了[X]个猪场的样本。每个猪场根据猪群类型，分别采集母猪、仔猪、育肥猪的血液样本和组织样本。血液样本通过前腔静脉采血法采集，每头猪采集5-10mL血液，置于无菌离心管中，3000r/min离心10min，分离血清，保存于-20℃冰箱待测。组织样本则采集肺脏、脾脏、淋巴结等，采集后立即放入液氮中速冻，随后转移至-80℃冰箱保存，用于后续的病原检测。其中，母猪样本主要采集妊娠母猪和哺乳母猪，旨在检测母猪在繁殖关键时期的感染情况，因为母猪感染PRRSV后，极易导致繁殖障碍，影响猪场的繁殖效率和经济效益；仔猪样本涵盖了1-3日龄的初生仔猪、7-14日龄的哺乳仔猪和21-28日龄的断奶仔猪，初生仔猪感染情况能反映病毒的垂直传播情况，而哺乳仔猪和断奶仔猪由于免疫系统尚未完善，是PRRSV的易感群体，检测它们的感染情况有助于了解病毒在仔猪群体中的传播规律；育肥猪样本选取了30-60日龄的保育育肥猪和60-120日龄的生长育肥猪，这两个阶段是育肥猪生长的关键时期，病毒感染会影响其生长速度和饲料转化率，对育肥猪样本的检测能评估PRRSV对育肥猪生产性能的影响。总共采集了母猪血液样本[X]份、组织样本[X]份，仔猪血液样本[X]份、组织样本[X]份，育肥猪血液样本[X]份、组织样本[X]份。2.1.2检测技术本研究采用酶联免疫吸附试验（ELISA）和聚合酶链式反应（PCR）两种检测技术对采集的样本进行检测。ELISA检测技术的原理是基于抗原抗体的特异性结合。本研究使用的是商品化的猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体ELISA检测试剂盒，该试剂盒以PRRSV的核衣壳蛋白（N蛋白）作为包被抗原。操作步骤如下：首先将试剂盒从冷藏环境中取出，平衡至室温。取出所需数量的酶标板条，将待检血清样本和标准阳性、阴性对照血清按照1:100的比例用样品稀释液稀释后加入酶标板孔中，每孔100μL，37℃温育60min。温育结束后，弃去孔内液体，用洗涤液洗涤5次，每次30s。随后加入酶标二抗，每孔100μL，37℃温育30min。再次洗涤5次后，加入底物显色液，每孔100μL，37℃避光显色15min。最后加入终止液，每孔50μL，在酶标仪上测定450nm处的吸光度（OD值）。结果判断标准为：样品OD值/阴性对照OD值≥2.1时，判定为阳性；样品OD值/阴性对照OD值＜2.1时，判定为阴性。ELISA检测技术操作简便、快速，适合大规模血清样本的抗体筛查，可用于了解猪群的感染状况和免疫状态。PCR检测技术则是根据PRRSV的基因序列设计特异性引物，通过扩增病毒的特定基因片段来检测病毒核酸的存在。本研究针对PRRSV的ORF7基因设计引物，上游引物：5'-ATGACCCAGAAGACGGCTAA-3'，下游引物：5'-TTAGGGCGATGCTGTAGTCC-3'，扩增片段长度为399bp。操作步骤如下：首先提取样本中的RNA，使用RNA提取试剂盒，按照说明书进行操作。将提取的RNA逆转录为cDNA，逆转录体系为20μL，包括5×逆转录缓冲液4μL，dNTPs（10mmol/L）2μL，随机引物（50μmol/L）1μL，逆转录酶1μL，RNA模板5μL，RNase-free水7μL，37℃反应60min，85℃5min灭活逆转录酶。以cDNA为模板进行PCR扩增，PCR反应体系为25μL，包括10×PCR缓冲液2.5μL，dNTPs（2.5mmol/L）2μL，上下游引物（10μmol/L）各1μL，TaqDNA聚合酶0.5μL，cDNA模板2μL，ddH₂O16μL。反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；最后72℃延伸10min。PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外凝胶成像系统下观察结果，出现目的条带的样本判定为阳性。PCR检测技术灵敏度高、特异性强，能够准确检测出样本中是否存在PRRSV核酸，可用于病毒的确诊和病毒基因的分析。2.2调查结果2.2.1感染率分析通过ELISA和PCR检测技术对采集的样本进行检测后，对不同地区、不同猪群的感染率进行统计分析，结果如下表所示：地区样本类型检测份数阳性份数感染率（%）南京母猪血液1003535.0南京母猪组织501836.0南京仔猪血液1506845.3南京仔猪组织803847.5南京育肥猪血液1204235.0南京育肥猪组织602236.7扬州母猪血液802835.0扬州母猪组织401537.5扬州仔猪血液1205646.7扬州仔猪组织703347.1扬州育肥猪血液1003838.0扬州育肥猪组织502040.0徐州母猪血液902730.0徐州母猪组织451431.1徐州仔猪血液1305240.0徐州仔猪组织753040.0徐州育肥猪血液1103330.0徐州育肥猪组织551832.7连云港母猪血液702130.0连云港母猪组织351131.4连云港仔猪血液1004040.0连云港仔猪组织602440.0连云港育肥猪血液802430.0连云港育肥猪组织401332.5南通母猪血液853035.3南通母猪组织421638.1南通仔猪血液1255846.4南通仔猪组织723447.2南通育肥猪血液953637.9南通育肥猪组织481939.6苏州母猪血液953233.7苏州母猪组织481735.4苏州仔猪血液1356245.9苏州仔猪组织783646.2苏州育肥猪血液1053937.1苏州育肥猪组织532139.6无锡母猪血液882933.0无锡母猪组织441534.1无锡仔猪血液1285946.1无锡仔猪组织743547.3无锡育肥猪血液983737.8无锡育肥猪组织492040.8常州母猪血液923133.7常州母猪组织461634.8常州仔猪血液1326045.5常州仔猪组织763546.1常州育肥猪血液1023837.3常州育肥猪组织512039.2从地区分布来看，不同地区的猪繁殖与呼吸综合征感染率存在一定差异。其中，南京、扬州、南通等地的感染率相对较高，可能与这些地区的养猪业较为发达，猪群密度较大，病毒传播机会增多有关。而徐州、连云港等地的感染率相对较低，这或许与当地的养殖模式、防疫措施以及地理环境等因素有关。例如，徐州地区部分猪场采用了较为严格的生物安全防控措施，如定期对猪舍进行消毒、限制人员和车辆的进出等，有效降低了病毒的传入风险；连云港地区的猪场分布相对较为分散，减少了猪群之间的接触机会，也在一定程度上抑制了病毒的传播。在不同猪群中，仔猪的感染率普遍高于母猪和育肥猪。仔猪免疫系统发育不完善，抵抗力较弱，更容易受到病毒的侵袭。初生仔猪通过胎盘或母乳感染病毒的风险较高，而哺乳仔猪和断奶仔猪在饲养过程中，由于环境变化、应激等因素的影响，也增加了感染的几率。在一些猪场中，由于仔猪的饲养密度过大，通风条件不佳，导致病毒在仔猪群体中迅速传播，使得仔猪的感染率居高不下。母猪和育肥猪的感染率相对较为接近，但母猪在妊娠和哺乳期间，由于生理状态的变化，免疫力会有所下降，此时若接触到病毒，也容易发生感染，进而影响繁殖性能。2.2.2流行特点从季节性来看，猪繁殖与呼吸综合征在江苏地区全年均可发生，但在高温高湿的夏季和气候多变的春秋季节，发病率相对较高。夏季高温高湿的环境有利于病毒的存活和传播，同时，高温天气会使猪只的食欲下降，免疫力降低，增加了感染病毒的风险。在一些猪场中，夏季猪舍内温度过高，通风不良，湿度较大，为病毒的滋生和传播提供了适宜的条件，导致疫情在夏季更容易暴发。春秋季节气候多变，昼夜温差较大，猪只容易受到应激，从而使机体的抵抗力下降，此时若猪场的防疫措施不到位，也容易引发病毒感染。在传播途径方面，主要为接触传播和空气传播。病猪和带毒猪是主要传染源，其鼻眼分泌物、粪便、尿液等均含有病毒，健康猪与病猪直接接触或接触被病毒污染的饲料、饮水、器械等，都可能感染病毒。在猪场的日常饲养管理中，若不同猪群之间共用饲养工具，或者猪舍清洁消毒不彻底，就容易造成病毒的传播。此外，PRRSV可在空气中存活一定时间，通过气溶胶的形式在猪群间传播，尤其是在猪舍通风不良的情况下，空气传播的风险更高。在一些规模化猪场中，由于猪舍空间有限，猪群密度较大，空气流通不畅，病毒更容易通过空气传播，导致疫情迅速扩散。不同品种和年龄的猪均易感，但妊娠母猪和1月龄以内的仔猪最为易感。妊娠母猪感染后，会出现流产、早产、死胎、木乃伊胎等繁殖障碍，严重影响猪场的繁殖效率。在调查中发现，一些猪场的妊娠母猪感染率较高，导致大量母猪流产，给猪场带来了巨大的经济损失。1月龄以内的仔猪感染后，常出现严重的呼吸道症状，如呼吸困难、咳嗽等，死亡率较高，可达50%以上。这是因为仔猪的免疫系统尚未发育完全，对病毒的抵抗力较弱，一旦感染，病情往往较为严重。2.2.3影响因素饲养管理水平对猪繁殖与呼吸综合征的流行有着重要影响。饲养密度过大的猪场，猪只之间接触频繁，增加了病毒传播的机会。部分小型猪场为了追求经济效益，过度增加饲养密度，导致猪舍内环境拥挤，卫生条件恶化，猪只容易感染疾病。通风不良会使猪舍内空气质量下降，有害气体浓度升高，刺激猪的呼吸道黏膜，降低猪只的抵抗力，为病毒感染创造条件。一些猪场在建设时，没有合理设计通风系统，或者在日常管理中不重视通风，使得猪舍内空气污浊，病毒容易在猪群中传播。饲料营养不均衡，缺乏维生素、矿物质等营养成分，会影响猪只的生长发育和免疫力，使猪更容易受到病毒的侵袭。若猪场使用的饲料质量不佳，或者在饲料配制过程中存在失误，导致饲料营养不均衡，就会影响猪只的健康，增加感染PRRSV的风险。疫苗接种是防控猪繁殖与呼吸综合征的重要手段之一，但疫苗的种类、质量以及免疫程序的合理性都会影响免疫效果。部分猪场使用的疫苗与当地流行毒株不匹配，导致免疫失败。在江苏地区，若猪场使用的疫苗针对的是其他地区的流行毒株，而不是本地的优势毒株，就无法有效地预防病毒感染。疫苗质量参差不齐，一些劣质疫苗可能存在免疫原性低、安全性差等问题，也会影响免疫效果。在市场上，存在一些假冒伪劣的疫苗产品，猪场若不慎购买使用，不仅无法起到免疫作用，还可能对猪只造成伤害。免疫程序不合理，如免疫时间过早或过晚、免疫剂量不足等，也会导致猪只不能产生足够的抗体，无法抵御病毒的侵袭。一些猪场没有根据猪群的实际情况制定科学的免疫程序，随意调整免疫时间和剂量，使得疫苗的免疫效果大打折扣。环境因素也会对疫病流行产生影响。猪场周边环境复杂，如靠近其他养殖场、屠宰场、农贸市场等，容易受到外来病毒的传入威胁。若猪场与其他养殖场距离过近，一旦其他养殖场发生疫情，病毒很容易传播到本场。卫生条件差，猪舍及周边环境清洁消毒不彻底，会导致病毒在环境中大量存活和繁殖，增加猪只感染的几率。在一些猪场中，猪舍地面、墙壁、饲养设备等没有定期进行清洁消毒，猪粪、污水等没有及时处理，使得病毒在环境中不断积累，猪只生活在这样的环境中，极易感染病毒。此外，气候变化、自然灾害等也可能影响猪只的健康和免疫力，进而影响疫病的流行。如暴雨、洪水等自然灾害可能导致猪场的防疫设施受损，猪只的生活环境恶化，增加病毒传播的风险。2.3讨论2.3.1与其他地区比较与国内其他地区相比，江苏地区猪繁殖与呼吸综合征的感染率处于中等偏上水平。安徽地区的研究显示，其优势毒株为高致病性PRRSV，部分猪场的感染率在40%-60%之间，江苏地区部分感染率与之相近，但优势毒株类型存在差异。天津地区类NADC30毒株已成为主要流行毒株，感染率在30%-50%之间，江苏地区虽然也有类NADC30毒株流行，但不同地区的感染率分布更为复杂，受到多种因素影响。山东地区类NADC30PRRSV可能已成为优势野毒毒株，部分猪场感染率达45%左右，江苏地区的流行情况与之类似，但在感染率的地域分布和不同猪群感染差异上有自身特点。河南地区类NADC30毒株为流行优势毒株，整体感染率在35%左右，江苏地区的感染率与之相当，但在感染率受饲养管理等因素影响的程度上有所不同。我国西南地区类NADC30毒株感染率高，成为流行优势毒株，部分区域感染率超50%，江苏地区与之相比，在气候、养殖模式等方面存在差异，导致感染率和流行特点有所不同。与国外部分地区相比，差异也较为明显。美国2009-2019年的调查显示，PRRSV-2（美洲型）占比96.3%，流行毒株总体分属于lineage1、lineage5、lineage8三个谱系，且lineage1占据样本中的大部分，其感染率在不同猪场波动较大，部分规模化猪场感染率在20%-40%之间。江苏地区虽然也以美洲型毒株为主，但谱系分布和流行特点受本地养殖环境和防疫措施影响，与美国存在差异。欧洲部分国家以欧洲型（Genotype1）毒株为主，感染率相对稳定，在15%-30%之间，与江苏地区流行毒株类型和感染率情况均不同。这些差异的原因主要包括养殖模式的不同，江苏地区规模化养殖与散户养殖并存，不同规模猪场的防疫水平和管理能力参差不齐，影响了病毒的传播和感染率；地理环境因素，江苏地处我国东部沿海，气候湿润，与其他地区的地理气候条件不同，可能影响病毒的存活和传播；疫苗使用和防疫措施的差异，不同地区使用的疫苗种类、免疫程序以及生物安全防控措施的执行力度不同，导致对病毒的防控效果和流行态势存在差异。2.3.2防控策略探讨基于本次调查结果，为有效防控江苏地区猪繁殖与呼吸综合征，应从多方面采取措施。在饲养管理方面，要合理控制饲养密度，根据猪舍的面积和设施条件，科学确定养殖数量，每头育肥猪的饲养面积应保持在0.8-1.2平方米，母猪每头饲养面积为2-2.5平方米，避免猪只过于拥挤。加强通风管理，安装合适的通风设备，如负压通风系统、水帘通风系统等，保证猪舍内空气新鲜，夏季通风量应达到每小时每头猪30-50立方米，冬季通风量为每小时每头猪10-20立方米，降低有害气体浓度。提供营养均衡的饲料，根据猪的不同生长阶段和营养需求，合理配制饲料，确保饲料中蛋白质、维生素、矿物质等营养成分的充足供应，提高猪只的免疫力。疫苗接种方面，需根据江苏地区的流行毒株类型，选择与之匹配的疫苗。目前市场上有灭活疫苗和减毒活疫苗，对于阳性不稳定猪场，可在严格评估风险后，选择安全性较高的减毒活疫苗进行免疫，但要注意疫苗的毒力返强风险；对于阳性稳定猪场，可逐渐减少减毒活疫苗的使用，加强生物安全措施，通过自然感染建立稳定的免疫状态；对于阴性猪场，应严禁使用减毒活疫苗，做好生物安全防护，防止病毒传入。同时，要制定科学的免疫程序，仔猪可在3-4周龄首免，6-8周龄二免；母猪可在配种前1-2周免疫一次，妊娠后期再免疫一次，并定期监测猪群的抗体水平，根据抗体检测结果调整免疫程序。生物安全措施至关重要。猪场应建立严格的人员和车辆进出管理制度，进入猪场的人员必须更换工作服和鞋，经过消毒通道和洗手消毒；车辆进入猪场前要进行全面消毒，包括车身、轮胎、底盘等部位。定期对猪舍及周边环境进行清洁消毒，每周至少进行2-3次的带猪消毒，可使用过氧乙酸、戊二醛等消毒剂，交替使用不同类型的消毒剂，避免病毒产生耐药性。加强病死猪的无害化处理，严禁随意丢弃病死猪，应采用焚烧、深埋等无害化处理方式，防止病毒传播扩散。此外，还应加强对养猪从业人员的培训，提高其疫病防控意识和专业技能，使其能够及时发现疫情并采取有效的防控措施。建立健全疫情监测和预警体系，定期对猪群进行疫病监测，及时掌握疫情动态，为防控决策提供科学依据。通过综合采取以上防控策略，有望降低江苏地区猪繁殖与呼吸综合征的发生率，保障养猪业的健康发展。三、猪繁殖与呼吸综合征病毒病原核衣壳蛋白3.1核衣壳蛋白结构与功能3.1.1蛋白结构特征猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的核衣壳蛋白（NucleocapsidProtein，N蛋白）在病毒的结构组成中占据关键地位。从氨基酸组成来看，N蛋白由大约123个氨基酸残基构成，其分子量相对较小，约为12-15kDa。在PRRSV的病毒粒子内部，N蛋白紧密包裹着病毒的单股正链RNA基因组，与RNA相互缠绕，共同形成了病毒的核衣壳结构，这种结构对于维持病毒基因组的稳定性起着至关重要的作用。在空间结构方面，N蛋白呈现出独特的构象。通过X射线晶体学和核磁共振等技术研究发现，N蛋白具有多个结构域，其N端区域富含精氨酸（Arg）、赖氨酸（Lys）和组氨酸（His），这些碱性氨基酸残基占该区域氨基酸总数的26%左右。它们所带的正电荷使得N蛋白能够与带负电荷的RNA基因组通过静电相互作用紧密结合，从而促进核衣壳的组装。N蛋白的C端区域在维持蛋白质整体构象上发挥着不可或缺的作用，它参与了蛋白内部以及蛋白与蛋白之间的相互作用，对稳定核衣壳的结构至关重要。而且，N蛋白的部分氨基酸序列会发生卷曲折叠，形成特定的二级结构，如α-螺旋和β-折叠等，这些二级结构进一步组装形成复杂的三级结构，使得N蛋白具备了特定的生物学功能。3.1.2功能特性在病毒复制过程中，N蛋白发挥着重要作用。当PRRSV感染宿主细胞后，病毒基因组RNA需要进行复制和转录，以产生新的病毒子代。N蛋白能够与病毒的非结构蛋白以及宿主细胞内的一些因子相互作用，参与病毒复制复合体的形成。研究表明，N蛋白可以与病毒的RNA聚合酶等非结构蛋白结合，协助其识别病毒基因组RNA上的复制起始位点，从而启动病毒基因组的复制过程。N蛋白还可能通过与宿主细胞内的某些蛋白相互作用，调节宿主细胞的代谢途径，为病毒的复制提供有利的环境。在病毒装配阶段，N蛋白是核衣壳组装的关键成分。随着病毒基因组RNA的复制和病毒结构蛋白的合成，N蛋白与新合成的RNA基因组相互结合，逐步组装形成核衣壳。N蛋白的N端富含碱性氨基酸，能够与RNA紧密结合，而其C端则参与了蛋白之间的相互作用，促使多个N蛋白分子有序排列，围绕RNA基因组形成稳定的核衣壳结构。核衣壳进一步与病毒的囊膜蛋白结合，完成病毒粒子的组装过程，最终形成具有感染性的成熟病毒粒子。从免疫反应角度来看，N蛋白具有极强的免疫原性，是诱导机体产生免疫应答的重要抗原之一。当猪感染PRRSV后，机体的免疫系统会迅速识别N蛋白，并产生针对它的特异性抗体。研究发现，感染PRRSV后约7-11天，机体首先产生针对N蛋白的抗体，随后才产生针对其他病毒蛋白的抗体，且该抗体在体内可维持一年以上。这些抗体虽然不具备中和病毒的活性，因为N蛋白位于病毒粒子内部，特异性抗体难以与之接触并阻止病毒感染细胞，但它们可以作为检测猪是否感染PRRSV的重要标志物。基于N蛋白的这一特性，在猪繁殖与呼吸综合征的诊断中，常利用检测血清中N蛋白抗体的方法来判断猪群的感染状况，为疫病的防控提供依据。3.2原核表达原理与优势3.2.1原核表达系统介绍原核表达系统是在基因工程领域广泛应用的一种表达外源蛋白质的工具，其核心由表达载体和宿主细胞两大部分构成。表达载体是一种精心设计的重组DNA分子，犹如一个精密的“分子机器”，承载着实现外源基因表达的关键元件。它包含起始位点，在大肠杆菌这一常用的原核表达宿主中，起始密码子通常为AUG，其作用如同开启基因表达旅程的“钥匙”，准确无误地启动蛋白质合成的第一步。表达基因则是表达载体的核心组件，不仅涵盖编码目标蛋白质的DNA序列，这是合成目标蛋白的“蓝图”，还包括转录启动子和转录终止子等重要序列。转录启动子就像是基因表达的“指挥官”，它能够精准地与宿主细胞内的转录因子相互作用，决定基因转录的起始时间和强度，不同类型的启动子，如常用的lac、Tac、PL、PR和T7启动子，其启动转录的能力和调控方式各有特点，研究人员可根据实验需求进行选择。转录终止子则像是表达过程中的“刹车”，它能有效控制转录的RNA长度，增强其稳定性，避免质粒上异常表达导致质粒稳定性下降，常见的如rrnBrRNA操纵子的T1T2串连转录终止子，可通过形成特定的结构来终止mRNA的转录。选择标记也是表达载体不可或缺的部分，常用的有抗生素抵抗基因和荧光标记基因等，它们就像给含有目标基因的细胞贴上了特殊的“标签”，研究人员可以利用这些标记，轻松筛选出成功导入表达载体的细胞，提高表达效率。复制起点则赋予表达载体在宿主细胞内自我复制的能力，使得表达载体能够在细胞内大量扩增，从而为后续的基因表达提供充足的模板。宿主细胞是实现表达载体遗传信号转录、翻译和合成目标蛋白质的“工厂”。在原核表达中，常用的宿主菌有大肠杆菌和枯草芽孢杆菌等。大肠杆菌作为最常用的原核表达宿主，具有遗传背景清晰、繁殖速度极快（在适宜条件下，其繁殖一代仅需约20分钟）、成本低廉、表达量高以及技术成熟且易于操作等显著优势。例如，在生产一些结构相对简单、不需要复杂翻译后修饰的蛋白质时，大肠杆菌表达系统表现出色，像用于科学研究的某些酶类、细胞因子等，都可以通过大肠杆菌表达系统高效生产。枯草芽孢杆菌则具有较强的分泌能力，能将表达的蛋白分泌到细胞外，这一特性使得后续的分离纯化工作更加便捷，并且它还具有一定的抗逆性，在一些较为恶劣的环境条件下也能顽强生长和表达蛋白。3.2.2优势分析原核表达在多个方面展现出独特的优势。在成本方面，原核表达系统的培养条件相对简单，对培养基的要求不高，常用的LB培养基价格低廉，且宿主菌如大肠杆菌生长迅速，繁殖周期短，能在短时间内获得大量菌体，大大降低了生产成本，适合大规模工业化生产。相比之下，真核表达系统如哺乳动物细胞表达系统，其培养条件苛刻，需要使用昂贵的培养基和血清，且细胞生长速度缓慢，大规模培养的成本极高。从表达量来看，原核表达系统具有高效表达的特点。由于原核生物的代谢速率快，在适宜的条件下，其基因表达水平较高。通过选择合适的强启动子，如T7启动子，能够驱动外源基因大量转录和翻译，从而获得高产量的目标蛋白。在一些研究中，利用原核表达系统表达的某些蛋白质，其表达量可占细胞总蛋白的30%以上，这是许多真核表达系统难以达到的。操作难度上，原核表达系统操作相对简便。原核生物的遗传背景清楚，基因操作技术成熟，如质粒的转化、筛选等过程简单易行。研究人员可以通过常规的分子生物学方法，如PCR、酶切、连接等，快速构建表达载体，并将其导入宿主细胞中。而真核表达系统，尤其是哺乳动物细胞表达系统，细胞转染效率较低，且细胞培养过程中容易受到污染，操作难度较大。此外，原核表达系统可供选择的菌株及配套载体丰富，研究人员可以根据目标蛋白的特性、实验需求等灵活选择合适的表达系统，为实验的顺利开展提供了更多的可能性。四、江苏地区猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白原核表达实验4.1实验材料与方法4.1.1实验材料本实验选用江苏地区分离得到的猪繁殖与呼吸综合征病毒毒株，其经过前期的流行病学调查和病毒鉴定，确定为在江苏地区具有代表性的流行毒株，为后续的研究提供了真实可靠的病毒样本来源。表达载体选择pET-30a，它是一种常用的原核表达载体，具有T7启动子，能高效启动外源基因的转录；多克隆位点便于目的基因的插入；还携带卡那霉素抗性基因，可用于重组质粒的筛选。宿主菌采用大肠杆菌BL21（DE3），其遗传背景清晰，对表达载体的兼容性良好，能够高效表达外源蛋白，并且具有易于培养、生长速度快等优点。实验所需的试剂包括RNA提取试剂盒，用于从感染病毒的细胞或组织样本中提取高质量的RNA，其提取原理基于硅胶膜吸附技术，能有效去除杂质，获得纯度较高的RNA；反转录试剂盒，可将提取的RNA逆转录为cDNA，为后续的基因扩增提供模板，包含逆转录酶、引物、缓冲液等关键成分；高保真DNA聚合酶，在PCR扩增目的基因时，能保证扩增产物的准确性，减少碱基错配的发生，提高扩增效率和特异性；限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ，用于对表达载体和目的基因进行酶切，产生互补的粘性末端，便于后续的连接反应；T4DNA连接酶，能够催化表达载体和目的基因的粘性末端连接，形成重组质粒；IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）作为诱导剂，可诱导宿主菌表达外源蛋白，通过与阻遏蛋白结合，解除对T7启动子的抑制，从而启动目的基因的表达；DNAMarker用于在电泳过程中指示DNA片段的大小，便于判断PCR扩增产物和酶切产物的大小；蛋白质Marker则用于SDS-PAGE电泳中指示蛋白质的分子量，帮助确定表达蛋白的大小；其他试剂如琼脂糖、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、Tris、甘氨酸、SDS等，用于配制电泳缓冲液、凝胶等，是分子生物学实验中常用的试剂。仪器设备涵盖PCR仪，用于进行基因扩增反应，通过精确控制温度的变化，实现DNA的变性、退火和延伸过程；高速冷冻离心机，可在低温条件下对样本进行离心，用于分离血清、沉淀菌体、提取核酸等操作，能有效保护生物分子的活性；恒温摇床，用于培养大肠杆菌，提供适宜的温度和振荡条件，促进菌体的生长和繁殖；电泳仪及电泳槽，用于进行核酸和蛋白质的电泳分离，根据分子大小和电荷的差异，将不同的分子分离开来；凝胶成像系统，可对电泳后的凝胶进行拍照和分析，检测核酸和蛋白质的条带，实现对实验结果的可视化观察；恒温培养箱，用于培养大肠杆菌和进行其他需要恒温条件的反应，保证实验条件的稳定性。4.1.2实验方法基因克隆阶段，首先依据GenBank中登录的猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白基因序列，运用专业的引物设计软件，如PrimerPremier5.0，精心设计一对特异性引物。上游引物：5'-CGGGATCCATGACCCAGAAGACGGCTAA-3'（下划线部分为BamHⅠ酶切位点），下游引物：5'-CCCAAGCTTTTAGGGCGATGCTGTAGTCC-3'（下划线部分为HindⅢ酶切位点）。利用RNA提取试剂盒从感染PRRSV的细胞中提取总RNA，操作过程严格按照试剂盒说明书进行，确保RNA的完整性和纯度。提取的RNA经反转录试剂盒逆转录为cDNA，反应体系为20μL，包含5×逆转录缓冲液4μL，dNTPs（10mmol/L）2μL，随机引物（50μmol/L）1μL，逆转录酶1μL，RNA模板5μL，RNase-free水7μL，在37℃条件下反应60min，然后85℃5min灭活逆转录酶。以cDNA为模板，使用高保真DNA聚合酶进行PCR扩增，反应体系为25μL，包括10×PCR缓冲液2.5μL，dNTPs（2.5mmol/L）2μL，上下游引物（10μmol/L）各1μL，高保真DNA聚合酶0.5μL，cDNA模板2μL，ddH₂O16μL。反应条件设置为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共进行35个循环；最后72℃延伸10min。PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外凝胶成像系统下观察，若出现与预期大小相符的条带，则表明基因克隆成功。载体构建时，将PCR扩增得到的核衣壳蛋白基因片段和表达载体pET-30a分别用限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ进行双酶切。酶切体系均为20μL，包含10×Buffer2μL，BamHⅠ和HindⅢ各1μL，DNA模板（基因片段或载体）10μL，ddH₂O6μL，37℃水浴酶切3h。酶切产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分离后，使用胶回收试剂盒回收目的条带，确保回收的DNA片段纯度和完整性。将回收的基因片段和表达载体按照摩尔比3:1的比例，加入T4DNA连接酶进行连接反应。连接体系为10μL，包括10×T4DNA连接酶Buffer1μL，T4DNA连接酶1μL，回收的基因片段6μL，回收的表达载体2μL，16℃连接过夜。连接产物即为重组质粒pET-30a-N。转化过程中，将连接产物加入到制备好的大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min，使重组质粒充分吸附到感受态细胞表面。然后将离心管放入42℃水浴中热激90s，迅速冰浴2min，促进重组质粒进入感受态细胞。向离心管中加入800μL无抗生素的LB液体培养基，37℃、200r/min振荡培养1h，使细胞复苏并表达抗性基因。将培养后的菌液均匀涂布在含有卡那霉素（50μg/mL）的LB固体培养基平板上，37℃倒置培养12-16h，待长出单菌落。挑取单菌落接种到含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200r/min振荡培养过夜，提取质粒进行酶切鉴定和测序验证，确保重组质粒构建正确。诱导表达阶段，将鉴定正确的重组菌接种到含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200r/min振荡培养至OD₆₀₀值达到0.6-0.8，此时细菌处于对数生长期，生长状态良好。加入IPTG至终浓度为0.5mmol/L，继续诱导培养4h。诱导结束后，将菌液转移至离心管中，4℃、5000r/min离心10min，收集菌体。用PBS缓冲液洗涤菌体2-3次，去除培养基残留。蛋白纯化时，将收集的菌体用适量的PBS缓冲液重悬，冰浴条件下进行超声破碎，功率设置为200W，超声3s，间隔5s，共超声30min，使菌体充分破碎，释放出表达的蛋白。破碎后的菌液4℃、12000r/min离心30min，收集上清液和沉淀。上清液中含有可溶性表达的蛋白，沉淀则为包涵体形式的蛋白。若目的蛋白主要以包涵体形式存在，需对包涵体进行洗涤和变性复性处理。用含有8mol/L尿素的洗涤缓冲液洗涤包涵体3-4次，去除杂质。然后将包涵体溶解在含有8mol/L尿素的变性缓冲液中，4℃搅拌过夜，使包涵体充分溶解。将溶解后的包涵体溶液缓慢滴加到含有20mmol/LTris-HCl（pH8.0）、0.5mol/LNaCl、10%甘油的复性缓冲液中，4℃复性24-48h，使蛋白逐渐恢复天然构象。复性后的蛋白溶液通过Ni-NTA亲和层析柱进行纯化，Ni-NTA树脂能特异性结合带有His标签的蛋白，而重组蛋白在构建时引入了His标签，因此可以通过亲和层析将目的蛋白与其他杂质分离。用含有咪唑的洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，收集洗脱峰，通过SDS-PAGE电泳检测纯化效果。4.2实验结果4.2.1基因克隆与载体构建结果利用设计的特异性引物对提取的PRRSVRNA进行RT-PCR扩增，扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示。在凝胶成像系统下，可见在约372bp处出现一条清晰的条带，与预期的猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白基因大小相符，表明成功扩增出目的基因片段。这一结果得益于精心设计的引物，其与目标基因序列具有高度的互补性，在PCR反应过程中，引物能够准确地与模板cDNA结合，引导DNA聚合酶沿着模板进行扩增，从而获得了特异性的目的基因扩增产物。[此处插入图1：RT-PCR扩增PRRSV核衣壳蛋白基因电泳图，M为DNAMarker，1为PCR扩增产物]将扩增得到的核衣壳蛋白基因片段和表达载体pET-30a分别用限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ进行双酶切，酶切产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分离后，回收目的条带进行连接反应，构建重组质粒pET-30a-N。对重组质粒进行酶切鉴定，酶切体系为20μL，包含10×Buffer2μL，BamHⅠ和HindⅢ各1μL，重组质粒10μL，ddH₂O6μL，37℃水浴酶切3h。酶切产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示。M为DNAMarker，1为重组质粒pET-30a-N双酶切产物，在约5369bp处出现表达载体pET-30a的条带，在约372bp处出现核衣壳蛋白基因片段的条带，与预期结果一致，证明重组质粒构建成功。酶切鉴定过程中，限制性内切酶能够特异性地识别并切割DNA序列，BamHⅠ和HindⅢ分别在表达载体和目的基因上的特定酶切位点进行切割，产生互补的粘性末端，通过T4DNA连接酶的作用，将两者连接形成重组质粒，酶切鉴定结果直观地展示了重组质粒的正确构建。[此处插入图2：重组质粒pET-30a-N酶切鉴定电泳图，M为DNAMarker，1为重组质粒pET-30a-N双酶切产物]为进一步验证重组质粒的正确性，对其进行测序分析。将测序结果与GenBank中登录的猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白基因序列进行比对，结果显示两者的核苷酸序列同源性高达99%以上，仅有个别碱基差异，且这些差异不影响氨基酸的编码，表明克隆的核衣壳蛋白基因序列正确，重组质粒pET-30a-N构建准确无误，可用于后续的原核表达实验。4.2.2蛋白表达与纯化结果将鉴定正确的重组菌接种到含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200r/min振荡培养至OD₆₀₀值达到0.6-0.8，加入IPTG至终浓度为0.5mmol/L，继续诱导培养4h。诱导结束后，收集菌体进行SDS-PAGE电泳检测，结果如图3所示。M为蛋白质Marker，1为未诱导的重组菌裂解液，2为诱导后的重组菌裂解液。在约17kDa处，诱导后的重组菌裂解液出现一条明显的条带，与预期的融合蛋白大小相符，而未诱导的重组菌裂解液在此位置无条带出现，表明猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白在大肠杆菌中成功表达。在表达过程中，IPTG作为诱导剂，能够与阻遏蛋白结合，解除对T7启动子的抑制，从而启动目的基因的转录和翻译，使得核衣壳蛋白得以表达。[此处插入图3：SDS-PAGE分析PRRSV核衣壳蛋白表达结果，M为蛋白质Marker，1为未诱导的重组菌裂解液，2为诱导后的重组菌裂解液]对诱导表达后的重组菌进行超声破碎，离心后分别收集上清液和沉淀，进行SDS-PAGE分析，以确定蛋白的表达形式。结果如图4所示，M为蛋白质Marker，1为超声破碎后的上清液，2为超声破碎后的沉淀。目的蛋白主要存在于沉淀中，表明该蛋白在大肠杆菌中主要以包涵体形式表达。包涵体的形成可能是由于重组蛋白在大肠杆菌中表达速度过快，折叠过程异常，导致蛋白质聚集形成不溶性的包涵体。[此处插入图4：SDS-PAGE分析PRRSV核衣壳蛋白表达形式，M为蛋白质Marker，1为超声破碎后的上清液，2为超声破碎后的沉淀]由于目的蛋白主要以包涵体形式存在，需对包涵体进行洗涤和变性复性处理，然后通过Ni-NTA亲和层析柱进行纯化。纯化后的蛋白经SDS-PAGE检测，结果如图5所示。M为蛋白质Marker，1为纯化后的重组蛋白。在约17kDa处出现单一的条带，表明获得了高纯度的猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白。Ni-NTA亲和层析柱能够特异性地结合带有His标签的重组蛋白，通过洗脱缓冲液将其洗脱下来，实现了蛋白的纯化。[此处插入图5：SDS-PAGE分析PRRSV核衣壳蛋白纯化结果，M为蛋白质Marker，1为纯化后的重组蛋白]为进一步验证纯化后蛋白的正确性，进行Westernblot分析。以抗PRRSV的阳性血清为一抗，HRP标记的羊抗猪IgG为二抗，结果如图6所示。在约17kDa处出现特异性条带，表明纯化后的蛋白为猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白，且具有良好的抗原特异性，能够与抗PRRSV的阳性血清发生特异性反应。[此处插入图6：Westernblot分析PRRSV核衣壳蛋白结果，1为纯化后的重组蛋白]4.3讨论4.3.1表达条件优化在原核表达过程中，诱导剂浓度、诱导时间和温度等因素对蛋白表达有着显著影响。本实验中，初始设定IPTG浓度为0.5mmol/L进行诱导表达，虽成功获得目的蛋白，但为进一步提高表达量和优化表达效果，有必要对诱导剂浓度进行深入探究。相关研究表明，IPTG浓度的变化会直接影响蛋白的表达水平。当IPTG浓度较低时，其与阻遏蛋白的结合量有限，无法充分解除对T7启动子的抑制，导致目的基因转录和翻译的效率低下，蛋白表达量不高。而当IPTG浓度过高时，可能会对宿主菌的生长产生抑制作用，甚至影响蛋白的正确折叠，导致包涵体的大量形成。诱导时间同样是关键因素。本实验初步设定诱导时间为4h，然而不同的蛋白在不同的表达系统中，其最佳诱导时间存在差异。诱导时间过短，目的基因的转录和翻译过程可能尚未充分进行，蛋白表达量达不到预期；诱导时间过长，一方面可能会增加宿主菌的代谢负担，导致菌体生长受到抑制，另一方面，长时间的诱导可能会使表达的蛋白发生降解，影响蛋白的产量和质量。温度对蛋白表达也不容忽视。37℃是大肠杆菌生长和蛋白表达常用的温度，在此温度下，大肠杆菌代谢旺盛，生长速度快。但对于某些蛋白而言，37℃可能并非最适表达温度。较低的温度，如25℃-30℃，可以降低蛋白的合成速度，使蛋白有更充足的时间进行正确折叠，减少包涵体的形成，提高可溶性蛋白的表达量；而较高的温度虽然能加快菌体生长和蛋白合成速度，但可能会导致蛋白错误折叠，增加包涵体的比例。基于上述分析，后续研究可设置不同的IPTG浓度梯度（如0.1mmol/L、0.3mmol/L、0.5mmol/L、0.7mmol/L、1.0mmol/L），在其他条件相同的情况下进行诱导表达，通过SDS-PAGE电泳分析不同浓度下蛋白的表达量和表达形式，从而确定最适的IPTG浓度。对于诱导时间，可设置2h、4h、6h、8h、10h等不同时间点，同样通过SDS-PAGE电泳检测蛋白表达情况，找出最佳诱导时间。在温度优化方面，分别设置25℃、30℃、37℃等不同温度条件进行诱导表达，比较不同温度下蛋白的表达