药品微生物检验常见问题

问：沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA）上

会不会生长细菌？

答：SDA不是选择性培养基，而是一种广谱的增菌培养基，pH范

围5.4-5.8,某些细菌是可以在SDA上生长的，霉菌和酵母菌总

数计数时SDA上生长的菌均应计入霉菌和酵母菌总数；或者可以

经过评估选择含有抗生素（如氯霉素）的SDA或者玫瑰红钠琼脂

培养基进行霉菌和酵母菌总数计数。

问：琼脂培养基为什么需要倒置培养？

答：在进行微生物培养时，若正置培养，琼脂培养基中的水分易

蒸发使平板干裂，不利于微生物的生长：同时水蒸汽会在平皿盖

上形成冷凝水，若回落在培养基表面，会使菌落要延生长，无法

计数，若冷凝水太多会使培养基与平皿分离，容易滑动倒置培养

可减少培养基表面的空气流动，减慢培养基中水分蒸发的速度，

充分维持弹性，有利于菌株的生长和繁殖，防止空气中杂菌对培

养基及培养物造成污染；也会由于重力作用在一定程度上使营养

物质沉积到培养基表面，有利于微生物利用营养物质；倒置的平

板方便拿取，避免环境中杂菌的污染。中国药典2015版1105中

关于平皿法（倾注法）有明确要求。需要注意的是，《食品安全

国家标准食品微生物学检验霉菌和酵母计数》（GB4789.15-2016）

是要求正置培养，而非倒置，以防霉菌泡子形成次生菌落，影响

计数结果。

问：中国药典2015版要求霉菌和酵母菌平皿计数时培养5-7天，

那么培养5天可以么？

答：微生物限度检查中霉菌和酵母菌培养时间5-7天，因不同的

霉菌酵母菌生长特性不同，所以具体培养时间，由企业根据各自

情况（基于风险评估）自行确定。

问：中国药典2015版要求霉菌和酵母菌平皿计数时培养5-7天,

该如何计数？

答：但是在实际操作中，我们会发现如果样品中存在霉菌，培养

到第5-7天时，可能菌落之间已经融合，并蔓延生长至整个平皿，

此时的霉菌已经无法计数。建议霉菌和酵母菌检测时，第三天计

一次数，培养结束时计一次数，比较两组数据，以多者为最终结

果。霉菌和酵母菌检测培养过程中，避免频繁取拿观察，尽量避

免振动等，防止抱子扩散。

问：药企的环境检测应该依据那个标准？

答：关于环境检测，2015版《中国药典》的9205和GB/T16294-2010

《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》

都有规定，且一些细节略有差别。其中国标的规定更为具体，建

议实际操作中以国标为准，药典可以做为参考。

问：一些不常用的培养基开瓶后在效期内较长时间没有用完，那

么这些开瓶后的培养基需要进行复验吗？

答：开瓶后的培养基，如果长时间不使用，还在效期内，建议开

瓶后间隔1年进行复验。如果出现结块，则不能使用。同理，如

果同一批次一次购买量较多，一年内未使用完，也建议进行复检。

问：薄膜过滤法，滤膜边缘长了一圈菌，原因有哪些？

答：出现这个现象，可能的原因(常见)包括以下三个方面：

(1)滤杯：无论是一次性的滤杯还是反复灭菌的滤杯，理论上都

是无菌的，但是不排除滤杯灭菌不彻底和使用时操作人员与滤杯

底部接触，污染滤杯的可能。

(2)微限仪的滤头：微限仪滤头如果在更换滤膜的过程中灭菌不

彻底，上一个样品可能会污染下一批滤膜，如果微限仪长时间不

灭菌，或使用的滤膜破损，都可能使微限仪内部管道带菌，在泵

开启的瞬间形成气溶胶，污染滤头。

(3)转移过程中被污染：在滤膜由滤头转移至平皿的过程中，镶

子灭菌不彻底，操作者手不稳使滤膜和仪器，台面，平皿，身体

发生过接触。

具体问题具体分析，如果出现这样的问题，需要根据实验室的实

际情况具体分析。

问：控制菌检查法中用到的培养基，在做培养基适用性的时候，

其中有“指示特性”的表述，那么“指示特性”是指的什么意思？

答：培养基指示特性包括菌落大小、形态特征、指示剂反应情况

(菌落颜色变化)等。例如大肠埃希氏菌在麦康凯琼脂培养基上

桃红色菌落有沉淀环、乙型副伤寒沙门菌在XLD有黑心等。

包括微生物负载量、微生物特性、产品特性、给药途径、对患者

潜在影响等。

问：培养基灭菌没有按照厂家提供的灭菌

参数进行，是否可行？

答：可以。厂家产品说明书提供的灭菌参数可作为参考使用，使

用单位也可以根据自己实验室的实际情况，在相关法规要求内，

使用自己验证过的灭菌参数来执行。

问：草酸钾兔血浆和兔血浆的用途分别是什么？

答：草酸钾兔血浆用于溶血性链球菌链激酶试验，致病性乙型溶

血性链球菌能产生链激酶（即溶纤维蛋白酶），此酶能激活正常人

体血液中的血浆蛋白酶原，使生成血浆蛋白酶，而后溶解纤维蛋

白。此实验乙型溶血性链球菌阳性，金黄色葡萄球菌阴性。兔血

浆用于金黄色葡萄球菌的血浆凝固酶试验。细菌生成血浆凝固酶

后释放于血浆中，称为游离凝固酶，不直接作用到血浆纤维蛋白

原上，而是被血浆中的致活剂（即凝固酶致活因子）激活后变成

耐热的凝固酶样物质，此物质纤维蛋白原变为固态纤维蛋白，血

浆因而凝固。致病性葡萄球菌能产生凝固酶，例金黄色葡萄球菌

阳性，表皮葡萄球菌阴性。

问：革兰氏染色有哪些注意事项？

答：（1）最好挑选18-24h的菌落进行革兰氏染色，培养时间过久

的的革兰氏阳性细菌可能会被染成红色而造成假阴性。

（2）挑取适量的菌，不宜过多，均匀涂开。

(3)乙醇脱色是革兰氏染色是否成功的关键，15-30s为宜，脱色

不够可能会造成假阳性，脱色过度可能会造成假阴性。

问：如何根据实验需要制备斜面？

答：根据实验需求，摆放斜面一般有三种形式：

(1)长斜面：斜面底部刚覆盖试管底部，上部距管口2.5-3cm

左右；例如TSA传代斜面。

(2)高层斜面：斜面与底层高度约为2:3,即底部高约3cm,斜

面长度约2cm；如三糖铁高层斜面。

(3)普通斜面：斜面底部距试管底部约1cm,上部距管口约

2.5-3cmo

长斜面

高层斜面

普通斜面

问：三糖铁培养基颜色变化原理是什么？

答：该培养基含有乳糖、蔗糖和葡萄糖的比例为10:10:1,只能

利用葡萄糖的细菌，分解葡萄糖产酸可使斜面先变黄，但因量少，

生成的少量酸接触空气而氧化，加之细菌利用培养基中含氮物质，

生成碱性产物，故使斜面后来又变红，底部由于是在厌氧状态下，

酸类不被氧化，所以仍保持黄色。而发酵乳糖的细菌则产生大量

的酸，使整个培养基呈现黄色。如菌种接至培养基培养后产生黑

色沉淀，是因为某些细菌能分解含硫氨基酸，生成硫化氢，硫化

氢和培养基中的铁盐反应，生成黑色的硫化亚铁沉淀。

问：如果三糖铁上斜面红色、底层黄色，中间有黑色且产气，能

否判定为沙门菌？

答：不能。某些非沙门菌也能在三糖铁上呈现和沙门菌一样的颜

色变化，例如奇异变形杆菌。如三糖铁上有上述颜色变化，需要

进一步的进行适宜的鉴定试验，确证是否为沙门菌。

如果采用传统的生化鉴定，可参考GB4789.4-2016中沙门氏菌检

验的方法。

问：按照中国药典2015版1106控制菌检查法检测大肠埃希氏菌，

如果麦康凯琼脂上有疑似菌，如何用传统方法确证？

答：挑选疑似菌分离、纯化