动物细胞融合技术与单克隆抗体高二下学期生物人教版选择性必修3

DNA是主要遗传物质

第二章细胞工程第2节动物细胞工程第2课时

动物细胞融合技术与单克隆抗体选必三RENJIAOBANGAOZHONGSHENGWUXUANBISAN植物体细胞杂交植物细胞融合植物组织培养意义：打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育植物新品种。

飞马？需要什么技术？实验：人——鼠细胞荧光标记融合实验思考：19世纪30年代，科学家曾在患肺结核、天花和麻疹等疾病的病人的病理组织中观察到多核细胞。如何解释这一现象？肺结核病人病理切片诱导

融合病人体内病毒等诱导多个体细胞融合形成了多核细胞。1.概念：使____或_____动物细胞结合形成____细胞的技术。2.结果：形成的________具有原来两个或多个细胞的_________。3.原理：与植物原生质体融合的基本原理相同体现了

。4.诱导融合的常用方法：两个多个一个杂交细胞遗传信息细胞膜具有一定的流动性是动物细胞融合特有的诱导融合方法物理法：电融合法化学法：聚乙二醇（PEG)生物法：灭活病毒诱导法与植物原生质体融合的方法相同5.意义：突破了

的局限，使

成为可能。有性杂交远缘杂交对比相关信息：生物方法：灭活病毒诱导法用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力（即丧失感染活性，不感染细胞），但并不破坏它们的抗原结构（即保留融合活性，诱导细胞融合）病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝聚，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合1.“灭活病毒”中灭活的具体含义是什么？2.灭活病毒诱导细胞融合的原理是什么？病毒的不同“身份”：在免疫调节中病毒属于抗原；在基因工程中可作为载体；在细胞工程中可作为诱导剂。相关信息：生物方法：灭活病毒诱导法3、灭活病毒诱导细胞融合过程：动物细胞融合实质及完成的标志：细胞核的融合6.过程：动物细胞融合动物细胞培养AA、AB、BB细胞膜的流动性细胞增殖动物细胞融合和植物体细胞杂交比较项目植物体细胞杂交动物细胞融合原理细胞融合前的处理方法诱导细胞融合的方法细胞融合成功的标志主要用途意义细胞膜具有一定的流动性、植物细胞的全能性细胞膜具有一定的流动性用果胶酶和纤维素酶去除细胞壁用胰蛋白酶或胶原蛋白酶使细胞分散成单个细胞电融合法、离心法；聚乙二醇（PEG）融合法、高Ca2+-高pH融合法PEG融合法、电融合法、灭活病毒诱导法再生出细胞壁细胞核的融合获得完整的杂种植株主要用于制造单克隆抗体打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育植物新品种突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能7.应用：至今，种间、属间、科间，甚至动物和植物之间的细胞融合都已获得成功。细胞融合技术已经成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和培育生物新品种等的重要手段。利用动物细胞融合技术发展起来的杂交瘤技术，为制造单克隆抗体开辟了新途径。正在融合的淋巴细胞与骨髓瘤细胞（一）补充资料：动物细胞融合技术的发展历史时间成果19世纪30年代观察到肺结核、天花、水痘、麻疹等疾病患者的病理组织中有多核细胞1858年观察到正常组织、发炎组织以及肿瘤组织中的多核细胞现象。1875年第一个观察到脊椎动物（蛙类）的血液细胞发生融合的过程。1876年在无脊椎动物中发现了细胞合并现象。1962年日本学者冈田发现仙台病毒具有触发动物细胞融合的效应。1965年英国科学家证实了灭活的病毒可诱发动物细胞融合1974年华裔加拿大学者高国楠创立了聚乙二醇（PEG）化学融合法。1975年Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B-淋巴细胞和骨髓瘤细胞而产生能分泌稳定单克隆抗体的杂交瘤细胞。20世纪80年代发展出了电融合技术(1985年酵母原生质体电融合)1.机体通过什么免疫过程分泌抗体？2.抗体由什么细胞产生？3.抗体的化学本质是什么？抗体是机体受抗原刺激后B淋巴细胞增殖分化形成的浆细胞产生具有免疫功能的球蛋白抗体体液免疫4.与抗原作用的特点？5.抗体主要分布在哪里？1）血清（主要）2）组织液及外分泌液（如乳汁中）能与该抗原发生特异性结合的抗体定义：机体受抗原刺激后产生的，能与该抗原发生特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。要制备单克隆抗体，就需要找到一种能分泌抗体且增殖能力强的细胞。什么细胞能产生抗体？能产生抗体的细胞能否大量无限增殖？什么细胞具有无限增殖的能力？能否培养出一种能分泌抗体且增殖能力强的细胞？1.传统抗体的获得向动物体内反复注射某种抗原，从动物血清中分离所需抗体产量低、纯度低、特异性差、灵敏度低(2)缺点：(1)方法:不能无限增殖产生大量抗体。动物体内抗原

刺激浆细胞抗体B淋巴细胞增殖分化抗原不纯抗体不纯每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体单一B淋巴细胞细胞群选择克隆产生大量纯度高特异性强的抗体遗憾：B淋巴细胞不可能无限增殖如何解决这一难题？癌细胞能无限增殖，但不能产生抗体1、科学家发现：1）每个B淋巴细胞只分泌一种特异性的抗体2）体内产生的特异性抗体种类多达百万种以上如何获得大量、单一的抗体？浆细胞能产生抗体骨髓瘤细胞能无限增殖一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体骨髓瘤细胞（癌细胞）能无限增殖动物细胞融合杂交瘤细胞动物细胞培养单克隆抗体杂交瘤细胞：既能迅速大量增殖，又能产生抗体(2)单克隆抗体的制备思路1975年，英国科学家米尔斯坦和德国科学家科勒设计了一个极富创造性的试验方案：1984年获得了诺贝尔生理学或医学奖米尔斯坦科勒2.单克隆抗体的制备(1)单克隆抗体的概念:由单个B淋巴细胞经过无性繁殖（克隆），形成基因型相同的细胞群，这一细胞群所产生的化学性质单一、特异性强的抗体称为单克隆抗体。一个B淋巴细胞克隆细胞群抗体单克隆抗体米尔斯坦和科勒制备单克隆抗体过程的示意图用抗原注射小鼠从患骨髓瘤的小鼠体内取骨髓瘤细胞的培养已免疫多种B淋巴细胞骨髓瘤细胞诱导融合多种杂交细胞小鼠的脾脏中获取(3)制备过程：PEG融合法、电融合法、灭活病毒诱导法置于选择性培养基上培养

2杂交瘤细胞13第一次筛选多种杂交瘤细胞融合的细胞骨髓瘤细胞自身融合B细胞自身融合杂交细胞132未融合的B淋巴细胞未融合的骨髓瘤细胞未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长。克隆化培养抗体检测第二次筛选(抗原-抗体杂交技术)多种杂交瘤细胞能分泌所需抗体的杂交瘤细胞阳性细胞注射到小鼠体内体外培养分离、提纯单克隆抗体体内或体外培养能分泌所需抗体的杂交瘤细胞细胞培养工程师在工作补充资料1：如何进行第一次筛选获得多种杂交瘤细胞？←B淋巴细胞及同型融合细胞←骨髓瘤细胞及同型融合细胞←杂交瘤细胞①已知细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基嘌呤阻断。②人淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径，但一般不能分裂增殖。

③鼠骨髓瘤细胞中只有D途径，没有S途径，但能不断分裂增殖。筛选出杂交瘤细胞方法？不能无限增殖，死亡不能无限增殖，死亡能无限增殖，生长培养基中加入氨基嘌呤HAT培养基将这些杂交瘤细胞进行培养并稀释稀释到之后将培养液滴入96孔板的每个孔中，每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞。补充资料2：如何进行第二次筛选获得能分泌所所需抗体的杂交瘤细胞？补充资料2：如何进行第二次筛选获得能分泌所所需抗体的杂交瘤细胞？补充资料2：如何进行第二次筛选获得能分泌所所需抗体的杂交瘤细胞？抗原1补充资料2：如何进行第二次筛选获得能分泌所所需抗体的杂交瘤细胞？抗体检测呈阳性补充资料2：如何进行第二次筛选获得能分泌所所需抗体的杂交瘤细胞？补充资料2：如何进行第二次筛选获得能分泌所所需抗体的杂交瘤细胞？阳性孔抗体检测板抗原-抗体杂交(分子水平的鉴定）抗体检测原理：补充：若不是滴入每个孔中的不是一个杂交瘤细胞，可再进行多次稀释并检测！补充了解——克隆化培养和抗体检测★有限稀释法每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞侧面模拟图克隆化培养一段时间取上清液进行抗体检测将杂交瘤细胞群稀释后滴入多孔板，约每孔1个细胞进行培养（克隆化培养）一段时间后，用标记的抗原检测各孔上清液中细胞分泌的抗体上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔分泌抗体能跟特定抗原结合的细胞即为所需杂交瘤细胞多次克隆化培养以及有限稀释法补充资料2：如何进行第二次筛选获得能分泌所所需抗体的杂交瘤细胞？将杂交瘤细胞群稀释后滴入多孔板，约每孔1个细胞进行培养（克隆化培养）一段时间后，用标记的抗原检测各孔上清液中细胞分泌的抗体上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔分泌抗体能跟特定抗原结合的细胞即为所需杂交瘤细胞多孔细胞培养板阳性孔抗体检测板多次克隆化培养以及有限稀释法比较两次筛选的原因、方法和结果。第一次筛选第二次筛选原因方法结果诱导融合后得到的细胞中，除杂交瘤细胞之外，还有未融合的亲本细胞，也有融合的具有同种核的细胞用特定的选择培养基进行筛选：未融合的亲本和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长。筛选获得杂交瘤细胞由于小鼠在生活中还受到其他抗原的刺激，所以经第一次筛选之后获得的杂交瘤细胞中有能产生其他抗体的细胞用96多孔板培养，在每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞的情况下，进行克隆化培养和抗体检测，经多次筛选得到足够数量的能分泌所需抗体的细胞获得足够数量的能分泌所需抗体的杂交瘤细胞动物细胞融合动物细胞培养给小鼠注射特定的抗原蛋白B淋巴细胞（免疫）骨髓瘤细胞杂交细胞杂交瘤细胞单克隆抗体能分泌所需抗体的杂交瘤细胞第一次筛选第二次筛选诱导融合选择培养基克隆化培养，专一抗体检验体外培养或小鼠腹腔内增殖特异性强灵敏度高可大量制备既能大量繁殖又能产生专一抗体培养杂交瘤细胞的方法比较项目腹腔培养体外培养优点缺点易于控制培养条件（如无需提供无菌环境等），操作简单，成本较低规模小，产量少可大规模培养，大量生产需要人为控制培养条件，成本相对较高克隆化培养和抗体检测用培养液将杂交瘤细胞群稀释注射到小鼠体内（体内培养）体外培养单克隆抗体约每孔1个细胞进行培养（克隆化培养）多孔细胞培养板(1)能准确地识别抗原的细微差异;(2)与特定抗原发生特异性结合;(3)可以大量制备。3.单克隆抗体的优点：单克隆抗体制备过程中的相关考点总结（1）该过程中应用到的技术_______________________________________（2）原理_______________________________________（3）注射特定抗原的目的______________________________________________（4）诱导融合的方法______________________________________动物细胞特有的诱导融合方法为_______________________动物细胞融合、动物细胞培养细胞膜具有一定的流动性、细胞增殖用特定的抗原对小鼠进行免疫，并从该小鼠的脾中得到能产生特定抗体的B淋巴细胞PEG融合法、电融合法、灭活病毒诱导法灭活病毒诱导法（5）第一次筛选的目的______________________

第一次如何筛选___________________________

筛选原理_________________________________________________________________________________筛选获得杂交瘤细胞用特定的选择培养基进行筛选在选择培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长单克隆抗体制备过程中的相关考点总结（6）杂交瘤细胞的特点__________________________________（7）第二次筛选的目的________________________________________________如何筛选___________________________________________________选择抗体检测呈___性的杂交瘤细胞，即______________________________（8）抗体检测原理_______________________________________获得足够数量的能分泌所需抗体的杂交瘤细胞进行克隆化培养和抗体检测（进行多次筛选）分泌的抗体能与特定的抗原结合抗原和抗体能够特异性结合(分子水平的鉴定）既能迅速大量增殖，又能产生抗体（9）如何获取大量所需杂交瘤细胞__________________________________________（10）如何获取单克隆抗体①体外培养___________________________②小鼠腹腔内培养_________________________（11）单克隆抗体的优点______________________________________________________________________________在体外条件下大规模培养（接种于培养液中）或注射到小鼠腹腔内增殖从细胞培养液中获取从小鼠腹水中获取能准确地识别抗原的细微差异，与特定抗原发生特异性结合，并且可以大量制备阳资料2.使用高效的细胞毒素类药物进行化疗可以有效杀伤肿瘤细胞。但细胞毒素没有特异性，在杀伤肿瘤细胞的同时还会对健康细胞造成伤害，这限制了它在临床上的应用。抗体—药物偶联物（ADC）通过将细胞毒素与能特异性识别肿瘤抗原的单克隆抗体结合，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤。ADC通常由抗体、接头和药物（如细胞毒素）三部分组成，它的作用机制如下图所示。资料1.用抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体做成的"早早孕诊断试剂盒"，在妊娠第8天就可以作出诊断，这比原来的诊断方法提前了10d左右，可以避免孕妇在不知道妊娠的情况下因服用药物而对胎儿造成不利影响。该方法检测的准确率在90%以上。单克隆抗体的应用1.ADC的抗体和药物各具有什么作用？2.除了细胞毒素，还有哪些物质理论上可以作为ADC偶联的药物？抗体：主要发挥靶向运输作用，即通过特异性结合靶细胞表面的抗原，将连接的药物输送到靶细胞；药物：发挥治疗效应，如杀伤靶细胞。①可以用放射性同位素标记单克隆抗体进行靶向放疗；②一些作用于细胞信号转导通路的药物可以通过阻断肿瘤细胞的信号通路来抑制其生长，理论上也可以将这些药物与单克隆抗体结合进行治疗。单克隆抗体的应用3.单克隆抗体诊断试剂盒和ADC在临床应用上各具有什么优势？①单克隆抗体诊断试剂盒中的单克隆抗体只与特定的抗原反应，因此检测的特异性和灵敏度大大提高；②生产单克隆抗体的杂交瘤细胞可以传代培养、冷冻保存和复苏利用，有利于控制产品的质量和标准化生产诊断试剂盒；③ADC能够协同发挥抗体特异性识别的靶向作用和细胞毒素对肿瘤细胞的杀伤作用，因此它在临床上具有靶点清楚、毒副作用小等优点。单克隆抗体的应用（1）诊断试剂——最广泛应用抗原-抗体杂交法抗人绒毛促性腺激素单克隆抗体在妊娠第8天就可以作出诊断，比原来诊断方法提前了10d左右，准确率在90﹪以上。具有准确、高效、简易、快速特点诊断优点：4.单克隆抗体的应用乙肝测定试剂艾滋病检测试剂血型检测试剂新冠病毒检测试剂（1）诊断试剂——最广泛应用4.单克隆抗体的应用抗体-药物偶联物（ADC）通过将

与能特异性识别肿瘤抗原的

结合，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤。ADC通常由_____、______和______三部分组成。单克隆抗体细胞毒素抗体接头药物“生物导弹”=单克隆抗体＋化学药物

或＋细胞毒素

或＋放射性同位素优点：位置准确、疗效高、副作用小单抗导向，药物为弹头靶向运输作用（2）运载药物（2）运载药物单克隆抗体+同位素（荧光标记）在特定组织中成像的技术，可定位诊断肿瘤、心血管畸形等疾病。结合荧光标记的单克隆抗体药物单克隆抗体可单独使用，也可直接用于治疗疾病（3）治疗疾病单克隆抗体筛选二杂交细胞杂交瘤细胞体外或体内培养