CN119432701A 一株异源合成卵转铁蛋白的重组芽孢杆菌及其构建方法与应用 （南京工业大学）

一株异源合成卵转铁蛋白的重组芽孢杆菌源合成卵转铁蛋白的重组芽孢杆菌及其构建方解淀粉芽孢杆菌)为宿主，利用基因工程技术异源表达了卵转铁蛋白OVT基因，不仅实现了不同来源卵转铁蛋白基因OVT1和OVT2在底盘细胞中25.根据权利要求1或2任意一项所述的重组芽7.权利要求1所述重组芽孢杆菌的构建方法，其8.权利要求2所述重组芽孢杆菌的构建方法，其特征在9.权利要求1所述重组芽孢杆菌或权利要求2所述重组芽孢杆菌在发酵生产卵转铁蛋34芽孢杆菌CF已公开在专利CN116004496A(一种生产透明质酸的基因工[0021]一株异源合成卵转铁蛋白的重组芽孢杆菌的构建方法，将含有卵转铁蛋白OVT基转铁蛋白OVT基因和分子伴侣基因的表达载体转化至芽孢杆菌中，构建得到所述重组芽孢[0023]其中，当所述重组芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌时，所述表达载体为表达载体[0025]上述重组芽孢杆菌在发酵生产卵转铁蛋白中的应用也在本发明所保护的范围之5菌时，所述诱导剂为0.2～0.4mMIPTG，在本发明的一些实施例中，所述IPTG添加量为[0033](1)本发明分别以枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌作为底盘细胞，利用基因工程卵转铁蛋白的高效表达，进一步以解淀粉芽孢杆菌为宿主细胞，选用三种不同分子伴侣[0035]下面结合附图对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的[0036]图1为含有不同来源密码子优化的目的基因的重组菌株蛋白表达SDS_PAGE对比[0037]图2为不同宿主菌的对照菌与重组菌株的生长量和卵转铁蛋白表达量对比图[0038]图3为共表达分子伴侣的解淀粉芽孢杆菌重组菌株蛋白表达SDS_PAGE对比图；其[0039]图4为共表达分子伴侣的解淀粉芽孢杆菌重组菌株的生长量和卵转铁蛋白表达量[0040]下面结合具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其载体pHT01购自通用生物(安徽)股份有限公司，所述枯草芽孢杆菌MATE01购自天津淳瑶生物科技有限公司，所述解淀粉芽孢杆菌CF已公开在专利CN116004496A(一种生产透明质酸6[0045]从NCBI中调取卵转铁蛋白(OVT)的cDNA序列(NCBI数据库基因登陆号为NP_[0057]3、利用单片段同源重组酶将实施例1中纯化后的目的基因(OVT1_M基因片段、OVT1_H基因片段、OVT2_M基因片段、OVT2_H基因片段)分别与反向PCR后的载体片段72O补齐20μL[0061]取一支100μL的枯草芽孢杆菌MATE01感受态细胞置于冰上5～10min解冻后，加入组质粒pMATE05_OVT1或pMATE05_OVT2分别转化至上述培养后的枯草芽孢杆菌MATE01感受[0064](1)重组质粒先转化至大肠杆菌GM2163菌体涂布于含有100mg/L氨苄青霉素抗性的LB平板上，将平板倒扣放置于37℃静置培养16~24h。挑取单个阳性克隆接种至3～5mL含有100mg/L氨苄抗生素的LB培养基，于37℃、82号泳道标注条带为重组解淀粉芽孢杆菌CF_pHT_OVT1和CF_pHT_OVT2中卵转铁蛋白表达情展示更适合卵转铁蛋白表达的含目的基因OVT2的重组菌株组的卵转铁蛋白表达量)，结果转化至解淀粉芽孢杆菌中的实验步骤，分别获得重组解淀粉芽孢杆菌CF_pHT_OVT2_PrsA、pHT_OVT2_DnaK、CF_pHT_OVT2_CsaA参考实施例4中卵转铁蛋白在重组菌株中的分泌表达9[0077]通过重组菌株的生长量变化观察卵转铁蛋白表达后产生的抑菌作用，并用SDS_相符合。利用ELISA试剂盒检测重组菌株的卵转铁蛋白产量，结果显示，共表达分子伴侣[0