CN119432910A 用于疫苗制备的重组质粒及其制备方法和dna启动的减毒活手足口病疫苗 （中国人民解放军军事科学院军事医学研究院）

用于疫苗制备的重组质粒及其制备方法和疫苗制备的重组质粒及其制备方法和DNA启动的真核启动子以及任选的能够提高所述重组质粒71型基因组序列。该重组质粒具有遗传稳定性和免疫保护效果，具有制备DNA启动的减毒活手2所述插入元件选自真核启动子以及任选的能够提高所述重组质粒表达所述病毒基因组序列选自肠道病毒71型基因组序列。和/或，所述能够提高所述重组质粒表达的元件选自HDVr、SV40polyA尾巴和BGH质粒表达的元件位于所述嵌合病毒基因组序达的元件为HDVr以及SV40polyA尾巴和/或BGHpolyA尾巴时，所述SV40polyA尾巴和/或5.一种制备重组质粒的方法，其特征在于，所所述插入元件选自真核启动子以及任选的能够提高所述重组质粒表达所述病毒基因组序列选自肠道病毒71型基因组序列。和/或，所述能够提高所述重组质粒表达的元件选自HDVr、SV40polyA尾巴和BGH37.根据权利要求5或6所述的方法，其中，表达的元件为HDVr以及SV40polyA尾巴和/或BGHpolyA尾巴时，所述SV40polyA尾巴和/4[0003]手足口病是由人类肠道病毒(Enterovirus)感染引起的一种自限性疾病，主要病[0005]本发明的目的是为了克服现有手足口病疫苗诱导产生的5[0015]本发明第四方面提供一种DNA启动的减毒活手足口病疫苗，所述疫苗含有如前所前尚无针对肠道病毒71型等手足口病病原体的[0025]图9为实施例4中重组质粒I免疫小鼠后，接种部位肌肉研磨上清感染RD细胞间接式)以及特定的插入元件按照一定顺序插入表达载体中，能够获得在体内启动转录、产生(减毒)活病毒的重组质粒。该重组质粒能够用于使用DNA免疫在体内启动减毒活疫苗的研[0033]本发明第一方面提供一种用于疫苗制备的重组质粒，所述重组质粒包括表达载6[0037]采用上述重组质粒制备的DNA启动的减活毒疫苗通过接种携带(全长)EV71基因组[0041]任意现有的肠道病毒71型毒株的基因组序列(cDNA)均可用于本发明提供的重组高所述重组质粒表达的元件位于所述嵌合病毒基因组序粒表达的元件为HDVr以及SV40polyA尾巴和/或BGHpolyA尾巴时，所述SV40polyA尾巴和/或BGHpolyA尾巴位于HDVr78[0074]本发明第四方面提供一种DNA启动的减毒活手足口病疫苗，所述疫苗含有如前项[0081]重组质粒I：DNA启动的pDL_EV71_CMV重组质粒选用真核表达载体pVax1(购自子CMV(SEQIDNO：3)，在该病毒基因组后依次插入HDVr(SEQIDNO：4)和BGHpA(即BGH[0083]上述重组质粒中采用的EV71病毒全长感染性cDNA克隆的病毒基因组序列为基于950_1711位核苷酸为衣壳蛋白VP2的编码基因，第1712_2437位核苷酸为衣壳蛋白VP3的编苷酸为非结构蛋白2C的编码基因，第5063_5320位核苷酸为非结构蛋白3A的编码基因，第编码基因，第5936_7321位核苷酸为非结构蛋白3D的编码基因，第7322_7430位核苷酸为3’UTR。EV71病毒AH/08/06株为北京军事医学科学院微生物与流行病学研究病毒实验室2008[0084]重组质粒I的制备和重组质粒II的制备委托苏州艾棣维欣生物制药有限公司完9[0087]采用LipofectamineTM3000试剂盒(购自Invitrogen公司)将实施例1中得到的重[0093]采用EV71病毒单克隆抗体(购自Fitzgerald公司)通过间接免疫荧光的方法对转上述方法制备获得的抗原片在37℃孵育2h。孵育结束后用PBS缓冲液振荡洗涤3次，每次500rpm振荡5min。在洗涤后的抗原片上加入用PBS缓冲液按体积比1∶200稀释的Alexa后将抗原片放入PBS缓冲液振荡洗涤3次，每次500rpm振荡5min。将DAPI稀释为终浓度为和10_7养上清，在每个孔中加入琼脂盖(即含2重量％FBS和℃、5％CO2条件下培养3_4d，然后用4％甲醛室温固定1h，弃琼脂盖，用结晶紫室温染色[0101]按照2μg/只的剂量分别采用实施例1获得的重组质粒I和重组质粒II免疫5周龄的[0110]4.检测步骤2中收集的感染后48h培养上清中的病毒滴度(方法同实施例2中的实37℃孵育30min。300μL/孔PBST重复洗板5次。加入TMB显色液100μL/孔，37℃避光孵育[0119]小鼠免疫后14和28天血清中的IgG抗体检测结果见图12。当EV71病毒免疫组血清剂量的重组质粒1分别免疫5周龄的BALB/c雌性小鼠14和28天后均可有效诱导小鼠产生针320倍稀释的稀释液；将稀释液分别与HEV71病毒株(购自ATCC)等体积混合(混合液中含约HEV71病毒株(购自ATCC)通过颅内注射的方式接种一日龄乳鼠，每只20μL(包含107PFU的剂量的重组质粒I免疫BALB/c雌性小鼠，可以100％保护乳鼠免受致死剂量的EV71病毒攻[0124]采用相同的方法测试重组质粒II的免疫原性和免疫保护效果，获得与重组质粒I[0128]TTAAAACAGCCTGTGGGTTGCACCCACTCACAGGGCCCACTGGGCGCAAGCACTCTGGTACCTCGGTACCTTTGTGCGCCTGTTTTACACCCCCCCCCCAGTGAAACTTAGAAGCAGCAAACCACGATCAATAGCGGGCATAACGCTCCAGTTATGTCTTGATCAAGCACTTCTGTTTCCCCGGACTGAGTATCAATAGACTGCTCGCGCGGTTGAAGGAGAAAACGTTCGTTATCCGGCTAGCTACTTCGGGAAACCTAGTAACACCATGAAAGTTGCGGAGAGCTTCGCTCAGCACTCCCCCAGTGTAGATCAGGTCGATGAGTCACCGCATTCCCCACGGGCGACCGTGGCGGTGGCTGCGTTGGCGGCCTGCCCATGGGGTAACCCATGGGGCGCTCTAATACGGACATGGTGTGAAGAGTCTACTGAGCTAGTTAGTAGTCCTCCGGCCCCTGAATGCGGCTAATCCCAACTGCGGAGCACACGCCCACAAGCCAGCGGGTAGTGTGTCGTAACGGGTAACTCTGCAGCGGAACCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTTCTTTTTATCTTTATACTGGCTGCTTATGGTGACAATTAAAGAATTGTTACCATATAGCTATTGGATTGGCCATCCGGTGTGCAACAGAGCAATTGTTTACCTATTCATTGGTTTCGTACCATTAACCTTGAAGTCTGTGACCACCCTTAATTATATCTTGACCCTTAACACGGCTAAACATGGGTTCGCAAGTGTCTACACAACGCTCCGGCTCTCACGAAAACTCAAACTCAGCCACTGAGGGTTCCACCATAAACTACACCACCATTAATTACTACAAAGACTCCTATGCTGCCACAGCAGGCAAACAGAGTCTCAAGCAGGATCCAGACAAGTTTGCAAATCCTGTTAAAGACATCTTCACTGAAATGGCAGCGCCACTGAAGTCCCCATCCGCTGAGGCATGTGGATACAGTGATCGAGTGGCGCAATTAACTATTGGCAACTCCACCATCACCACGCAAGAAGCAGCTAACATTATAGTTGGTTATGGTGAGTGGCCTTCCTACTGCTCGGATTCTGACGCTACAGCAGTGGATAAGCCAACTCGCCCGGATGTTTCAGTGAACAGGTTtTACACAtTgGACACTAAATTGTGGGAGAAATCGTCCAAGGGATGGTACTGGAAGTTCCCGGATGTGTTAACTGAAACTGGGGTTTTTGGGCAAAATGCACAGTTCCATTACCTCTACCGATCAGGGTTCTGTATTCACGTGCAGTGCAATGCTAGTAAATTCCACCAAGGAGCACTCCTAGTCGCTGTCCTACCAGAGTATGTCATTGGGACAGTGGCAGGCGGTACAGGGACGGAAGATAGTCACCCCCCTTACAAGCAGACTCAACCCGGCGCCGATGGCTTCGAGTTGCAACACCCGTACGTGCTTGATGCTGGCATCCCAATATCACAGTTAACAGTGTGCCCACACCAATGGATTAATTTGAGGACCAACAATTGTGCTACAATAATAGTGCCATACATTAACGCACTGCCTTTTGACTCTGCCTTGAACCATTGCAACTTTGGCCTGTTAGTTGTGCCTATTAGCCCACTAGACTACGACCAAGGAGCGACGCCAGTAATCCCTATAACTATCACATTGGCCCCAATGTGTTCTGAATTCGCAGGTCTTAGGCAGGCAGTCACGCAAGGGTTTCCCACTGAGCTGAAACCTGGCACAAATCAATTTTTAACCACTGATGATGGCGTTTCAGCACCTATTCTACCAAACTTCCACCCCACCCCGTGTATCCACATACCTGGTGAAGTTAGGAACTTGCTAGAGTTATGCCAGGTGGAGACCATTCTGGAGGTTAACAATGTGCCCACGAATGCCACTAGCTTAATGGAGAGACTGCGCTTCCCGGTCTCAGCACAAGCAGGGAAAGGTGAGCTGTGTGCGGTGTTCAGAGCCGATCCTGGGCGAAGTGGACCGTGGCAATCCACCTTGCTGGGTCAGTTGTGCGGGTACTACACCCAATGGTCAGGATCATTAGAAGTCACCTTCATGTTTACTGGGTCCTTCATGGCTACCGGCAAGATGCTCATAGCCTATACACCGCCAGGAGGCCCTTTGCCCAAGGACCGGGCAACCGCCATGTTGGGCACGCACGTTATCTGGGATTtTgGGCTGCaATCGTCTGTTACCCTTGTAATACCATGGATCAGCAACACTCATTATAGAGCGCATGCCCGAGATGGAGTGTTTGACTACTACACCACAGGGTTAGTCAGTATATGGTATCAGACAAATTACGTGGTTCCAATTGGGGCGCCCAATACAGCCTATATAATAGCACTAGCGGCAGCCCAAAAGAACTTCACTATGAAATTGTGCAAGGATGCTAGTGATATCCTGCAGACGGGCACCATCCAGGGAGATAGGGTGGCAGATGTAATTGAAAGTTCCATAGGAGATAGCGTGAGTAGAGCCCTCACTCACGCTCTACCAGCACCCACAGGCCAGAACACACAGGTGAGCAGTCATCGACTGGATACAGGCAAGGTTCCAGCACTCCAAGCTGCTGAAATTGGAGCATCATCAAATGCTAGTGACGAGAGCATGATTGAGACACGCTGTGTTCTTAACTCGCACAGCACAGCTGAGACCACTCTTGATAGTTTCTTCAGCAGAGCGGGATTAGTTGGAGAGATAGATCTCCCTCTTAAAGGCACAACTAACCCAAATGGTTATGCCAACTGGGACATAGATATAACAGGTTACGCACAAATGCGTAGAAAGGTAGAGCTATTCACCTACATGCGCTTTGATGCAGAGTTCACTTTTGTCGCGTGCACACCCACCGGGGAAGTTGTCCCACA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