《干细胞制剂质量控制和临床前研究指导原则(试行)》

《干细胞制剂质量控制和临床前研究指导原则(试行)》1适用范围与基本原则1.1适用范围本原则适用于经体外分离、培养、扩增、基因修饰、分化等操作制备，用于人体临床研究及上市申报的各类干细胞制剂，包括成体干细胞、诱导多能干细胞（iPSC）、胚胎干细胞（ESC）来源的干细胞制剂。不适用于未经体外操作的自体造血干细胞移植、生殖细胞类干细胞研究，此类研究按照其他相关规定执行。1.2基本原则1.2.1全程风险控制原则：干细胞制剂的核心风险为异质性、基因型异常、致瘤性、外源因子污染，需建立从供体取材到临床使用全链条的质量控制体系，针对不同风险层级设置对应控制措施，将风险控制在可接受范围内。1.2.2全过程可追溯原则：所有环节需保留完整记录，建立唯一标识体系，实现从供体到受者的全流程溯源，满足长期安全性随访的要求。1.2.3工艺一致性原则：生产工艺需经过充分验证，保证不同批次干细胞制剂的质量属性、生物学活性的一致性，批间差异符合预设阈值要求。1.2.4分级分类管理原则：根据干细胞类型、来源、制备工艺、临床用途的不同，设置差异化的质量控制要求，多能干细胞来源制剂的风险控制要求严于成体干细胞制剂，基因修饰干细胞严于未修饰干细胞。2原材料质量控制2.1供体与原始细胞质量控制2.1.1供体筛查与伦理要求所有供体必须获得符合伦理规范的知情同意书，符合《赫尔辛基宣言》及我国生物技术研究伦理审查规定，胚胎干细胞供体必须符合国家人类胚胎干细胞研究伦理要求，禁止使用不符合伦理的胚胎来源细胞。供体需完成全套健康筛查，强制性筛查病原体包括：乙型肝炎病毒（HBV）DNA/表面抗原、丙型肝炎病毒（HCV）RNA、人类免疫缺陷病毒（HIV）1/2型抗体/RNA、梅毒螺旋体（TP）抗体、巨细胞病毒（CMV）DNA/IgM、EB病毒DNA、人类T淋巴细胞白血病病毒（HTLV）1/2型，所有筛查结果阴性方可使用，阳性供体来源细胞仅可用于针对对应疾病的临床研究，且需明确标注风险。异体供体额外需完成人类白细胞抗原（HLA）高分辨分型，排除严重遗传性疾病、恶性肿瘤（治愈5年以上非血液肿瘤除外）、严重自身免疫病，自体供体需排除除目标治疗疾病外的上述禁忌疾病。原始取材过程需符合无菌操作要求，取材样本需标记唯一供体标识，24小时内进入制备流程。2.1.2种子细胞库建立与质量控制干细胞生产必须建立主细胞库（MCB）和工作细胞库（WCB）两级细胞库，MCB冻存数量不少于20支，WCB冻存数量不少于50支，冻存复苏后细胞活率不得低于80%。两级细胞库需完成以下强制检测：（1）细胞鉴别：人源干细胞必须采用STR分型鉴定，与供体原组织样本的STR匹配符合率不低于90%，判定为同源一致，排除异源细胞交叉污染；多能干细胞额外需检测多能性标志物，Oct4、Sox2、Nanog、SSEA-4、Tra-1-60阳性率不低于90%；成体干细胞需完成表面标志物鉴定，符合对应细胞类型的标准要求。（2）无菌、支原体、内毒素检测：无菌检查符合《中华人民共和国药典》三部要求，无细菌真菌污染；支原体检查阴性；内毒素含量≤0.5EU/mL。（3）基因型稳定性检测：采用G显带核型分析，至少分析20个中期分裂相，染色体数目与结构异常率不得超过5%，异常率超过阈值判定为不合格；对于基因修饰干细胞，需验证目的基因整合位点、拷贝数，确认整合位点不涉及癌基因、抑癌基因启动子区域，脱靶效应符合安全要求，无功能基因破坏风险。（4）致瘤性预检测：多能干细胞种子库必须完成体内致瘤性预实验，接种10倍临床拟用总剂量至免疫缺陷小鼠，观察16周无肿瘤形成方可放行。2.2生产用辅料质量控制所有生产用原辅材料必须符合药用级别要求，优先选用无动物源、无血清原材料，确需使用动物源原材料的，必须完成外源因子筛查：胎牛血清需检测牛病毒性腹泻病毒（BVDV）、牛副流感病毒3型、牛腺病毒，全部阴性，内毒素≤0.25EU/mL，残留宿主蛋白≤100ng/mg。重组细胞因子、消化酶等生物活性原材料，纯度不低于95%，比活性符合规定，生产工艺中病毒清除验证的对数下降值（LRV）不低于4，保证清除99.99%以上的潜在外源病毒。最终制剂中辅料添加量符合注射剂药用要求，无未经批准的毒性辅料。3生产过程质量控制干细胞制备全过程必须符合药品生产质量管理规范（GMP）要求，暴露于环境的细胞操作工序需在B级洁净区背景下的A级操作区进行，环境沉降菌、浮游菌、表面微生物每批次检测，符合洁净区级别要求。3.1工艺过程监控所有生产工艺必须经过连续3批工艺验证，关键工艺参数确定后不得随意变更，变更后需重新完成验证和可比性研究。细胞培养过程中，每2-3天检测一次细胞密度、活率、形态，细胞活率持续低于85%时需终止生产排查原因；明确规定最大允许传代次数，生产终末细胞传代次数不得超过经稳定性验证的最高传代，每5代检测一次核型，染色体异常率超过5%立即终止生产。分离纯化过程需控制死细胞去除率不低于95%，细胞碎片残留率不高于1%，收获细胞浓度控制在工艺规定范围内，偏差超过±10%判定为不合格。3.2过程中质量控制每批次生产过程需完成以下中控检测：培养中期、收获前各检测一次无菌和支原体，结果阳性直接报废；收获后完成细胞计数、活率检测，活率低于80%报废；抽样完成STR鉴定，确认无交叉污染；对于iPSC分化来源的终末细胞，收获后需检测未分化多能干细胞残留，残留率不得超过0.01%，超过阈值的产品报废。4终制剂质量控制终制剂需按照质量标准完成全项检测，所有项目合格方可放行，检测项目包括：4.1一般质量属性（1）外观性状：应为均匀混悬液，无凝块、异物、沉淀，颜色符合规定；（2）pH值：范围7.0-7.6，偏差控制在±0.2以内；（3）渗透压：范围280-320mOsm/kg，符合生理要求；（4）细胞浓度：实测浓度与标示浓度偏差不得超过±10%；（5）细胞活率：终制剂细胞活率不得低于80%，低于阈值判定不合格。4.2鉴别与纯度杂质检测（1）细胞鉴别：终制剂必须再次完成STR分型鉴定，确认与供体来源一致，无异源细胞污染；间充质干细胞（MSC）需符合国际细胞治疗学会（ISCT）标准：CD105、CD73、CD90阳性率不低于95%，CD45、CD34、CD11b、CD19、HLA-DR阳性率不高于2%；其他类型干细胞对应表面标志物符合各自质量标准。（2）工艺残留杂质：血清白蛋白残留量不超过50μg/剂量，胰蛋白酶残留量不超过10ng/剂量，基因修饰工艺的宿主细胞蛋白残留不超过100ng/剂量，宿主DNA残留不超过10ng/剂量，所有残留杂质符合药用要求。4.3安全性检测（1）无菌、支原体、内毒素：符合药典要求，全部阴性，内毒素每剂量不超过5EU；（2）外源病毒因子检测：体外细胞培养法检测覆盖10种以上常见人源病毒，全部阴性，体内乳鼠、鸡胚接种试验无病毒增殖迹象；（3）致瘤性检测：所有含有增殖能力干细胞的制剂必须完成体内致瘤性检测，接种不低于10倍临床拟用剂量的细胞至免疫缺陷小鼠，观察16周，无肿瘤形成或异常增殖性包块，出现包块需经病理确认，证实为肿瘤的判定为不合格；对于终末分化无增殖能力的细胞，可提供充分增殖能力证明后减免，但需保留抽检权限。（4）基因安全性检测：基因修饰干细胞需再次验证插入位点稳定性，脱靶位点无致癌风险，拷贝数符合规定。4.4生物学活性检测生物学活性是反映制剂有效性的核心指标，需根据细胞类型和用途设置对应项目：MSC需检测免疫抑制活性，对淋巴细胞增殖的抑制率不低于50%；促血管生成干细胞需检测体外管形成能力，管数量符合预设范围；神经干细胞需检测神经营养因子分泌量，符合规定区间；所有终制剂生物学活性不得低于标示值的80%，低于下限判定为不合格。5临床前研究5.1药学可比性研究工艺确定后连续生产3批产品，评估批间一致性：细胞活率批间相对标准差（RSD）不超过5%，细胞浓度批间RSD不超过8%，生物学活性批间RSD不超过15%，所有质量指标符合标准，证明工艺稳定。若发生生产工艺变更，需完成变更前后的质量可比性研究，核心质量属性差异不超过10%，安全性相当，方可进入后续研究。5.2安全性评价5.2.1一般毒性评价：设置低、中、高三个剂量组，高剂量不低于临床拟用剂量的10倍；急性毒性试验单次给药，观察14天，动物死亡率不超过10%，最大耐受剂量不低于临床剂量的20倍；长期毒性试验观察周期为临床给药周期的2倍，单次给药的制剂观察周期不少于3个月，检测血常规、血生化、脏器组织病理，所有毒性反应需可逆，停药4周后可恢复，无不可逆脏器损伤；局部给药制剂额外需做局部刺激试验，刺激评分不超过1级，无严重炎症反应。5.2.2免疫原性评价：异体干细胞制剂必须完成免疫原性检测，给药后4周、12周检测抗供体细胞抗体，抗体滴度不超过1:32，无超敏反应、血清病发生；基因修饰干细胞需检测抗修饰蛋白抗体，无持续高滴度抗体产生。5.2.3体内分布评价：采用荧光素或核素标记干细胞，观察1天、7天、14天、28天、3个月五个时间点的体内分布，干细胞需逐步被清除，给药3个月后体内残留细胞量不超过给药总量的1%，无特定脏器异常蓄积，无生殖器官异常残留。5.2.4特殊毒性评价：育龄人群使用的干细胞制剂必须完成生殖毒性试验和遗传毒性试验，Ames试验、小鼠微核试验、染色体畸变试验全部阴性，致畸试验无胚胎畸形、发育异常。5.3有效性评价需选择与人类疾病相似度高的动物模型开展有效性研究，至少包括两种不同物种的模型，优先增加大动物（猪、非人灵长类）研究：治疗心肌梗死的干细胞需在大鼠心肌梗死模型验证，给药后4周左室射血分数较对照组提高不低于10%，差异具有统计学意义（P<0.05）；治疗骨缺损的干细胞需在大鼠颅骨缺损模型验证，12周成骨率不低于50%，显著高于对照组；需设置三个剂量梯度明确量效关系，确定临床拟用剂量范围，为临床研究给药方案提供依据。6放行、储存运输与稳定性研究6.1放行要求：每批产品放行需提供完整的全项质量检验报告，所有项目符合质量标准，由质量授权人签字放行，不合格产品不得进入临床研究，所有生产检验记录至少保存至产品有效期后5年。6.2储存与运输：冻存干细胞制剂需储存于-150℃以下液氮环境，短期储存可放置于-80℃冰箱，温度连续监控，每小时记录一次，-150℃储存温度高于-130℃超过2小时、-80℃储存温度高于-60℃超过1小时的产品报废；2-8℃保存的新鲜制剂有效期不超过72小时；冻存制剂运输采用干冰保温，全程温度监控，保持温度低于-130℃，运输后温度不符合要求的不得接收。6.3稳定性研究：实时稳定性研究需放置3批产品在规定储存条件下，每3个月检测一次，持续2年，细胞活率下降不超过10%，所有指标符合标准，以此确定有效期；开展影响因素试验，25℃放置24小时、反复冻融3次后，细胞活率下降不超过15%，无微生物污