CN119432822A 碱基编辑器及其构建方法与应用 （复旦大学）

202111226226.X2021.10.21碱基编辑器及其构建方法与应用一种碱基编辑器及其构建方法与应用，用于DNA辑精度高且RNA/DNA脱靶风险低的CBE以及体积更小的ACBE工具。本发明中开发的ABE工具在介效应有明显降低，甚至消除；本发明中开发的2突变型TadA_8e是指TadA_8e中氨基酸位点为第108位的氨TadA_8e的氨基酸序列如SEQID酸位点为第108位的氨基酸突变为不同于所在位点自身原来氨基酸的另外19种氨基酸中的优选地，突变型TadA_8e是指TadA_8e中氨基酸进行以下单点突变后所得的脱氨酶：优选地，所述突变型TadA_8e是指TadA_8e中氨基酸进行以下三点突变后所得的脱氨I49A_V82T_N108Y、I49G_V82T_N108Y、I49G_V82G_N108Y、A48G_V82G_N108Y、A48G_3优选地，所述突变型TadA_8e是指TadA_8e中氨基酸位点第108位进行突变N108Y或TadA_8e中氨基酸位点第49位进行突变TadA_8e中氨基酸位点第82位进行突变优选地，所述突变型TadA_8e是指TadA_8e中氨基酸进行以下五点突变后所得的脱氨TadA_8e中氨基酸位点第108位进行突变N108Y或N108H的同时，TadA_8e中氨基酸位点TadA_8e中氨基酸位点第49位进行突变TadA_8e中氨基酸位点第82位进行突变8.根据权利要求1或2或3或4或5或6或7所述的碱基编辑优选地，突变型TadA_8e的5’和3’分别添加NLS序列和link基酸中一个或几个发生了突变，NLS_TadA_8e_linker的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示，NLS_突变型TadA_8e_linker的氨基酸序列为NLS_TadA_8e_linker氨基酸序列中将TadA_8e置换为突变型TadA_8e得到的氨基酸序列。9.根据权利要求1或2或3或4或5或6或7所述的碱基编突变型TadA_8e是指TadA_8e中氨基酸位点为第108位的氨4碱基编辑器ABE指TadA_8e中氨基酸位点为第108位的氨基酸突变后的脱氨酶置于碱基编辑器CBE指TadA_8e中氨基酸进行以下突变后所得的脱氨酶置于nSpCas9的N_末三点突变：I49A_V82T_N108Y、I49A_V82G1_N108Y、I49G_V82T_N108Y、I49G_V82G_V28G_A48G_V82G_N108Y、V28G_I49A_V82T_N108Y、V28G_I49A_V82G_N108Y、V28G_I49G_V82T_N108Y、V28G_I49G_V82G_N108Y、A48G_I49A_V82T_N108Y、A48G_I49A_V82G_N108Y、A48G_I49G_V82T_N108Y、A48G_I49G_V82G_N108Y、V28G_A48G_I49A_N108H、V28G_A48G_I49G_N108H、V28G_A48G_V82T_N108H、V28G_A48G_V82G_N108H、V28G_I49A_V82T_N108H、V28G_I49A_V82G_N108H、V28G_I49G_V82T_N108H、V28G_I49G_V82G_N108H、A48G_I49A_I49A_V82G_N108Y、V28G_A48G_I49G_V82G_N108Y、V28G_A48G_I49A_V82T_N108H、V28G_碱基编辑器ACBE指TadA_8e中氨基酸位点为第108位的氨基酸突变后的脱氨酶置于5I49A_V82T_N108Y、I49G_V82T_N108Y、I49G_V82G_N108Y、A48G_V82G_N108Y、A48G_或，所述突变型TadA_8e是指TadA_8e中氨基酸进行以下四点突变后所得的脱氨酶：V28G_A48G_I49A_N108Y、V28G_A48G_I49G_N108Y、V28G_A48G_V82T_N108Y、V28G_A48G_V82G_N108Y、V28G_I49A_V82T_N108Y、V28G_I49A_V82G_N108Y、V28G_I49G_V82T_N108Y、V28G_I49G_V82G_N108Y、A48G_I49A_V82T_N108Y、A48G_I49A_V82G_N108Y、A48G_I49G_V82T_N108Y、A48G_I49G_V82G_N108Y、V28G_A48G_I49A_N108H、V28G_A48G_I49G_N108H、V28G_A48G_V82T_N108H、V28G_A48G_V82G_N108H、V28G_I49A_V82T_N108H、V28G_I49A_V82G_N108H、V28G_I49G_V82T_N108H、V28G_I49G_V82G_N108H、A48G_I49A_V82T_N108H、或，所述突变型TadA_8e是指TadA_8e中氨基酸进行以下五点突变后所得的脱氨酶：V28G_A48G_I49A_V82T_N108Y、V28G_A48G_I49G_V82T_N108Y、V28G_A48G_I49A_V82G_N108Y、V28G_A48G_I49G_V82G_N108Y、V28G_A48G_I49A_V82T_N108H、V28G_A48G_I49G_6碱基编辑器及其构建方法与应用[0001]本申请是分案申请，本分案申请的母案申请日为2021年10月21日，申请号为[0003]CRISPR/Cas9为代表的新型基因编辑技术给生物医学研究带来了变革，这一技术(cytidinedeaminase)与突变型核酸酶(如携带有D10A或突变突变型核酸酶(如携带有D10A或突变的spCas9，称为nCas9)融合，得到的融合蛋白可在变型核酸酶(如携带有D10A或突变的spCas9，称为nCas9)以及尿嘧啶糖基化酶抑制因子变，这降低了ABE工具编辑的特异性和精确度，不利于ABE的应用(NatBiotechnol,2021前适用于ABE构建的脱氨基酶均来自定向演化后的大肠杆菌来源的腺苷脱氨酶(ecTadA*)，[0005]现有CBE工具中的脱氨酶均属于胞嘧啶核苷脱氨酶(cytidinedeaminase)家族，一系列问题，目前依然缺少在RNA/DNA脱靶效应以及编辑精度等多个方面进行协同优化的CBE工具(NatBiotechnol,2020.38(5):620_628；NatCommun,2020.11(7[0006]现有ACBE工具需要在nCas9上同时融合两种脱氨酶(胞嘧啶核苷脱氨酶(cytidine[0010]本发明的基本原理是，针对定向演化后的大肠杆菌来源的腺苷脱氨酶(TadA_8e)[0011]大肠杆菌来源的腺苷脱氨酶(ecTadA)经蛋白定向演化后(演化后称为ecTadA*)，8[0018]突变型TadA_8e是指TadA5埃的氨基酸中一个或几个突变后的脱氨酶，尤其是指TadA_8e中氨基酸位点为第108位的[0021]在本发明的一个实施方式中，突变型TadA_8e是指TadA_8e中氨基酸位点为第108位的氨基酸中一个突变为不同于所在位点自身原来氨基酸的另外19种氨基酸中的一种以[0022]优选地，突变型TadA_8e是指TadA_8e中氨基酸进行以下单点突变后所得的脱氨第28位氨基酸位点突变前的氨基酸，W表示TadA_8e中第28位氨基酸位点突变后的氨基酸，[0027](2)氨基酸位点第49位的氨基酸突变的同时，第108位的[0029]优选地，突变型TadA_8e是指TadA_8e中氨基酸进行以下双点突变后所得的脱氨9[0031]所述V28G_N46C表示第28位氨基酸位点由缬氨酸突变为甘氨酸以及第46位氨基酸[0038]I49A_V82T_N108Y、I49A_V82G1_N108Y、I49G_V82T_N108Y、I49G_V82G_N108Y、[0041]在本发明的一个实施方式中，所述突变型TadA_8e是指TadA_8e中氨基酸位点第基酸由异亮氨酸突变为甘氨酸、第82位氨基酸由缬氨酸突变为苏氨酸以及第108位氨基酸[0049]在本发明的一个实施方式中，所述突变型TadA_8e是指TadA_8e中氨基酸位点第[0051]TadA_8e中氨基酸位点第108位进行突变N108Y或N108H的同时，TadA_8e中氨基酸[0056]所述V28G_A48G_I49G_V82T_N108H表示第28位氨基酸由缬氨酸突变为甘氨酸、第酸由缬氨酸突变为苏氨酸以及第108位氨基酸由天冬酰胺突变为组氨酸上文或下文中其中氨基酸中一个或几个发生了突变，NLS_TadA_8e_linker的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示，NLS_突变型TadA_8e_linker的氨基酸序列为NLS_TadA_8e_linker氨基酸序列中将SGGSSGSETPGTSESATPESS[0069]碱基编辑器ABE是指ecTadA第106和第108同源的氨基酸分别突变为缬氨酸和天冬[0070]碱基编辑器ABE还指TadA_8e中氨基酸进行以下单点突变或点突变组合后所得的[0072]碱基编辑器CBE指TadA_8e中氨基酸进行以下突变后所得的脱氨酶置于nSpCas9的[0075]四点突变：V28G_A48G_I49A_N108Y、V28G_A48G_I49G_N108Y、V28G_A48G_V82T_I49G_V82T_N108Y、V28G_I49G_V82G_N108Y、A48G_I49A_V82T_N108Y、A48G_I49A_V82G_A48G_I49G_N108H、V28G_A48G_V82T_N108H、V28G_A48G_V82G_N108H、V28G_I49A_V82T_I49A_V82T_N108H、A48G_I49A_V82G_N108H、A48G_I49G_V82T_N108H、A48G_I49G_V82G_A48G_I49A_V82G_N108Y、V28G_A48G_I49G_V82G_N108Y、V28G_A48G_I49A_V82T_N108H、V28G_A48G_I49G_V82T_N108H、V28G_A48G_I49A_V82G_N108H、V28G_A48G_I49G_V82G_[0078]碱基编辑器ACBE指TadA_8e中氨基酸进行点突变或点突变组合后所得的脱氨酶置TadA_8e蛋白指TadA_8e中氨基酸位点为第108位的氨基酸中一个或[0080]优选地，突变型TadA_8e是指TadA_8e中氨基酸进行以下单点突变后所得的脱氨[0084]或，所述突变型TadA_8e是指TadA_8e中氨基酸进行以下三点突变后所得的脱氨[0086]或，所述突变型TadA_8e是指TadA_8e中氨基酸进行以下四点突变后所得的脱氨V82G_N108Y、V28G_I49A_V82T_N108Y、V28G_I49A_V82G_N108Y、V28G_I49G_V82T_N108Y、V28G_I49G_V82G_N108Y、A48G_I49A_V82T_N108Y、A48G_I49A_V82G_N108Y、A48G_I49G_V82T_N108Y、A48G_I49G_V82G_N108Y、V28G_A48G_I49A_N108H、V28G_A48G_I49G_N108H、V28G_A48G_V82T_N108H、V28G_A48G_V82G_N108H、V28G_I49A_V82T_N108H、V28G_I49A_V82G_N108H、V28G_I49G_V82T_N108H、V28G_I49G_V82G_N108H、A48G_I49A_V82T_N108H、[0087]或，所述突变型TadA_8e是指TadA_8e中氨基酸进行以下五点突变后所得的脱氨N108Y、V28G_A48G_I49G_V82G_N108Y、V28G_A48G_I49A_V82T_N108H、V28G_A48G_I49G_[0089]进一步地，所述的突变型TadA_8e蛋白或所述的腺嘌呤脱氨酶TadA突变蛋白为单[0100]图2为NLS_TadA合位点)时所得的多种碱基编辑器ABEs在sgRNA_S1位点处对碱基A(A·T__G·C突变)和C[0101]图3a为1249_NLS_TadA_8e_linker和1249_TadA_8e在sgRNA_S1位点处对第四位碱[0104]图4为1249_NLS_TadA_8e_linker中TadA_8e在V28(A)和V30(B)饱和突变后在[0106]图5为1249_NLS_TadA_8e_linker中TadA_8e在N46(A)和A48(B)饱和突变后在[0108]图6为1249_NLS_TadA_8e_linker中TadA_8e在I49(A)和V82(B)饱和突变后在[0110]图7为1249_NLS_TadA_8e_linker中TadA_8e在F84(A)和N108(B)饱和突变后在[0112]图8为1249_NLS_TadA_8e_linker中TadA_8e在K110(A)和R111(B)饱和突变后在[0113]图9为1249_NLS_TadA_8e_linker中TadA_8e在N108位点饱和突变后在sgRNA_S1位[0114]图10为1249_NLS_TadA_8e_linker中TadA_8e引入V28G_X(a)和V28W_X(b)双点突V28G_X表示在第28位氨基酸由缬氨酸突变为甘氨酸的基础上其它氨基酸位点还存在突变[0122]图14为1249_NLS_TadA_8e_linker中TadA_8e引入N108Y_X(a)、N108H_X(b)和[0124]图15为1249_NLS_TadA_8e_linker中TadA_8e引入N108M_X(a)、N108C_X(b)、[0127]图17为1249_NLS_TadA_8e_linker中TadA_8e引入各类三点突变后在sgRNA_S1位力仍不弱于野生型1249_NLS_TadA_8e_li[0128]图18为1249_NLS_TadA_8e_linker中TadA_8e引入V28G_X_Y(A)和A48G_X_Y(B)三所述V28G_X_Y表示在第28位氨基酸由缬氨酸突变为甘氨酸的基础上其它两处氨基酸位点[0130]图19为1249_NLS_TadA_8e_linker中TadA_8e引入I49A_X_Y(A)和I49G_X_Y(B)三[0132]图20为1249_NLS_TadA_8e_linker中TadA_8e引入V82G_X_Y(A)和V82T_X_Y(B)三[0134]图21为1249_NLS_TadA_8e_linker中TadA_8e引入N108H_X_Y(A)和N108Y_X_Y(B)[0136]图22为1249_NLS_TadA_8e_linker中TadA_8e引入V28G_X_Y_Z(A)和A48G_X_Y_Z[0139]图23为1249_NLS_TadA_8e_linker中TadA_8e引入I49A_X_Y_Z(A)和I49G_X_Y_Z[0141]图24为1249_NLS_TadA_8e_linker中TadA_8e引入V82G_X_Y_Z(A)和V82T_X_Y_Z[0143]图25为1249_NLS_TadA_8e_linker中TadA_8e引入N108H_X_Y_Z(A)和N108Y_X_Y_ZU(B)、N108H_X_Y_Z_U(C)和N108Y_X_Y_Z_U(D)四点突变后在sgRNA_S1位点处介导A·T__[0150]图28为1249_NLS_TadA_8e_linker中TadA_8e引入各类四点和五点突变后在[0151]图29为不同类型的碱基编辑器在RNA水平和DNA水平(非Cas依赖型)的脱靶效应示1400位为nucleoplasminNLS序列)的N_末端、C末端(C末端有额外的link序列(SEQIDABE工具表达载体ABE_Internal_8e(通过2A_EGFP元件同时表达EGFP)。为评估ABE_尿嘧啶糖基化酶抑制因子UGI和2A_mCherry)共转染至培养的293T细胞。细胞培养72小时定程度上拓展编辑窗口(图1_2)。此外，结果显示，在nSpCas9第1249位融合位点构建的中任一个进行饱和突变(图3b)，分析不同点突变对1249_NLS_[0183]收集的细胞抽提基因组，使用可特异性扩增sgRNA_S1位点信息的引物进行定向PCR。PCR产物通过sanger测序验证1249_NLS_TadA_8e_linker各突变体的碱基编辑活性改[0186](2)根据1249_NLS_TadA_8e_linker对S1位点中各碱基的编辑情况可知，其对A3、A5、A7、A8和A9的编辑效率最高且各位点效率接近，因此选取A5作为1249_NLS_TadA_8e_(C4/A5)，以及C6突变效率与A5突变效率的比值变化(C6/A5)可反映1249_NLS_TadA_8e_linker对胞嘧啶(C)和腺嘌呤(A)两种碱基偏好性的改变。C4/A5的相对效率＝(点突变组效率>1表明突变型1249_NLS_TadA_8e_linker对胞嘧啶(C)的编辑能力和偏突变对1249_NLS_TadA_8e_linker功能的影响可参见图4_图8。编辑特异性和精确度,活性窗口主要位于A5，N108R能明显提高1249_NLS_TadA_8e_linker可显著抑制1249_NLS_TadA_8e_linker介导C·G__T·A突变的能力(<10％的编辑效率)。双点突变组合对1249_NLS_TadA_8e_linker碱基编辑活性对效率>单点突变相对效率时表明，与单点突变相比，双点突变后1249_NLS_TadA_8e_N108M、F84M_N108Q双点突变能进一步增强1249_NLS_TadA_8e_linker对胞嘧啶(C)的编辑NLS_TadA_8e_linker，分析不同三点突变组合对1249_NLS_TadA_8e_linker的碱基编辑活NLS_TadA_8e_linker的四点突变表达载体，分析不同四点突变组合对1249_NLS_TadA_8e_V82T_N108H、A48G_I49G_V82G_N108H四点突变能进一步增强1249_NLS_TadA_8e_linker介1249_NLS_TadA_8e_linker的五点突变表达载体，分析不同五点突变组合对1249_NLS_TadA_8e_linker的碱基编辑活性[0226](2)多点突变后，C4/A5的相对效率＝(多点突变组C4/A5)/(无点突变组C4/A5)，V82T/G和N108H/Y的各类四点突变和五点突变组合)均可显著抑制1249_NLS_TadA_8e_linker(N46P)、1249_NLS_TadA_8e_linker(N108Y)、、1249_NLS_TadA_8e_linker(V28G_1249_NLS_ecTadA(VN)_linker以分析其在RNA水平的脱靶效应。其中1249_NLS_TadA_8e_同时表达EGFP)与单向导RNA(sgRNA)(sgRNA同时表达尿嘧啶糖基化酶抑制因子UGI和2A_[0233]我们首先对A_I编辑结果进行分析，发现TadA_8e*点突变可显著降低1249_NLS_碱基编辑器中，1249_NLS_B5ZCW4(VN)_linker和1249_NLS_B3PCY2(VN)_linker在RNA水平的脱靶效应与本底及阴性对照相似，1249_NLS_Q13XZ4(VN)_linker、1249_NLS_ecTadA脱靶效应比本底及阴性对照略高，但明显低于1249_NLS_TadA_8e_linker。1249_NLS_Q99W51(VN)_linker在RNA水平的脱靶效应明显高于1249_NLS_TadA_8TadA_8e_linker(N108Y)、1249_NLS_TadA_8e_linker(V28G_N46L)、1249_NLS_TadA_8e_(N46C_N108Y)、1249_NLS_TadA_8e_linker(N46P_N108S)、1249_NLS_TadA_8e_linker1249_NLS_B3PCY2(VN)_linker、1249_NLS_B5ZCW4(VN)_linker、1249_NLS_E8WVH3(VN)_[0238]DNA水平的脱靶效应(非Cas依赖型脱靶效应)通过R_Loop实验进行分析[8]。其基本原理是，dSaCas9与靶向基因组特定位点(位点X)的sasgRNA(sasgRNA_X)在细胞中共表体共转染碱基编辑器的各优选表达载体(通过2A_EGFP元(dSaCas9)_sasgRNA共表达载体(同时表达红色荧光蛋白)，培养72小时后胰酶消化收取细的A_G和C_T突变频率。研究中共选取四种不同的sasgRNA脱靶位点(sasgRNA_1～6)用于在位点处的碱基编辑效率均<8％(该编辑效DNA水平的脱靶效应(非Cas依赖型脱靶效应)很低。而与1249_NLS_TadA_1249_NLS_TadA_8e_linker(V28G_N46L)、1249_NLS_TadA_8e_linker(V28G_N46P)、1249_NLS_TadA_8e_linker(V28G_N46C)、1249_NLS_TadA_8e_linker(N46C_N108Y)、1249_NLS_1249_NLS_B5ZCW4(VN)_linker、1249_NLS_E8WVH3(VN)_linker、1249_NLS_Q57LE3(VN)_[0241]C_T突变效率分析显示，除V28G_N46C在sasgRNA_6位点处[0242]DNA脱靶效应分析结果表明，点突变和新的TadA脱氨基酶构建的碱基编辑器在非linker(N46P)、1249_NLS_TadA_8e_linker(N108Y)、1249_NLS_TadA_8e_linker(V28G_[0245]为系统分析碱基编辑器的活性窗口和碱基偏好性，选择12种sgRNA(S18序列：ACACACACACTTAGAATCTG；HEK4序列：GGCACTGCGGCTGGAGGTGG；ZSCAN2序列：GTGCGGCAAGAGCTTCAGCC；AAVS1序列：GACCCTCAGCCGTGCTGCTC；FAN3序列：CGCCGTCTCCAAGGTGAAAG；EMX序列：GAGTCCGAGCAGAAGAAGAA；MSKC序列：CGTCGCCGATCTTCACAGGG；PT14序列：TCCAAACCCATATATACAGC；RNF序列：GTCATCTTAGTCATTACCTG；S1序列：GAACACAAAGCATAGACTGC；sgB序列：[0246]收集好的细胞抽提基因组，使用可特异性扩增目标sgRNA位点信息的引物进行定32c)，其对不同碱基位点的偏好性为TC≈CC≈AC>GC(图32d)。1249_NLS位点的偏好性为CA≈CT>CC≈CG，AC≈TC>CC≈GC(图33b)。1249_NLS_TadA_8e_linker(N46P_N108S)的CBE活性显著高于ABE活性，ABE活性窗口为A5，CBE活性窗口为C4_C9(图位点的偏好性为CT≈CA≈CC>CG，TC≈AC>CC≈GC(图34b)。1249_NLS_TadA_8e_linker[0251]TadA同源蛋白来源的碱基编辑器而言，1249_NLS_Q13XZ4(VN)_linker的CBE活性[0252]上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发