微生物菌种保藏课件

微生物菌种保藏技术菌种是进行微生物学研究和应用的基本材料，是发展生物工程的重要基础条件之一，是国家的重要生物资源。微生物个体微小，代谢活跃，生长繁殖快，如果保存不妥容易发生变异，或被其他微生物污染，甚至导致微生物死亡，这种现象屡见不鲜。菌种的长期保藏对任何微生物学工作者都是很重要的，而且也是非常必要的。菌种保藏要求各保藏管理中心所保藏的菌种，必须具有该菌种的详细历史及有关实验资料。并对其所负责保藏的菌种均应采取妥善、可靠的方法保藏，避免菌种的污染或死亡。微生物菌种保藏基本原理是在挑选优良纯培养物并使新陈代谢处于最低或几乎停止的状态，即使其处于休眠状态基础上，人为地创造一个有利于休眠的环境，使其长期保存后仍能保持菌种原有的优良特性。基本措施是低温、真空、干燥。常用保藏方法定期移植法液体石蜡法真空冷冻干燥法

-80℃低温冻结法液氮超低温冻结法（一）定期移植法亦称传代培养保藏法，指将菌种接种于适宜的斜面培养基上，最适条件下培养，待得到健壮的菌体后，于4～6℃进行保存并间隔一定时间（3-6个月）进行移植培养的一种短期菌种保藏方法。操作步骤：

斜面制备接种培养保藏斜面制备培养基配制分装灭菌摆放斜面接种培养：细菌37℃，1-2d酵母28~30℃，2~3d丝状真菌26℃，5~7d保藏：4~6℃，保藏3~6个月。方法总结操作简单，使用方便；对设备和人员要求不高；可随时使用，便于观察菌种；工作劳动强度大，属短期保藏，保藏成本高；菌种传代频繁，易退化、污染。（二)液体石蜡法亦称矿物油保藏法，定期移植保藏法的辅助方法。指将菌种接种在适宜的斜面培养基上，最适条件下培养至待得到健壮的菌体后注入灭菌的液体石蜡，使其覆盖整个斜面，再直立放置于低温（4～6℃）干燥处进行保存的一种菌种保藏方法。操作步骤：液体石蜡预处理斜面培养物制备灌注石蜡保藏优质化学纯液体石蜡灭菌：121℃湿热灭菌30min，蒸发水分；160℃干热灭菌2h；冷却至室温。液面高出斜面顶部1cm4～6℃，干燥处；直立放置；保藏时间1～2年。方法总结操作简单，使用比较方便；对设备要求不高，对人员操作水平有一定要求；工作劳动强度大，保藏成本较高；菌种易退化、污染。(三)真空冷冻干燥法指将保藏的菌种细胞或孢子悬浮于保护剂中，经预冻后在真空条件下使水分升华，再经真空封存后保存的一种长期菌种保存方法。安瓿管，又叫安瓿瓶，简称安瓿，指装注射剂用的密封的小玻璃瓶，用药时将瓶颈的上端弄破。1、安瓿管的准备

清洗

选用中性玻璃材质的安瓿管；2%盐酸浸泡8～10h，自来水冲洗至中性，蒸馏水冲洗2～3次；

置于烘箱中烘干。棉塞打棉塞，160℃定型2h；标签

激光打印标签，标明菌株编号和保藏日期，大小约10×20mm。

喷码于安瓿管外，160℃固定20min。灭菌同一菌种安瓿管包在一起，121℃湿热灭菌30min.2、保护剂的准备保护剂：12%脱脂牛奶蒸馏水溶液，2～5ml/管；灭菌锅加热至沸腾，将牛奶管放入锅中，113℃灭菌20min；打开放气阀缓慢排出蒸汽，取出灭菌后脱脂牛奶试管，迅速放入凉水中冷却；30℃培养2天，无菌检查合格后备用。3、冻干样品制备制备斜面培养物；将保护剂用无菌吸管注入到斜面培养物上，用吸管刮取斜面上的菌体，使菌体均匀地悬浮在保护剂内。用长毛细滴管将菌悬液分装到安瓿管内，0.1～0.2ml/管，操作时要把带有菌悬液的长毛细滴管直接插入安瓿管的底部，勿使菌液沾在管壁上。4、预冻制备菌悬液、经分装到进行预冻之间的时间不宜超过1h；分装完成后将安瓿管立刻放入－35～－40℃冰箱预冻1h，使菌液完全冻结；可采用分段式预冻，先将分装好的安瓿管置－20℃冻30分钟，再放入－80℃冰箱冻30min；采用离心式冻干装置时勿需预冻。5、真空干燥在开动真空泵后应使真空度在15min内达到66.5Pa，随后逐渐达到26.6～13.3Pa，在此条件下，样品将保持冻结状态，其中水分则不断升华，干燥才能顺利地进行。终止干燥时间应根据下列情况判断：安瓿管内冻干物呈酥块状或松散片状真空度接近空载时的最高值样品温度与管外温度接近选用1～2支对照管，其水份与菌悬液同量，当其水分完全蒸发时视为干燥完结

6、熔封将安瓿管的中上部用火焰烧软，拉成细颈；将安瓿管装到多歧管上，开启真空泵，当真空度达到1.33Pa时，用火焰在细颈处熔封，严格的密封会使安瓿管上产生一个小窝；拉管时注意火焰不要离菌体太近，以免影响菌体的活力。7、真空度检测

用高频电火花检查各安瓿管的真空情况，如管内呈现灰蓝色光，说明真空度符合要求。检查时高频电火花应射向安瓿管的上半部，切勿直接射向样品，以免影响其中的菌种。8、保藏4～6℃下避光保藏，一般可保藏8～10年。方法总结

保藏、运输方便；保藏时间长(5～10年)；对设备要求高(真空冷冻干燥机、多歧管),对人员操作水平要求高；冷冻干燥过程对菌体有损伤，需恢复培养。(四）－80℃冰箱冻结法将菌种悬浮于保护剂中，在－80℃冰箱中冻结保存的一种长期菌种保藏方法。准备冷冻

管准备保护剂（10%-15%甘油)准备菌悬液（细胞、孢子或芽孢悬液）制备冷冻管（取菌悬液和保护剂至冷冻管）保藏（-80℃，2～5年）方法总结

使用比较方便；保藏时间较长；对设备要求高(-80℃冰箱)；运输不方便。（五）液氮超低温冻结法

指悬浮于保护剂中的菌种经程控降温后，移置于－196℃的液氮或－150℃左右的液氮气相中保存的一种长期菌种保藏方法。操作步骤冷冻管准备保护剂制备同“－80℃冰箱冻结法”保藏培养物准备预冻---将程序降温系统预冷到4℃，将制备好的冷冻管放入其中，以1℃/min降温速率降至-35℃；

---使用程序降温盒。保藏将预冻后的冷冻管转移至液氮气相(-150℃)或液相(-196℃)。方法总结保藏时间长；保藏效果好，菌种不易退化；对设备要求高(程控降温仪、液氮罐)，对人员操作水平要求高；保藏成本高。不同保藏方法的比较菌种保藏技术进展程序降温控制技术原位低温保藏技术有些菌种不可培养，也无法采用标准的冷冻干燥技术保藏，如一些致病菌、无法培养的菌种或者与其他微生物共生的菌种（如菌根真菌）等。这些菌种可采用原位低温保藏技术，这一技术已经被应用在一些锈菌种的保藏过程中。包埋固定化技术是在藻酸钙颗粒或其他基质中进行的。含有藻酸钠的菌悬浮液加入氯化钙后会形成藻酸钙固定化细胞，细胞一旦固定