江门市腹泻患者和淡水产品中香港海鸥形菌的检测和病原学研究

江门市腹泻患者和淡水产品中香港海鸥形菌的检测和病原学研究摘要本研究旨在了解江门市感染性腹泻患者和某些淡水产品中香港海鸥形菌的携带情况，并对阳性分离株进行病原学分析。2009年4-12月采集江门市各级医院门诊腹泻患者肛拭子及涉淡水产品肠容物拭子进行检测。结果在804份腹泻患者肛拭子中，2份香港海鸥形菌检测呈阳性；425份淡水产品标本中，总检出率为5.9%（25/425），其中草鱼阳性率为30.1%（19/63），福寿螺阳性率为1.51%（4/265），蛙类阳性率为28.6%。药敏试验显示人源分离株对部分抗生素存在耐药性。PFGE分型结果表明菌株间存在一定的遗传多样性。本研究提示香港海鸥形菌可能导致人腹泻，且在多种淡水产品中存在，应引起关注。关键词香港海鸥形菌；腹泻患者；淡水产品；病原学一、引言2001年，香港大学微生物学系Yuen等在一名肝硬化病人的胸腔脓液和血液中首次分离出香港海鸥形菌（Laribacterhongkongensis,LH）（菌株号HKU1）。通过生化特性和16SrRNA基因序列等分析，确定其为新发现细菌菌属。2004年6月，香港大学医学院微生物学系Woo等通过多中心病例对照研究提出，香港海鸥形菌可能是导致胃肠炎尤其是较严重胃肠炎的原因之一，且食用淡水鱼与外出旅游是该类腹泻的主要危险因素。随后，在香港市售约四分之一的淡水鱼（如草鱼、大头鳙鱼、鲮鱼和大嘴鲈鱼等）肠道中分离到该菌。目前，我国内地对LH的研究处于起步阶段，主要集中在淡水鱼中该菌污染情况的调查，如广东、广西、浙江和河北等地不断有研究报道在多种淡水鱼中检出该菌。然而，关于人群感染状况的研究近乎空白，仅有浙江省杭州市疾病预防控制中心倪晓平等从该市某医院2428例门诊腹泻病人中分离到13例LH的研究报告，其他人群带菌情况研究未见报道。广东毗邻香港，自然生态和社会生态相似，经贸往来频繁，是香港淡水鱼的主要供应基地，且LH在淡水鱼的检出率高达41.7％。为防止香港海鸥形菌感染类腹泻的发生，该菌已成为广东输往香港淡水鱼的必检致病菌之一。但广东尚未见人群感染的研究报道，该菌对人群健康和安全的潜在危险性尚不清楚，其病原学特征更是空白。因此，本研究以广东省江门市为研究区域，对江门市感染性腹泻患者和某些淡水产品中香港海鸥形菌的携带情况进行调查，并对阳性分离株进行病原学分析。二、材料与方法2.1标本采集2009年4-12月，采集江门地区各级医院门诊腹泻患者肛拭子和涉淡水产品肠容物拭子。用自制调查表登记病人的本底资料、临床表现和流行病学调查资料。2.2细菌培养分离鉴定方法所采集肛拭子立即放入Cary-blair氏运送培养基，48h内送到实验室进行细菌培养鉴定。试验均以LHK1菌株（香港大学微生物学系袁国勇教授惠赠）作为阳性对照菌株。可疑细菌进行革兰染色，过氧化氢酶、氧化酶、脲酶和三糖铁等关键生化试验筛选，符合条件者再采用API鉴定。2.3PCR扩增及序列测定反应体系为50μl，包括10×buffer（内含Mg2+）5μl，2mmol/LdNTPs4μl，5U/μl的TaqDNA聚合酶1μl，引物各1μl，模板DNA2μl，ddH2O36μl；反应条件：预变性94℃5min，后续94℃30s，53℃40s，72℃40s，35个循环，72℃延伸5min。PCR扩增产物送上海Invitrogen公司进行序列测定，序列结果用软件blast（/BLAST/Blast）进行同源性比对。2.4纸片扩散法确定LH人源分离株的抗生素敏感性采用WHO推荐的K—B纸片扩散法测，判定标准按美国CLSI/NCCLSM100-519抗微生物药物敏感性试验执行标准（2009版）肠杆菌科抑制圈直径的解释标准执行。敏感（suseeptible,S）率、中介（intermediate,I）率、耐药（resistant,R）率分别用S％、I％、R%表示。并用大肠杆菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌ATCC25923作质控。2.5建立脉冲场凝胶电泳（PulsedFieldGelEleetrophoresis,PFGE）分型技术对分离株进行PFGE分型采用BioNujmericsv4.0软件中的非加权配对算数平均法（UPGMA）进行聚类分析，分析菌株的亲缘关系。三、结果3.1江门市人群检测结果本研究共采集肛拭子标本804份，2份标本中香港海鸥形菌检测呈阳性。经过生化鉴定和16SrRNA基因序列测定，并与GenBank中登录的香港海鸥型菌（菌株号HKU1）进行序列比对，其同源性均为99％，这是目前广东省社区获得性腹泻患者中首次发现的香港海鸥形菌感染病例。3.1.1菌落及菌体特征CMA培养基37℃培养48h后，菌落呈灰白色、半透明、圆形、略凸起、直径在1.0～1.5mm之间、光滑、不粘连，略显湿润。革兰氏染色镜检为革兰氏阴性、形状呈螺旋杆状或展翅海鸥形状。3.1.2生化特征JM1和JM2的生化检测结果：均为革兰氏阴性菌，氧化酶、过氧化氢酶、脲酶、精氨酸双水解酶、硝酸盐还原酶、甘露醇、葡糖酸盐、癸酸盐等阳性，三糖铁阴性、色氨酸、葡萄糖酸化、七叶灵水解、明胶酶、β-半乳糖苷酶、阿拉伯糖、甘露糖、乙酰氨基葡萄糖、麦芽糖、已二酸、苹果酸盐、柠檬酸盐利用、乙酸苯酯、葡萄糖等阴性。3.1.3药敏结果JM1对头孢噻吩、头孢呋辛、头孢哌酮、头孢唑啉、头孢他啶、克林霉素、甲硝唑等表现出耐药性；对哌拉西林、胺苄西林等表现为中介；而对头孢吡肟、亚胺培南、氨曲南、三甲氧苄氨嘧啶、环丙沙星，庆大霉素以及丁胺卡那霉素、四环素等均为敏感。JM2除对哌拉西林、胺苄西林耐药，对四环素和甲硝唑表现为中介，余同JM1。3.2江门市部分淡水生物检测结果共计检测标本425份，总检出率为5.9％（25/425）。3.2.1草鱼的检测检测市售草鱼63条，香港海鸥型菌的阳性率为30.1％（19/63）。3.2.2福寿螺的检测检测野生福寿螺265只，4只阳性，阳性率为1.51％（4/265），福寿螺中分离出香港海鸥型菌为本研究中首次发现，目前为止国内外文献未见有相关报道。3.2.3蛙类的检测检测分离野生虎纹蛙5只、青蛙2只，其中该菌检测分离各有1只阳性，阳性率为28.6％。3.2.4其他检测小猫鱼15只（捕获于乡间小溪）、河蚌10只、白蚬23只、石螺42只、武昌鱼18条均未检出香港海鸥型菌。3.3LH分离株PFGE方法的建立及条件优化本研究PFGE方法的实验技术条件为：OD值为5.0，细胞裂解时间为8h，酶切条件为SPeI20U酶切6h，电泳脉冲时间为2.16-63.80s，脉冲角度为120°，电场强度为6V/cm，电泳20h。结果可见清晰的酶切条带，图像位于正中，在没有图像分析软件的情况下，肉眼也可进行判断。证实所建方法可行，条件适合。3.4LH分离菌株的PFGE分型结果在使用相同的试剂、仪器和参数的前提下，27株菌经限制性内切酶SpeI酶切后进行PFGE电泳，每株约出现10-14个电泳条带，分子量在30kb-700kb之间。经BionumericsV4.0软件进行聚类分析，相似值在46.6％～100％之间，可分为23个型（相似值为100％视为同一PFGE型别）。其中鱼源株Y16与Y25，Y28与Y29，Y35与Y39和蛙源株W2与W8的相似度分别为100％。四、讨论本研究在江门市腹泻病人中分离到香港海鸥形菌，尽管分离率不高（2/804），但提示该菌可能导致人腹泻。在多种淡水产品中也分离到香港海鸥形菌，其中草鱼和蛙类的检出率相对较高，分别为30.1％和28.6％。值得注意的是，本研究首次在福寿螺中分离出该菌，丰富了香港海鸥形菌的宿主范围。人源分离株的药敏结果显示，JM1和JM2对多种常用抗生素表现出耐药性或中介性，这对临床治疗该菌感染带来了挑战。PFGE分型结果表明，不同来源的菌株具有一定的遗传多样性，部分菌株之间存在较高的相似度，提示可能存在特定的传播途径或克隆。本研究为了解香港海鸥形菌在江门市的分布及病原学特征提供了重要数据。后续应进一步扩大研究范