重组DNA技术的基本工具高二下生物人教版选择性必修3

基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做重组DNA技术。1944年，艾弗里（O.Avery，1877-1955)等人通过肺炎双球菌的转化实验，不仅证明了遗传物质是DNA，还证明了DNA可以在同种生物的不同个体之间转移。1958年，梅塞尔森（M.Meselson，1930-）和斯塔尔（F.W.Stahl,1929-）用实验证明了DNA的半保留复制。随后不久，克里克提出中心法则。1961年，尼伦伯格（M.W.Nirenberg，1927-2010）和马太（J.H.Matthaei，1929-）破译了第一个编码氨基酸的密码子，截止1966年64个密码子均被破译。1970年，科学家在细菌中发现了第一个限1972年，伯格（P.Berg，1926-）首先在体外进行了DNA改造的研究，成功构建了第一个体外重组DNA分子。1973年，科学家证明质粒可以作为基因工程的载体，构建重组DNA，导入受体细胞，使外源基因在原核细胞中成功表达，实现物种间的基因交流，基因工程正式问世。1950年，埃德曼（P.V.Edman，1916-1977）发明了一种测定氨基酸序列的方法。2年后，桑格（F.Sanger，1918-2013）首次完成了胰岛素氨基酸序列的测定。1953年，沃森（J.D.Watson，1928-）和克里克（F.Crick，1916-2004）建立了双螺旋结构模型并提出了1967年，科学家发现，在细菌拟核DNA之外的质粒具有自我复制能力，并可在细菌细胞间转移。20世纪70年代初，多种限制酶、DNA连接酶和逆转录酶被相继发现。这些发现为DNA的切割、连接及功能基因的获得创造了条件。遗传物质自我复制的假说。制性内切核酸酶（简称限制酶）。1982年，第一个基因工程药物——重组人胰岛素被批准上市。基因工程药物成为世界各国研究和投资开发的热点。1983年，科学家采用农杆菌转化法培育出世界上第一例转基因烟草。此后，基因工程进入了迅速发展的阶段。1984年，我国科学家朱作言（1941-）领导的团队培育出世界上第一条转基因鱼。1985年，穆里斯（K.Mullis，1944-）等人发明了PCR，为获取目的基因提供了有效手段。1977年，桑格等科学家发明了DNA序列分析的方法，为基因序列图的绘制提供了可能。1990年，人类基因组计划启动。2003年该计划的测序任务顺利完成。21世纪以来，科学家发明了多种高通量测序技术，可以实现低成本测定大量核酸序列，加速了人们对基因组序列的了解。2013年，华人科学家张锋（1982-）及其团队首次报道了利用最新的基因编辑技术——CRISPR（成簇规律间隔短回文重复）技术编辑了哺乳动物基因组。该技术可以实现对特定基因的定点插入、敲除或替换。第3章

基因工程

第1节

重组DNA技术的基本工具回顾对DNA的认识OPCH2

OHOOHHOHHHHH碱基

磷酸

1.DNA的基本单位：脱氧核苷酸3.核苷酸的组成2.元素组成：一分子磷酸一分子脱氧核糖一分子含氮碱基C、H、O、N、PA腺嘌呤G鸟嘌呤C胞嘧啶T胸腺嘧啶4.含氮碱基OPCH2

OHOOHHOHHHHHA磷酸

OPCH2

OHOOHHOHHHHHC磷酸

OPCH2

OHOOHHOHHHHHT磷酸

OPCH2

OHOOHHOHHHHHG磷酸

腺嘌呤脱氧核苷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸胞嘧啶脱氧核苷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸回顾对DNA的认识回答有关DNA结构方面的问题。（1）DNA是由几条链构成的？它具有怎样的立体结构？（2）DNA的基本骨架是由哪些物质组成的？它们分别位于DNA的什么部位呢？（3）DNA中的碱基是如何配对的？它们位于DNA的什么部位？DNA是由两条链构成的。这两条链按反向平行方式盘旋成双螺旋结构。DNA的基本骨架包括脱氧核糖和磷酸，它们排列在DNA的外侧。DNA中的碱基通过氢键连接成碱基对，它们位于DNA的内侧。碱基配对有一定的规律：A与T配对；G与C配对。回顾对DNA的认识氢键ATATTAGGGCCATC碱基对五种元素：C、H、O、N、P四种碱基：A、T、C、G三种物质：两条长链：一种螺旋：规则的双螺旋结构磷酸、脱氧核糖、含氮碱基两条反向平行的脱氧核苷酸链氢键关系:A=TG≡C番木瓜容易受环斑病毒的侵袭。当番木瓜被这种病毒侵染后，产量会大大下降。科学家通过精心设计，用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。DNA双螺旋的直径只有2nm，对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。那么，科学家究竟用到了哪些“分子工具”？这些“分子工具”各具有什么特征呢？从社会中来重组DNA技术的基本工具分子手术刀能准确切割DNA分子分子缝合针能将DNA片段再连接起来分子运输车能将体外重组好的DNA分子导入受体细胞一

限制性内切核酸酶——分子手术刀限制性内切核酸酶细菌细菌细菌限制性内切核酸酶

限制酶就是细菌的一种防御性工具。当外源DNA入侵时，它会利用限制酶来切割外源DNA，使之失效，以保证自身的安全。一

限制性内切核酸酶——分子手术刀TGCGTACGCA5′5′磷酸二酯键来源种类作用特点主要从原核生物中分离纯化出来数千种限制酶不是一种酶，而是一类酶专一性能识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成DNA分子经限制酶切割产生的DNA片段通常有两种形式：黏性末端和平末端限制性内切核酸酶（5′）黏性末端平末端5′3′5′3′SamⅠ5′3′5′3′中心轴线EcoRⅠ5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′专一识别GAATTC的序列，并使G和A之间切开。只能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切开。资料卡——限制酶的命名EcoRⅠ属名Escherichia首字母种名coli前两个字母R型菌株从中分离的第一个限制酶合作探究如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？CGGCCGTATAATATGCGCGCTAATCGTATAATATGCTATAEcoRIEcoRIEcoRICGGCCGTTAAAATTGCGCGCTAATCGTTAAAATTGCTATACGGCCGTTAAAATTGCTATA会产生相同的黏性末端，可以进行碱基互补配对。下图甲是一个DNA片段，箭头处代表不同限制酶的切点，据图回答：（1）用EcoRⅠ酶切，能得到

种DNA片段；（2）用PstⅠ完全酶切，能得到

种DNA片段；（3）同时用SmaⅠ和PstⅠ完全酶切，能得到

种DNA片段；（4）只用PstⅠ酶切，最多能得到

种DNA片段。2355DNA连接酶能够将DNA片段连接起来基因工程常用的DNA连接酶有两种：Ecoli

DNA连接酶：连接互补的黏性末端，连接平末端的效率远远低于T4DNA连接酶的连接效果；T4DNA连接酶：连接互补的黏性末端和平末端。二DNA连接酶——分子缝合针3′3′5′5′3′3′5′5′T4DNA连接酶T4DNA连接酶E.coliDNA连接酶5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′磷酸二酯键作用部位:

二DNA连接酶——分子缝合针思考：DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？为什么？相同点：都是催化磷酸二酯键形成的酶不同点：DNA聚合酶连接的是游离的脱氧核苷酸，需要模板；DNA连接酶连接的是DNA片段。归纳总结——几种相关酶的比较名称作用部位作用结果限制酶磷酸二酯键将DNA切成两个片段DNA连接酶磷酸二酯键将两个DNA片段连接为一个DNA分子DNA聚合酶磷酸二酯键将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端DNA(水解)酶磷酸二酯键将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸解旋酶碱基对之间的氢键将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链基因工程通常利用质粒作为载体将基因送入细胞。质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。种类：通常是用质粒，噬菌体、动植物病毒也可以。三

基因进入受体细胞的载体——分子运输车拟核质粒大肠杆菌氨苄青霉素抗性基因目的基因复制起点作用:将目的基因转入受体细胞并在受体细胞内对目的基因进行大量复制三

基因进入受体细胞的载体——分子运输车便于插入（携带）目的基因☆真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。运载体需具备的条件①能在受体细胞中稳定保存并复制②有一个至多个限制酶切割位点③具有标记基因，便于筛查含有重组DNA分子的细胞④对受体细胞无害、易分离载体上标记基因的标记原理普通培养基不含抗生素选择培养基50µg/ml四环素载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了载体的受体细胞。思考‧讨论——重组DNA分子请你在上述序列中找到EcoRⅠ的识别序列和切割位点。然后，用剪刀进行“切割”。待切割位点全部切开后，将从下面那条DNA链上切下的片段重组到上面那条DNA链的切口处，并用透明胶带将切口粘起来。

讨论：1．剪刀和透明胶带分别代表哪种“分子工具”？2．你制作的黏性末端的碱基能不能互补配对？如果不能，可能是什么原因造成的？

切割目的基因时：能切下目的基因且不破坏目的基因切割质粒时：至少保留一个完整的标记基因，便于筛选3．你插入的DNA片段能称得上一个基因吗？5′-ATTGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC-3′3′-TATCGTACGATAGGTACTTAAGCCGTATG-5′5′-TCCTAGAATTCTCGGTATGAATTCCATAC-3′3′-AGGATCTTAAGAGCCATACTTAAGGTATG-5′图为某种质粒简图,图2表示某外源DNA上的目的基因,小箭头所指分别为限制性内切核酸酶EcoRⅠ、BamHⅠ、HindⅢ的酶切位点。下列有关叙述错误的是()A.在基因工程中若只用一种限制酶完成对质粒和外源DNA的切割,则可选EcoRⅠB.如果将一个外源DNA分子和一个质粒分别用EcoRⅠ酶切后,再用DNA连接酶连接,

形成一个含有目的基因的重组DNA,此重组DNA中EcoRⅠ酶切割位点有1个C.为了防止质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化,酶切时可使用BamHⅠ和

HindⅢ两种限制酶同时处理质粒和目的基因D.一个图1所示的质粒分子经EcoRⅠ切割后,含有2个游离的磷酸基团答案B(多选)某线性DNA分子含有5000个碱基对(bp),先用限制酶a切割,再把得到的产物用限制酶b切割,得到的DNA片段大小如下表。两种限制酶的识别序列和切割位点如下图所示。下列有关说法不正确的是()A.在该DNA分子中,酶a与酶b的识别序列分别有3个和2个B.酶a与酶b切出的黏性末端不能相互连接C.酶a与酶b切断的化学键不相同D.用这两种酶和DNA连接酶对该DNA分子进行反复切割、连接操作,若干循环后,序

列会明显增多答案BC酶a切割产物(bp)之后酶b切割产物(bp)2100;1400;1000;5001900;200;800;600;1000;500探究·实践DNA的

粗

提

取

与

鉴

定RoughextractionandidentificationofDNADNA的粗提取与鉴定RoughextractionandidentificationofDNA一、实验原理00.14NaCI浓度（mol/L）DNA溶解度1.DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同观察左图，尝试描述DNA在NaCl溶液中的溶解度曲线。

利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。如何通过控制NaCl溶液的浓度使DNA在盐溶液中溶解或析出？

用高浓度的盐溶液（2mol/L的NaCl溶液）溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；

用低浓度的盐溶液（0.14mol/L的NaCl溶液）使DNA析出，能除去溶解在低盐中的杂质。取过滤液取过滤物DNA的粗提取与鉴定RoughextractionandidentificationofDNA2.DNA在酒精溶液中的溶解性DNA不溶于酒精，但是某些蛋白质能溶于酒精。3.DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性酶——蛋白酶高温——大多数蛋白质不能忍受60-80℃的高温，但DNA在

80℃以上才会变性洗涤剂——能瓦解细胞膜，但对DNA没有影响4.DNA的鉴定DNA+二苯胺

蓝色物质沸水浴二、实验设计（一）实验材料的选取那么应该选择什么样的材料呢？思考：上述材料中哪些不能进行选择？为什么？凡是含有DNA的生物材料都可，但是选用富含DNA的材料成功率会更高。材料用具：

新鲜洋葱、研磨液、体积分数为95%的酒精、2mol/L的NaCl溶液、二苯胺试剂和蒸馏水等DNA的粗提取与鉴定RoughextractionandidentificationofDNA（二）实验步骤1.破碎细胞，获取DNA的滤液

称取约30g洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10mL研磨液，充分研磨。研磨注意事项：研磨时间不宜太长，防止研磨时产生的热量影响DNA的提取量；有条件的可以在材料处理的过程中加入纤维素酶、果胶酶，研磨效果好（有利于充分研磨）；研磨不宜太用