2026届新高考生物考前热点复习：基因工程及生物技术的安全性与伦理问题

2026届新高考生物考前热点复习基因工程及生物技术的安全性与伦理问题(一)基因工程的概念分析基础全面落实目的基因基因重组受体分子指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。别称：重组DNA技术Q1.为什么不同生物的DNA分子能拼接起来？Q2.为什么一种生物的基因可以在另一种生物细胞内表达？思考•讨论基因工程的理论基础①DNA分子的基本组成单位相同，都是4种脱氧核苷酸；②空间结构相同，都是规则的双螺旋结构。③都遵循碱基互补配对原则。DNA平面结构DNA立体结构①基因是控制生物性状的独立遗传单位。②遗传信息的传递都遵循中心法则。③生物界共用一套遗传密码。重组DNARNA蛋白质性状复制转录翻译主题研习（一）重组DNA技术的基本工具(二)基因工程的基本工具1.限制性内切核酸酶（限制酶）——“分子手术刀”来源作用识别双链DNA分子的特定________________,并使每一条链中特定部位的______________断开特征一种限制酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列,并且能在特定的位点上切割DNA分子结果产生___________和平末端核苷酸序列磷酸二酯键黏性末端（限制酶不是一种酶，而是一类酶）主要是从原核生物中分离纯化出来酶的专一性推测限制酶存在于原核生物中的作用是什么？为什么限制性内切核酸酶不剪切细菌本身的DNA？防止外源DNA入侵，保护自身遗传物质稳定。①原核细胞内DNA分子不具备限制酶的识别序列，②甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。中轴线①大多数限制酶的识别序列由

组成，也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。6个核苷酸②都可以找到一条中心轴线；③中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称、重复排列的，称为回文序列。限制酶识别的特定序列有何特点？EcoRⅠ5’…G-A-A-T-T-C…3’3’…C-T-T-A-A-G…5’SmaⅠ5’…C-C-C-G-G-G…3’3’…G-G-G-C-C-C…5’BamHⅠ5’…G-G-A-T-C-C…3’3’…C-C-T-A-G-G…5’TaqⅠ5’……T-C-G-A……3’3’……A-G-C-T……5’考点一：重组DNA技术的基本工具一轮复习，夯实基础！（一）限制性内切核酸酶——“分子手术刀”BamHⅠ

HindⅢ-G-CCTAGorGATCC-G--A-TTCGAorAGCTT-A-Q2.不同限制酶切割产生的黏性末端是否一定不同？Q1.写出下列限制酶切割形成的末端序列思考•讨论不同的限制酶可能会形成相同的黏性末端。（如BamHⅠ和BglⅡ）同尾酶：识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶。当准备连接的连个DNA分子中没有相同的限制酶识别序列时，可以用同尾酶切割后进行连接。考点一：重组DNA技术的基本工具一轮复习，夯实基础！（一）限制性内切核酸酶——“分子手术刀”2.DNA连接酶——“分子缝合针”种类E.coliDNA连接酶T4DNA连接酶来源__________T4噬菌体特点T4DNA连接酶连接平末端的效率远高于E.coliDNA连接酶作用恢复被限制酶切开的______________,连接两个DNA片段大肠杆菌磷酸二酯键比较DNA有关的几种酶项目DNA连接酶限制酶DNA聚合酶解旋酶DNA（水解）酶作用部位磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键氢键磷酸二酯键作用对象DNA片段DNA单个脱氧核苷酸DNADNA作用结果将两个DNA片段连接成完整的DNA分子切割双链DNA分子将单个脱氧核苷酸连接到DNA单链末端将双链DNA分子局部解旋为单链将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸考点一：重组DNA技术的基本工具一轮复习，夯实基础！3.基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”类型常用:_________;其他:噬菌体、动植物病毒等条件①能自我复制或整合到受体DNA上,使目的基因稳定存在且数量可扩增;②具有一个至多个__________________,供外源DNA片段(基因)插入;③具有特殊的标记基因,便于重组DNA分子的筛选④无毒害作用作用携带外源DNA片段(基因)进入受体细胞质粒限制酶切割位点质粒：裸露、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA外，具有自我复制能力的环状双链DNA。注意：真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。(三)DNA的粗提取与鉴定1.实验原理(1)DNA不溶于酒精,某些蛋白质溶于酒精。(2)DNA在不同浓度的_________中溶解度不同,它能溶于________的NaCl溶液。(3)在一定温度下,DNA遇________试剂会呈现蓝色。NaCl溶液2mol/L二苯胺（现配现用）2.实验步骤Q1.用猪血作实验材料可行吗？Q2.酒精预冷的作用？Q3.为什么搅拌时应轻缓、并沿一个方向目的？思考•讨论以免加剧DNA的断裂,导致DNA不能形成丝状物①可抑制核酸水解酶的活性，防止DNA降解；②抑制分子运动，使DNA易形成沉淀析出；③低温可以降低DNA的溶解度，使其更容易从溶液中沉淀出来，提高DNA的提取效率。④低温有利于增加DNA分子的柔韧性，减少断裂。不可行，哺乳动物的成熟红细胞）无细胞核和线粒体，几乎不含DNA，不适合题点(一)基因工程的操作工具1.(苏教版选择性必修3P88“知识链接”素材挖掘)下表为常用的限制酶及其识别序列和切割位点。下列说法错误的是(

)题点考法训练限制酶名称识别序列和切割位点限制酶名称识别序列和切割位点注:Y=C或T,R=A或GBglⅡA↓GATCTKpnⅠGGTAC↓CEcoRⅠG↓AATTCSau3AⅠ↓GATCHindⅠGTY↓RACSmaⅠCCC↓GGGA.限制酶的作用底物都是双链DNA,都能切开磷酸二酯键B.BglⅡ和Sau3AⅠ两种限制酶切割后可形成相同的黏性末端C.切割质粒的限制性内切核酸酶均能特异性地识别6个核苷酸序列D.一种限制酶可能识别多种核苷酸序列√2.(2023·新课标卷)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具,将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接,以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是(

)A.质粒和目的基因都用酶3切割,用E.coliDNA连接酶连接B.质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割,用T4DNA连接酶连接C.质粒和目的基因都用酶1和酶2切割,用T4DNA连接酶连接D.质粒和目的基因都用酶2和酶4切割,用E.coliDNA连接酶连接√题点(二)

DNA的粗提取与鉴定3.(2024·山东高考)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验,下列说法正确的是(

)A.整个提取过程中可以不使用离心机B.研磨液在4℃冰箱中放置几分钟后,应充分摇匀再倒入烧杯中C.鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变D.仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰√4.(2024·安徽高考)下列关于“DNA粗提取与鉴定”实验的叙述,错误的是(

)A.实验中如果将研磨液更换为蒸馏水,DNA提取的效率会降低B.利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异,可初步分离DNAC.DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同,该原理可用于纯化DNA粗提物D.将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应,可检测溶液中是否含有蛋白质杂质√主题研习（二）基因工程的基本操作程序与应用与载体拼接植物组织培养棉花植株

Bt蛋白提取苏云金杆菌抗虫基因（Bt蛋白基因）导入棉花细胞(含抗虫基因)目的基因的筛选与获取基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定（核心）(有抗虫特性)基础全面落实

(一)基因工程的基本操作程序1.目的基因的筛选与获取(1)筛选合适的目的基因目的基因在基因工程的设计和操作中,用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。主是_______________的基因筛选方法从相关的已知_______________清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一编码蛋白质结构和功能重难深化拓展重难点(一)基因工程的操作步骤(2)目的基因的获取方法①人工合成目的基因a.逆转录法主要用于相对分子质量较大而又不知其核苷酸序列的基因。它以目的基因的mRNA为模板,借助逆转录酶合成双链DNA,其过程如下:b.化学合成法依据某一蛋白质的氨基酸序列,推测出其基因序列,然后直接合成目的基因,其过程如下:②从基因文库中获取目的基因根据目的基因的有关信息,例如,根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA,以及基因的表达产物蛋白质等特性来从基因文库中获取目的基因。考点三：基因工程的基本操作程序一轮复习，夯实基础！③利用PCR获取和扩增目的基因（常用）体内DNA复制参与的组分在DNA复制中的作用PCR中参与的组分打开DNA双链提供DNA复制的模板合成子链的原料催化合成DNA子链维持pH稳定激活DNA聚合酶解旋酶DNA母链4种脱氧核苷酸DNA聚合酶缓冲物质Mg2+条件：无需解旋酶，高温解链DNA母链4种脱氧核苷酸（实为dNTP）耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）缓冲液Mg2+引物（短的单链RNA）引物（2种，短的单链DNA）使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸dNTP(dATP、dGTP、dTTP、dCTP),既可作为合成DNA子链的原料,又可为DNA的合成提供能量。真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活聚合酶链式反应引物(一对，短单链核酸)高频考点归纳：1.作用：使耐高温DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸2.延伸时需要加入两种引物，原因是DNA是反向平行的双链，DNA聚合酶只能从引物3′端延伸DNA链，用两种引物才能确保DNA两条链同时被扩增4.PCR扩增前提：需知目的基因两端的碱基序列来设计引物5.引物能与模板链的3’端进行碱基互补配对3’5’3’5’引物15’3’3.PCR扩增的是完整的模板DNA分子吗？一般不是；扩增的是两种引物之间所对应的特定DNA片段；引物23’5’一般原则①引物长度一般以20~30个核苷酸为宜,过短会降低特异性,过长会引起复性时结合的模板数减少,降低反应效率。②要避免两个引物间碱基序列互补以及同一引物自身碱基序列互补。③引物5’端可添加与模板无关的序列(如限制酶的识别序列、启动子序列等),便于克隆和表达。④引物的碱基顺序不能与非扩增区有同源性。引物与核酸序列数据库的其他序列均应无明显同源性,以免造成不必要的非特异性扩增续表(3)利用PCR获取和扩增目的基因引物脱氧核苷酸耐高温温度两种引物耐高温的DNA聚合酶琼脂糖凝胶电泳总结：PCR循环了n次，则①得到DNA片段数有______个；②DNA总链数_______条；③不含引物的链数______条；④需要引物的总数__________个；⑤第____次循环能得到两条链等长的DNA片段目的基因片段；2n2n+122n+1-233.PCR扩增过程中的循环图示与规律⑥第n次循环得到目的基因片段_________个2n-2n用PCR可以扩增mRNA吗?不能RT-PCR(逆转录—聚合酶链反应)2.基因表达载体的构建(1)构建基因表达载体的目的①使目的基因在______________中稳定存在,并且遗传给下一代。②使目的基因能够________和发挥作用。受体细胞表达(2)基因表达载体的组成RNA聚合酶转录相关信息——启动子的类型诱导型启动子有时为了满足需要，在载体中人工构建诱导型启动子，当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达。诱导型启动子诱导物作用激活或抑制目的基因表达如：光诱导、热诱导、创伤诱导、真菌诱导、共生细菌诱导表达基因启动子等。②组成型启动子这类启动子一般来自管家基因，可连续不断地启动基因的表达。③组织特异性启动子其调控作用使基因往往只在某些特定器官或组织中表达，且表现出发育调节的特性。考点三：基因工程的基本操作程序一轮复习，夯实基础！第二步：基因表达载体的构建（核心工作）[微点拨]启动子、起始密码子、终止子、终止密码子的区别

位置作用启动子位于DNA分子上RNA聚合酶识别和结合位点,启动转录过程终止子位于DNA分子上决定转录的结束起始密码子位于mRNA分子上决定翻译的开始终止密码子位于mRNA分子上决定翻译的结束3、基因表达载体的构建过程：标记基因启动子限制酶切割位点终止子复制原点限制酶质粒限制酶目的基因限制酶切割位点限制酶切割位点DNA连接酶重组DNA分子载体（质粒）DNA分子（含目的基因）带有黏性末端或平末端的切口有相同黏性末端或平末端的目的基因片段DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）用同种限制酶（或能产生相同末端的限制酶）切割考点三：基因工程的基本操作程序一轮复习，夯实基础！第二步：基因表达载体的构建（核心工作）重难点(二)限制酶的选择方法分析1.根据限制酶切割位点的位置确定限制酶的种类(1)应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶。(2)不能选择切割位点位于目的基因和标记基因内部的限制酶(3)为避免目的基因和质粒的自身环化及随意连接,也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒,如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶,但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点或确保质粒切割后产生的末端能与这两种酶切割后产生的末端连接。根据质粒的特点确定限制酶的种类重难点(二)限制酶的选择方法分析3.根据Ti质粒的T-DNA片段选择限制酶图中甲、乙、丁Ti质粒均不宜选取,而丙Ti质粒宜选取(切割目的基因的限制酶为XbaⅠ和SacⅠ)[例2]

若要利用某目的基因(见图甲)和P1噬菌体载体(见图乙)构建重组DNA(见图丙),限制酶的酶切位点分别是Bgl

Ⅱ(—A↓GATCT—)、EcoRⅠ(—G↓AATTC—)和Sau3AⅠ(—↓GATC—)。下列方法最合适的是(

)A.用EcoRⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体B.用BglⅡ和EcoRⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体C.用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体D.用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体√3.将目的基因导入受体细胞类型植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法___________法、花粉管通道法_________技术Ca2+处理法受体细胞受精卵、体细胞__________原核细胞农杆菌转化显微注射受精卵[归纳拓展]农杆菌转化法的几个关键点①农杆菌特点:能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物,而对大多数单子叶植物没有侵染能力;其细胞内含有Ti质粒,当它侵染植物细胞后,能将Ti质粒上的T-DNA转移到被侵染的细胞中,并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。②农杆菌转化法中的两次拼接与两次导入:第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上,第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上。第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌,第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA导入受体细胞。③导入的目的基因,可能存在于细胞质中,也可能整合到染色体DNA上。存在于染色体DNA上的目的基因有可能通过花粉传播进入杂草或其他作物中,造成“基因污染”。4.目的基因的检测与鉴定抗原—抗体杂交抗性接种实验1、分子水平的检测（1）检测目的基因是否导入——

通过PCR等技术检测如：检测棉花的染色体DNA上是否插入了Bt基因是否扩增出目的基因PCR（利用Bt基因的核苷酸序列设计引物）提取DNA转基因棉花琼脂糖凝胶电泳考点三：基因工程的基本操作程序一轮复习，夯实基础！第四步：目的基因的检测与鉴定1、分子水平的检测（2）检测目的基因是否转录——

通过PCR等技术检测如：检测Bt基因是否转录出mRNAPCR（利用Bt基因的核苷酸序列设计引物）提取mRNA转基因棉花逆转录cDNA琼脂糖凝胶电泳BtM3C0T-9T-2T-51T-5T-23T-11T-20T-21T-34T-1010个PCR阳性棉花植株中，有四株

Bt基因发生转录考点三：基因工程的基本操作程序一轮复习，夯实基础！第四步：目的基因的检测与鉴定拓展延伸——还可利用

核酸杂交技术

来检测目的基因是否导入或者是否转录基因探针：一段带有检测标记（荧光或放射性同位素标记）且顺序已知的与目的基因能互补的核酸序列（DNA或RNA）。检测方法：将待测DNA或RNA与基因探针混合，如果发生了核酸杂交，则说明有目的基因。检测原理：碱基互补配对原则考点三：基因工程的基本操作程序一轮复习，夯实基础！第四步：目的基因的检测与鉴定拓展延伸——还可利用

核酸杂交技术

来检测目的基因是否导入或者是否转录（1）检测受体细胞的染色体DNA上是否导入目的基因——DNA分子杂交15N变性变性杂交DNA分子标记的基因探针（PCR扩增）提取转基因生物的DNA（2）检测目的基因是否转录出了mRNA15N变性变性杂交核酸分子标记的基因探针（PCR扩增）提取转基因生物的mRNA——RNA分子杂交考点三：基因工程的基本操作程序一轮复习，夯实基础！第四步：目的基因的检测与鉴定考点三：基因工程的基本操作程序一轮复习，夯实基础！第四步：目的基因的检测与鉴定1、分子水平的检测（3）检测目的基因是否翻译（抗原-抗体杂交）抗原-抗体特异性结合转基因生物鉴定方法成功标志抗虫植物抗病毒（菌）植物耐盐植物抗除草剂植物获取目的基因产物的转基因生物饲喂害虫（抗虫接种实验）害虫死亡病原体感染（抗病接种实验）未出现病斑盐水浇灌正常生长喷洒除草剂正常生长提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较功能、活性正常2、个体水平的检测——检测目的基因是否表现出相应的性状进行抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。考点三：基因工程的基本操作程序一轮复习，夯实基础！第四步：目的基因的检测与鉴定

(一)DNA片段的扩增及电泳鉴定1.实验基础基础全面落实PCR原理利用了_______________原理,通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合电泳DNA分子具有可解离的基团,在一定的pH下,这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下,这些带电分子会向着与它所带电荷_____的电极移动,这个过程就是电泳产物鉴定PCR的产物一般通过_______________来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的___________等有关。凝胶中的DNA分子通过染色,可以在波长为______nm的紫外灯下被检测出来DNA的热变性相反琼脂糖凝胶电泳大小和构象300核酸染料一般使用电泳缓冲液PH=8，DNA分子带负电荷，在电场中DNA会向正极移动2.PCR实验操作步骤和电泳鉴定微量移液器离心管底部凝胶边缘①指示电泳进程，便于判断电泳何时结束（不能指示DNA分子的具体位置）②增加样品密度，是样品沉入加样孔3.DNA片段的扩增及电泳鉴定注意事项(1)为避免外源DNA等因素的污染,PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行灭菌处理。(2)在向微量离心管中添加反应组分时,每吸取一种试剂后,移液器上的枪头都必须更换,避免试剂的污染。(3)观察DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的效果。4.DNA片段琼脂糖凝胶电泳图谱分析(1)线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子大小成__________,分子越大则所受阻力越大,也越难在凝胶孔隙中移动,因而迁移得越慢,随着时间的推移,不同大小的DNA分子就会在凝胶中呈现出一个一个的条带。反比(2)将待测样品电泳条带与Marker(已知长度的DNA片段)进行对比,即可知道待测样品中DNA片段的长度,其中条带的宽度反映了___________________。如下图所示:几个待测样品中DNA片段长度基本一致,约为750bp,其中F2样品中DNA含量最少。DNA含量的多少1第一代基因测序技术——双脱氧链终止法（桑格测序法）（1）ddNTP(双脱氧三磷酸核苷酸)ddNTP缺少3’-OH，不能与另外的dNTP连接形成磷酸二酯键，因此，双脱氧核苷酸可使DNA子链延伸终止。（即ddNTP的碱基可代替dNTP与模板链上的碱基互补配对，但该位点之后不能延伸子链）1第一代基因测序技术——双脱氧链终止法（桑格测序法）(2)双脱氧法原理示意图：分4组PCR，都含有4种dNTP，每组一种ddNTP，即每组4+1原料得到特定碱基为末端的片段电泳分析，或电泳后检测荧光图谱2.(2024·湖南，15)最早的双脱氧测序法是在PCR反应体系中，分别再加入一种少量的双脱氧核苷三磷酸(ddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP)，子链延伸时，双脱氧核苷三磷酸也遵循碱基互补配对原则，以加入ddATP的体系为例：若配对的为ddATP，延伸终止；若配对的为脱氧腺苷三磷酸(dATP)，继续延伸；PCR产物变性后电泳检测。通过该方法测序某疾病患者及对照个体的一段序列，结果如图所示。下列叙述正确的是()A．上述PCR反应体系中需要加入两种引物B．电泳时产物的片段越小，迁移速率越慢C．5′-CTACCCGTGAT-3′为对照个体的一段序列D．患者该段序列中某位点的碱基C突变为GC大本P332PCR及PCR定点诱变技术1反向PCR——扩增已知序列两侧的序列问题：当DNA的某些序列已知，而需要扩增已知序列两端的未知序列时，如何解决？3.最后得到的DNA和原来的环状DNA等长吗？如果不等长，有什么差异？反向PCR得到的为线性DNA片段产物为未知序列+引物1.为什么用相同的限制酶对未知序列进行切割？使未知序列的两端产生相同的粘性末端，进而连接成为环状DNA分子2.如何设计引物来扩增未知序列？设计一对相反方向的特异性引物，该引物对已知序列反向，但对未知序列却是相向的，从而得以扩增出未知序列。2反向PCR——扩增已知序列两侧的序列（2020·江苏卷）如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如下图所示(以EcoRⅠ酶切为例)。若下表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是_______引物①5′-AACTATGCGCTCATGA-3′②5′-GCAATGCGTAGCCTCT-3′③5′-AGAGGCTACGCATTGC-3′④5′-TCATGAGCGCATAGTT-3′④②5′3′3′5′8.(2025·景德镇模拟)反向PCR是一种通过已知序列设计引物对未知序列进行扩增的技术,其过程如下图所示。下列叙述错误的是()A.应选择引物1和引物4进行PCR扩增B.设计的引物中GC碱基含量越高,复性的温度越高C.PCR产物是包含所有已知序列和未知序列的环状DNA分子D.整个过程需用到限制酶、DNA连接酶、耐高温DNA聚合酶√引物A引物B引物C引物DPCR1PCR2PCR3PCR4图2所示的4次PCR应该分别如何选择图1中所示的引物？请填写以下表格（若选用该引物划“√”，不选划“×”）√√××××√√××××√××√PCR及PCR定点诱变技术2重叠延伸PCR——获得定点突变基因无法延伸可延伸重叠PCR是采用具有

的引物,使PCR产物形成了

，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的

，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来的技术，主要应用于基因的

与

。互补末端重叠链定点突变基因拼接延伸问题：如何利用PCR技术实现基因内部的定点突变？PCR1PCR2链Ａ链ＢPCR3基因Ａ基因ＢＡ－Ｂ融合基因互补PCR43’--5’-3’5’-P15’-P2-5’P35’-P4-5’PCR1和PCR2分开进行链A和链B部分互补配对PCR3不需要引物PCR4(用P1和P4扩增融合基因)PCR及PCR定点诱变技术2重叠延伸PCR——获得融合变基因问题：如何利用PCR技术将两个来源不同的DNA连接起来？高温变性5’--3’-5’3’-[例3]

(2025·成都模拟)某科研小组采用PCR技术构建了红色荧光蛋白基因(dsred2)和α-淀粉酶基因(amy)的dsred2-amy融合基因,其过程如图所示,其中引物②和引物③中部分序列(黑色区域)可互补配对。下列说法错误的是(

)A.利用PCR技术扩增基因时不需要解旋酶来打开DNA双链B.不能在同一反应体系中进行dsred2基因和amy基因的扩增C.dsred2基因和amy基因混合后只能得到一种类型的杂交链D.杂交链延伸得到dsred2-amy融合基因的过程不需要加引物√PCR及PCR定点诱变技术3大引物PCR——获得定点突变基因大引物PCR需要用到三条引物进行两轮PCR，这三条引物分别是突变上游引物、常规上游引物和常规下游引物。第一轮PCR利用突变上游引物和常规下游引物进行扩增，得到不完整的含有突变位点的DNA片段；第二轮PCR利用第一轮扩增产物中的一条DNA链作为下游大引物，它与常规上游引物一起扩增得到完整的含有突变位点的DNA片段。问题：如何只用一条突变引物就能引入突变？大引物[例4]

(2024·大连二模)通过引物设计,运用PCR技术可以实现目的基因的定点诱变,如图为基因工程中获取突变基因的过程,其中引物1序列中含有一个碱基T不能与目的基因片段配对,但不影响引物与模板链的整体配对,反应体系中引物1和引物2分别设计增加限制酶a和限制酶b的识别位点。下列有关叙述正确的是(

)A.限制酶a和限制酶b的识别位点分别加在引物1和引物2的3'端B.PCR反应体系中需要加入脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶、Ca2+等C.第2轮PCR中,引物1与图中②结合并形成两条链等长的突变基因D.在第3轮PCR结束后,含突变碱基对且两条链等长的DNA占1/4√启动子位置及转录模板链的判断基于图1中的信息能否判断启动子位置及转录模板链？答案是否定的，若要对转录情况做出准确判断，必须明确以下三个要素：(1)链方向。(2)链性质(编码链或模板链)。(3)功能区域(启动子或终止子)。确定其中2个要素即可确定第3个要素。链链例2.(2023·山东，25节选)已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的________(填“a链”或“b链”)相应部分的序列相同。a链根据启动子方向判断转录方向5′3′3′5′5′3′与b链互补3.脱水素是青稞植株中的一种抗冻物质,脱水素基因Dhn4的结构如图1所示,其中B链为模板链。研究人员利用图2所示的质粒,通过农杆菌转化法将该基因导入草莓中,成功培育出了抗冻草莓植株。回答下列问题:注:XhoⅠ、KpnⅠ、PstⅠ为三种不同黏性末端的限制酶识别位点;AmpR为氨苄青霉素抗性基因。(1)获取目的基因:提取青稞细胞的__________,经__________过程获得cDNA。在PCR扩增Dhn4时应选择的引物组合是____________,为使扩增后的产物按照正确方向与质粒连接,需在引物的______

(填“5'”或“3'”)末端分别添加限制酶_______________________(顺序需与选择的引物组合对应)的识别序列。mRNA逆转录引物Ⅱ、Ⅲ

Kpn

Ⅰ、XhoⅠ5'(2)构建基因表达载体:启动子的作用_______________________;多种因素会影响Dhn4与质粒的连接效率,如温度与pH等操作环境、反应时间、质粒浓度___________________________________________________________(举两例即可)等。RNA聚合酶识别与结合的部位,启动转录Dhn4基因浓度(目的基因浓度)、质粒与Dhn4基因的比例、DNA连接酶浓度、酶切程度(3)导入、筛选受体细胞:将重组质粒导入农杆菌内,然后在含_____________的培养基上培养、筛选农杆菌,再将阳性农杆菌与草莓叶片共培养,完成转化实验。氨苄青霉素(4)转基因植株的培育与检测:转基因草莓叶片经脱分化形成__________,然后通过调整培养基的_________________________

(填植物激素类型)配比,最终获得幼苗。可通过__________________处理,从个体生物学水平对转基因是否成功进行检测。愈伤组织生长素与细胞分裂素低温(抗冻性检测)1.农牧业方面的应用抗虫功能的基因抗病基因降解或抵抗蛋白质编码基因花青素代谢相关的基因外源生长激素基因乳糖酶基因乳汁1.农牧业方面的应用工程菌牛凝乳酶的基因基因工程菌2.基因工程在食品工业方面的应用3.医药卫生领域的应用基因改造显微注射抗原决定基因克隆免疫排斥三、将目的基因导入受体细实例：利用转基因大肠杆菌生产药物胰岛素加工真核生物蛋白质编码基因导入原核细胞，能产生目标蛋白质吗？要如何处理？不能。真核生物的基因有内含子，原核生物细胞里没有相应的机制来剪切、拼接前体RNA。应取目标蛋白质的mRNA逆转录为cDNA后，构建表达载体并导入原核细胞内才能正确表达蛋白质。原核生物作为受体细胞产生的真核生物的蛋白质通常没有生物活性，因为原核生物没有真核生物的蛋白质加工系统（如内质网、高尔基体等），因此还需要在体外进行再加工。一轮复习，夯实基础！阅读教材P90页资料卡，产干扰素的流程？Q1：怎么使得目的基因只在乳腺中高效表达？Q2：构建乳腺生物反应器的基因表达载体用什么方法导入什么受体细胞？Q3：乳腺生物反应器生产药用蛋白的缺点？Q4：可用什么替代？乳腺蛋白基因的启动子+乳腺蛋白基因+药用蛋白基因显微注射法，受体细胞是受精卵①只有在泌乳期才能生产；②只有诞下雌性动物才能生产；替代：膀胱生物反应器；优点：不受性别和发育时期的限制重难点(五)

利用不同方式生产药物的区别生产方式乳腺生物反应器工程菌含义指让外源基因在哺乳动物的乳腺中特异性表达,利用动物的乳腺组织生产药物蛋白指用基因工程的方法,使外源基因得到高效表达的菌类细胞株系受体与人类基因结构的差异动物与人类的基因结构基本相同细菌和酵母菌与人类的基因结构有较大差异基因表达合成药物蛋白与天然蛋白质相同细菌合成药物蛋白可能没有活性受体细胞动物受精卵微生物细胞目的基因导入方式显微注射法Ca2+处理法生产条件不需严格灭菌;温度等外界条件对其影响不大需严格灭菌,严格控制工程菌所需的温度、pH、营养物质浓度等外界条件药物提取从动物乳汁中提取从