一种新型无机复合材料的制备及在髓室底穿孔中的应用

一种新型无机复合材料的制备及在髓室底穿孔中的应用

复合磷酸钙：磷酸钙水泥是一种新型的自固化非陶瓷羟基磷灰石材料・。在生理条件下，它

具有原位硬化、反应平静、生物兼容性好、抗压强度低、硬化时间长等特点。磷酸镁水泥

是一种无机反应的阴离子磨剂。在人体生理环境下，可以自行硬化，形成磷酸镁生物矿。

具有固结速度快、早结强度高、胶粘度好等特点。以磷酸钙、磷酸镁水泥为主基的复合磷

酸钙镁基水门汀具有固化速度较快、固化反应较温和、抗川强度高、生物相容性好等特点,

载入其他具有特殊性能的材料可提高复合磷酸钙镁基水门汀材料的相关性能，但其生物相

容性与安全性还需要深入探究。

生物相容性:材料在宿主特定部位应用时所产生的一种合乎要求的性能。所谓“合乎要求

的性能”应包括2个方面的内容:一方面是指用于人体的生物材料在应用过程中对生物体

组织或器官不产生不良反应(如毒性、刺激性、致敏性、致突变性、致癌性、溶血或凝血

性等)，即不存在生物危害性；另一方面是生物体环境对被接触的材料也应没有不良作用

存在。

0髓底穿胶质材料特点

牙齿髓室底穿孔后髓腔和牙周组织连通，如修补不及时或修补不当，极易导致牙周组织炎

症，牙槽骨吸收，最终造成患牙被拔除。因此，髓室底穿孔治疗的关键在于修复穿孔，才

能有效消除炎症，促进牙周组织再生

目前已应用或报道的髓底穿孔修复材料种类繁多，临床上曾使用或正在使用的有银汞合金、

兔合树脂、Super-EBA.钙盐类、MTA等，但这些材料都具有一定局限性，迄今尚未有性能

理想的材料问世，故髓底穿孔患牙保存率很低。为了提高髓室底穿孔患牙的保存率，许多

研尢者都致力于研制具有良好物理机械性能和生物学性能的髓底穿修复材料。理想的髓室

底穿孔修复材料应具有良好的生物相容性，无毒、无免疫原性，对组织无刺激，能促进牙

周组织修复再生，诱导骨或牙骨质形成，封闭性能好，并有杀菌、抑菌作用，价格低廉，

操作简便

为了提高髓室底穿孔患牙的保存率，课题组研制了•种新型的自固化复合无机材料一一磷

酸钙-磷酸镁-硅酸钙-碳酸蚀复合材料(calciumphosphate/magnesium

phosphate/ca1ciumsi1icate/bismuthsubcarbonatezement,CMSBC),用于修补能室

底穿孔。该复合材料各组成成分的某些特性符合理想髓底穿孔修复材料的要求。磷酸钙骨

水泥(calciumphosphate,CPC)在生理环境下可形成与天然骨化学组成、结晶度接近的

低结晶度类骨磷灰石

前期实验结果显示，CMSBC材料具有优秀的临床操作性能和良好的理化机械性能

1材料和方法

L1项目设计

1.2时间和地点

1.3材料表面

1.3.1明剂和剂胶的制备

磷酸钙-磷酸镁-硅酸钙-碳酸铀复合材料（CMSBC）由中国科学院上海硅酸盐研究所制备，

由粉剂和液剂组成，使用时按照粉液比1g/mL调和均匀固化。

1.3.3试剂与试剂盒

L929细胞（中科院上海细胞研究所）；组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌TA97、TA98、

TA100.TA102（Molecula:Toxicology公司，美国）；CCK-8试剂盒（南京凯基生物科技

发展有限公司，中国）；DMEY培养基及胎牛血.清（"clone公司，美国）；胰蛋白酶及青/

链霉素（Gibe。公司，美国）。

CO

1.4实验方法

1.4.1制备0.2mmL3mm的样本

CMSBC材料按照粉液比1g/mL均匀调和呈糊状充填于模具中制成5mmXImmX30nin的

样本。固化后的CMSBC样本采用环氧乙烷消毒，按照标准表面积与浸提液体积比例为3cm

取对数生长期的L929细胞制备成为细胞浓度为5.0X10

1.4.2抗凝兔血的稀释和贮藏

抽取检疫合格的新西兰兔血20mL,加入1mL2%草酸钾生理盐水溶液，制备新鲜抗凝

兔全血。生理盐水稀释新鲜抗凝兔全血，直至0.2mL稀释抗凝兔血溶于10mL蒸馀水

后545nm波长的吸光度值在0.8±0.3范围内，随后将稀释抗凝兔血4℃贮存。

根据IS010993标准规定，制备形状规则的CMSBC试样，消毒后按照没提介质生理盐△与

试样表面积比例为6cm

溶血率二（A

1.4.3小鼠体内条件密度测量

清洁级昆明小鼠20只，随机分为实验组和对照组，每组雌雄各5只，实验期间给予实验

室标准饮食。按50mL/kg的剂量标准，无菌条件下经小鼠尾静脉缓慢注入相应的液体，

实验组为CMSBC材料浸提液（浸提液方法制备同溶血实验），对照组为生理盐水。注射后

即刻，24,48,72h观察小鼠的一般情况，称量并记录体质量变化。观察指标及毒性分级

见表2。

1.4.4大鼠肝脏干物质的含量

实验菌株组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌TA97、TA98、TA100.TA102,在实验前进行下

列鉴定：（1）组氨酸需求（his

活化系统:S-9及S-9mix均按Ames原法要求制作、使用和保存。

S-9:用多氯联苯1254（Aroclor1254）诱导成年雄性SD大鼠（将多氯联苯溶于玉米油中，

质量浓度为200g/L,腹腔一次性注射500mg/kg）,5d后处死，处死前禁食1d,饮水

不限。无菌条件下取大鼠肝脏，无菌冰浴条件下采用匀浆机制作大鼠肝匀浆，rc9

OOOXg低温离心15min,取上清液。经无菌及酶活性检验合格后，-80℃超低温保存备用。

S-9mix:在S-9基础上添加辅助因子NADP及相关盐溶液，用时即配。

测试样品浸提液制备:CMSBC试样消毒灭菌后，以生理盐水作为浸提介质，参照

GB/T16886.12所规定的浸提液制备方法，制备浸提液。浸提温度（37±1）℃,浸提时间

72h,浸提比例为6cm

阴性对照:生理盐水。

阳性对照:非活化（T9）系统阳性药物敌克松终质量浓度50ng/皿，叠氮钠终质量浓度

2>g/皿;活化（+S9）系统阳性药物环磷酰胺的终质量浓度200ug/皿，2-氨基笏终质量浓

度20ug/皿，1,8-二羟基慈酿终质量浓度50ng/皿。

非活化试验中，向保温的2.0mL顶层培养基中加入样品浸提液或阴性/阳性对照品0.1m

L,增菌液0.1mL及0.5mL磷酸盐缓冲液混匀，迅速倾入底层培养基上，使其均匀分

布。

活化试验中，于顶层培养基中分别加入样品浸提液或阴性/阳性对照品0.1mL,增菌液

0.1mL和0.5mLS-9nix混匀，迅速倾入底层培养基上，使其均匀分布。每组均没6

个平行皿，待顶层凝固翻转平板，置37℃培养72h,计数各皿回复突变菌落数。

1.5急性外周血毒性实验

（1）细胞相对增殖率及细胞毒性分级；（2）溶血率；（3）急性全身毒性实验动物体质量;

（4）Ames实验回复突变菌落数。

1.6统计分析

2结果的结果

2.1细胞结构和细胞破碎

倒置显微镜下观察CMSBC实验组与阴性对照组无明显差异，细胞形态正常，胞内结构清晰,

无空泡变性，并随着培养时间延长细胞大量增殖。阳性对•照组细胞数量明显减少，细胞变

圆漂浮，随着培养时间的延长，细胞形态完整性破坏，最终形成大量细胞碎片。细胞相对

增殖率及细胞毒性分级见表3。

2.2吸光度值的测定

见表4。阴性对照管的吸光度小于0.03,阳性对照管的吸光度值在0.8±0.3范围内，符

合国家标准。CMSBC实验组的平均吸光度值为0.0186,溶血率为1.17%,低于5%,溶血

实验结果为阴性。

2.3小鼠体质量变化

在72h观察期内，CMSBC实验组和对照组小鼠活动如常，均未观察到运动功能减退、步态

失稳、震颤、呼吸困难、腹泻等异常表现。各组小鼠的体质量变化见表5,CMSBC实验组

与对照组相比差异无显著性意义(P>0.05);对照组各时间段的体质量比较，差异无显著

性意义(P>0.05);CMSBC实验组各个时间段的体质量比较，差异也无显著性意义

(P>0.05)o

2.4诱变阳性标准

根据YY/T0127.10标准，检测样品的回复突变菌落数超过阴性对照2倍，有剂量-效应关

系或某一个或某几个剂量点的可重复性，并有统计学意义的阳性反应，则判为诱变阳性。

由表6可见，无论在活化(+S9)还是非活化QS9)条件下，CMSBC试样均未引起测试菌

株回复突变菌落数的明显增加，而阳性对照组引起测试菌株的回复突变菌落数明显增加，

并超过阴性对照组2倍以上，显示CMSBC材料的回复突变实验结果为阴性。

3体外生物行为的生物学研究

磷酸钙骨水泥是一种新型的自固化的非陶瓷羟基磷灰石材料，当固相粉末与液相溶液按照

一定比例调和后可在人体生理环境下自行固化。磷酸钙骨水泥固化产物的化学成分通常为

羟基磷灰石或缺钙羟基磷灰石，与人体硬组织的无机成分类似

磷酸镁水泥是一种无机反应型胶黏剂，在人体生理环境下能自行固化形成磷酸镁类生物矿

石，具有固化速度快、早期强度高、胶黏性好的特点

硅酸钙具有很高的生物活性，在模拟体液中其表面类骨璘灰石的形成速度比其他生物玻璃

和玻璃陶瓷更快

钮剂具有收敛、止泻、防腐作用，可以吸附毒素，对细菌、病毒乃至锥虫及螺旋体等有很

好的抑制与杀灭活作用

因此，作者希望能利用磷酸钙骨水泥、磷酸镁水泥、硅酸钙、碳酸锌等材料各自的优势，

研制一种具有良好理化机械性能和生物性能的复合齿科材料修复髓室底穿孔。作为一种与

牙体组织、骨组织直接接触的生物材料，首先必须具有良好的生物相容性，对人体无毒、

无刺激，对人体组织、血液等系统没有不良反应。目前，评价生物材料生物相容性及安全

性的手段通常包括体外和体内两种实验途径。体外实验是将材料或其浸提液在体外环境下

与细胞或组织接触，观察材料对细胞数量、形态及分化的影响。体内实验则是将材料直接

与动物体接触，观察植入体周围组织反应的情况，这类实验模拟了人体的生理环境，与材

料的最终应用状况接近。实验依据IS010993和GB/T16886相关的生物学评价标准，选择

了细胞毒性实验、溶血性实验、急性全身毒性实验和Ames实验4种较为常见的生物学实

验方法对新型复合材料CMSBC的生物相容性及安全性进行初步评价。

细胞毒性实验是用来评价齿科材料造成细胞损伤的潜在可能性，并预测最终应用于生物体

时的组织细胞反应。通过体外细胞培养技术，可检测材料接触细胞后细胞发生生K抑制、

功能改变、溶解、死亡或其他毒性反应。实验选择的CCK-8比色法是细胞毒性实验中应用

较广泛的一种,其中所含的WST-8(2-(2-methoxy-4-nitropheny1)-3-(4-nitrophenyl)

-5-(2,4-disulfophenyl)-2H)在电子载体(l-MethoxyPMS)的作用F能被细胞线粒

体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的橙黄色甲膜物(Forniazandye),且所生成的甲嗔

物的数量与活细胞的数量成正比，因此可直接通过酶标仪测量细胞液的吸光度值，检测出

待测细胞样品的存活细胞数最的多少及细胞代谢活性的强弱。与MTT法不同，使用CCK-8

检测细胞毒性时既不需要使用裂解液溶解沉淀，也不需要吸取上清。该方法有助于减少因

为不同裂解液溶解能力的差异，背景信号对吸光度值所产生的系统误差，以及吸取上清液

过程中可能带走部分细胞所导致的偶然误差。因此，与传统的MTT比色法相比，CCK-8法

具有操作更简便省时，重复性好，灵敏度更高等优点

血液相容性是生物材料与血液接触时对血液破坏作用的最度

急性全身毒性实验是常用的生物学性能检测方法

Ames实验是曰前世界范围内应用最广泛的短期内检测化合物致突变方法之一，是由美国学

者B.N.Ames于1975年建立并不断发展完善的。Ames实验是利用鼠伤寒沙门氏菌

(Salmon)latyphimurium)组氨酸营养缺陷型突变(his-)菌株在缺乏组氨酸的培养基中,

只有极少数自发回复突变的细菌才能生长，其余细菌仅能分裂几次，故所生成的微菌落仅

在显微镜下才可见。当受到诱变剂作用后，大量his-筐株回复突变为可自行合成组氨酸的

his+菌株，发育成肉眼可见的菌落

结论:初步研究证实CMSBC•材料具有良好的生物相容性、生物安全性，但作为与人体组织

直接接触的牙科修复材料，该材料是否有生殖毒性、是否干扰免疫系统、具体的降解过程

以及长期对机体的影响等，这些都需要进一步深入研究探讨。

作者贡献:第一作者构思并设计实验，全部作者共同分析文献资料并实施实验，第一作者

成文。

经费支持:该文章接受了“国家自然科学基金项目（81390917）”的资助。所有作者声明，

经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。

利益冲突:所有作者共同认可文章无相关利益冲突。

伦理问题:实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》

和本地及国家法规。实验动物在麻醉下进行所有的手术，并尽一切努力最大限度地减少其

疼痛、痛苦和死亡。文章的撰写与编辑修改后文章遵守了《动物实验体内实验研究报告规

范指南》（ARRIVE指南）。

文章查重：文章出版前已经过CNKI反剽窃文献检测系统进行3