RAPD扩增结果与聚类分析

绪论1.1背景梅片树[Dryobalanopsaromatic]，樟科樟属，主要分布在我国云南、广东、广西、福建等地区。天然右旋龙脑原产地在印尼苏门答腊岛，在国内属于稀缺资源，长期以来，我国一直依靠进口天然右旋龙脑来满足国内需求。虽然我国龙脑使用历史长达2000多年，但由于长期依赖进口，受龙脑资源短缺枯竭的影响，天然冰片在上世纪七十年代国内已难寻其影，市场地位逐渐被合成冰片取代。但就在20世纪80年代，中国科学家在梅州发现了一种富含天然右旋龙脑的阴香树——梅片树，梅片树中含有高纯度的右旋龙脑，纯度可达99%，且几乎不含樟脑。梅片树的发现大大的填补了我国生产右旋龙脑的空白。苏健裕等【1】利用水蒸气蒸馏法提取梅片树枝叶中的挥发油，并使用气相色谱-质谱联用技术和峰面积归一化法分离分析挥发油中化学成分和相对含量。研究结果发现挥发油的主要成分有右旋龙脑(78.6%)、乙酸龙脑酯(3.26%)、斯巴醇(2.60%)和桉叶油素(1.92%)，表明梅片树枝叶中含有大量的右旋龙脑，梅片树具有较高的应用前景。梅片树适宜生长在20℃~25℃湿润的温暖气候，土壤深厚、疏松肥沃的种植环境。广东省梅州市属于亚热带季风气候区，全年气温略高，高温天数较多，光照充足且雨水丰盈集中。梅州市的气候适宜梅片树生长和积累活性成分，广东华清园生物技术有限公司在梅州种植8600亩梅片树。在栽种过程中人们发现不同的株系之间天然右旋龙脑含量存在较大差异。有的梅片树叶片可提取的右旋龙脑含量极低，因此选择右旋龙脑含量高的株系作为母系培育尤为重要。陈新强等【2】通过对梅州，惠州等地2000多株的梅片树进行挥发油成分分析和右旋龙脑含量计算筛选出高含量的梅片树株系，在通过无性嫁接技术进行繁殖研究其性状的稳定性，研究结果表明通过无性嫁接等技术可以将含有高纯度的右旋龙脑稳定的传给子代。虽然梅片树的应用价值巨大，但是只有筛选出具有高含量的有效成分的梅片树优良品系才能将梅片树的价值发挥出来，达到生产利益最大化。梅片树中富含天然右旋龙脑，通常使用植物提取法从富含龙脑的植物中提取挥发油，在进行分离。张伟等【3】利用超声水蒸气蒸馏法，设置一组不加入超声条件的对照组，从梅片树叶片中提取挥发油，并通过气相色谱法测定挥发油中右旋龙脑的含量。通过对照试验发现利用水蒸气蒸馏法提取挥发油时，加入超声条件后挥发油提取率提高。JIC等【4】发明一种利用真空蒸馏和、升华和重结晶来提取天然右旋龙脑的方法，提取原材料为老叶片和老树枝，能够有效的提高右旋龙脑的工业提取率，实现节能减排。1.2天然右旋龙脑1.2.1右旋龙脑概述龙脑（Borneol）是一种单萜醇，化学式C10H18O，分子量为154.25，沸点213℃，熔点208℃，是一种无色透明或白色半透明的片状松脆结晶，味辛、凉，有清香气。在古籍中记载【5】龙脑具有开窍醒神，清热止痛，治疗溃疡，目赤翳障等功效作用。许多中药产品中都含有龙脑，如含化龙脑丸、安脑牛黄片等。龙脑按来源不同可分为合成龙脑和天然龙脑。合成龙脑主要含有龙脑和异龙脑，与天然龙脑相比有效成分相差甚远，合成龙脑中龙脑的含量仅为55%以上。从而使得合成龙脑在功效上与天然龙脑也相差较远；且合成龙脑中异龙脑的含量很高，接近25%，而异龙脑对人体有很强的副作用，容易引起过敏等反应。将龙脑按旋光度可分为左旋龙脑（艾片）和右旋龙脑（天然冰片）。左旋龙脑主要来源是从菊科植物艾纳香的叶提取，左旋龙脑中龙脑含量不低于85%，异龙脑不高于5%；右旋龙脑主要来源于樟科植物龙脑樟枝叶经蒸馏重结晶而得到，右旋龙脑中龙脑含量高于96%，异龙脑含量几乎为零。由于右旋龙脑中异龙脑含量几乎没有，而异龙脑又是龙脑药品中对人体有副作用的主要毒害成分，所以随着人们的健康意识提升，越来越多的产品用右旋龙脑取代合成龙脑，右旋龙脑将逐渐成为龙脑市场的主体。1.2.2右旋龙脑的应用右旋龙脑具有巨大的应用市场，广泛应用于保健品、化妆品、日用品、香料、食品等领域。在医药方面对中枢神经系统有双向调节和保护作用，方永奇等【6】概括了醒脑开窍中药的共同特性。冰片是常用的开窍药，具有吸收快、分布快且广、代谢迅速的特点。能快速通过血脑屏障（BBB），在中枢神经系统（CNS）组织中药物累计时间长且蓄积药物量高。冰片诱导BBB生理性开放，对病理状态的脑组织有保护作用，有利于恢复。冰片还可以促进其他药物通过BBB进入脑内，增加脑内这些药物的浓度，低用药剂量达到有效药物浓度，在保证药效的同时也能降低药物的毒副作用。右旋龙脑还具有对抗循环系统缺血与损伤的功效。夏鑫华等【7】研究麝香冰片组对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠的脑保护作用，通过以脑梗死体积、神经功能行为、脑内含水量及透出脑血管外的伊文思蓝含量为检测指标，通过观察麝香组和麝香冰片组的对照，明显发现麝香冰片组，脑含水量和伊文思蓝含量明显降低，说明冰片对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠有脑保护作用。右旋龙脑还具有抗菌、抗炎、镇痛及促进创伤愈合的作用，在临床上常用于烧伤烫伤的治疗。蔡瑞宏等【8】研究芦荟冰片烧伤膏对小鼠耳廓肿胀镇痛及愈合效果。实验通过芦荟冰片烧伤膏与磺胺嘧啶对照，研究发现在上药5天后及在给药13天后，芦荟冰片烧伤膏对小鼠创面愈合效果明显高于磺胺嘧啶，实验结果表明芦荟冰片烧伤膏在治疗烧伤烫伤中具有良好的生肌、镇痛和抗炎作用。因为龙脑具有较强的肌肤通透性和抗菌抗炎等效果，在日化行业中有广泛应用如美容护肤产品中的面膜、面霜、精华液等很多都会加入冰片的成分。谢凤瑛【9】概括了天然冰片在日化护肤产品中的应用及药理作用。天然冰片作为护肤产品历史悠久，远在光绪三十年间，清代慈禧太后常用的美容秘方中就有用到冰片。在现代，天然冰片常用于治疗损美性疾病。损美性疾病是指指有损人的形象美的疾病，从神、色、形，味、声音几方面或其中某一方面影响人的形象美，如皮肤类疾病的斑、腋臭、疮瘆、廯等都属于损美性疾病。因为龙脑具有较强的肌肤通透性，能够引导药物通过肌肤屏障，消除皮肤类的多余色素沉积，到达祛斑效果，是祛斑治疗的首选。青春期男女皮脂分泌过多呈慢性炎性就会形成粉刺，天然冰片具有抗菌消毒的效果，又能促进药物吸收，有研究发现冰片的促透皮作用主要发生在角质层，改变了脂质分子的排列和增加了其流动性。针对粉刺这类皮脂分泌过甚的损美性疾病，常用天然冰片来改善脂质代谢以到达治疗目的。对于一些顽固的皮肤科疾病如藓、神经性皮炎等，天然冰片具有去腐生肌的效果常常会添加到治疗配方中。总的来说，天然龙脑在日化护肤品中的广泛应用归咎于天然龙脑所具有的抗菌抗炎镇痛作用、透皮促进药物吸收作用以及促进伤口愈合作用。因此天然冰片经常作为重要的配方加入到护肤产品中。右旋龙脑在香料产业中的也有应用，特别是香水制造业。“四大名香”包括龙脑香、檀香、沉香、麝香。而龙脑香不仅是“四大名香”之首，还是密宗的“五香”之一。自古就有用龙脑作为香薰料的材料，词人李清照的《醉花阴》【10】中写道“薄雾浓云愁永昼，瑞脑销金兽。”描述的是重阳节焚香的场景，其中的瑞脑指的就是龙脑香。古时常用龙脑作为熏香，并将龙脑加入到徽墨中，使其散发出独特的香味。在现代香料制造业中，常常在香水中加入龙脑作为后调香，或在车载香水中加入龙脑香提神和除去车内异味，更有在家用藤香中添加龙脑香作为熏香。在食品工业上，现代工艺中会将龙脑作为清凉剂或者食用香精，龙脑可按照标准生产成为食品级的龙脑作为食用香精。龙脑在食品工业上的应用可追溯到唐朝，当时百姓就用龙脑制作出一种叫“清风饭”的食品。据《清异录·馔羞》【11】记载“宝历元年，内出清风饭制度，赐御庖，令造进。法用水晶饭、龙睛粉、龙脑末、牛酪浆，调事毕，入金提缸，垂下冰池，待其冷透供进，惟大暑方作。”其中龙脑末指的就是龙脑。现代人将冰片作为食品添加剂加入到食物中，如龙脑牛肉，将营养价值较高的牛肉与药用价值极佳的冰片结合，为人们提供一种带有龙脑清新香气又结合了牛肉风味的食物，营养极易吸收，又兼有龙脑抑菌抗炎的药效。1.3选题意义和研究方法1.3.1选题意义梅片树具有较高的市场价值，但对于梅片树的选育，在形态特征上难以区分不同株系的梅片树中挥发油成分的差异，单纯靠闻叶片气味分类结果不准确，而用细胞学标记和生物化学标记的方法鉴定也容易受环境条件和不同梅片树生长情况的影响导致结果的不准确。梅片树的右旋龙脑含量根据梅片树的生长发育阶段不断累积，在不同的生长阶段，挥发油含量和成分均有改变，难以准确的判断哪一株系是含有大量右旋龙脑的优良株系。而且生物化学标记检测需要耗费大量的时间和金钱，并不适合生产应用。而与之相比分子标记技术能直接从遗传DNA水平上检测，不受其他遗传标记方法所受的限制影响。通过少量的DNA模板就能分析出梅片树之间的遗传关系，从而达到筛选出优良的母系进行扩大繁殖。1.3.2研究方法1.3.2.1遗传标记遗传标记（GeneticMarker）是指具有可遗传性和可识别性的某一遗传特性，能够反映出生物体或群体的特征。遗传标记包括形态学标记、细胞学标记、生物化学标记、分子标记四大类。形态学标记是指利用肉眼可见的外部特征如外形，颜色等，以生态地理分布、生理性状及形态性状等待征为遗传标记。具有直观、快速的优点。形态学标记需要进行严谨的生物学统计，常受环境，物种数量的影响。在传统林木品种鉴定中就是根据植株的种子、植株外部形态等进行鉴定，但由于有些植株在发育阶段形态特征不明显，需等到植株发育成熟才能进行鉴定，导致鉴定时间过长。而且随着市场上越来越多的新品种出现，品种之间的形态差异缩小，为植株鉴定带来一定困难。细胞学标记是指以一个物种的染色体核型特征为参照，包括染色体数目、大小、带型等作为遗传标记。让研究生物的染色体核型与亲缘关系较近的物种就行比较，可研究出物种的起源和演变。但是细胞学标记的标记数目有限。生物化学标记是指以生物体内某些生化性状为遗传标记，如同工酶和蛋白质等。生物化学标记的应用主要得益于蛋白电泳技术的发展，通过蛋白电泳检测一系列的蛋白和同工酶中氨基酸的变化，研究品种之间的亲缘关系和遗传变异。由于生化标记是以直接的基因表达产物作为标记，容易受到环境和个体的影响，但是由于蛋白电泳技术的操作简单、检测费用较低，是现代较为常用的遗传标记方法。分子标记是指以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是直接以遗传物质为标记的标记技术。与其它三类遗传标记相比，分子标记不受植物发育成熟与否、环境、季节的影响，不受DNA是显性或隐性的影响；基因组变异丰富检测多态性高，每一位点都具有多态性；基因标记数目多，几乎可覆盖整个基因组；检测操作简便、快速、检测灵敏度高且准确，检测完成后样品可长期保存。1.3.3分子标记技术类型分子标记技术可根据所主要使用的分子生物学技术分为三代。第一代分子标记是以分子杂交为技术核心，包括限制性内切酶片段长度多态性RFLP、DNA指纹技术等。第二代分子标记是以DNA聚合酶链式反应（PCR）技术为核心，包括随机扩增多态性RAPD、简单序列重复SSR、简单序列重复间区ISSR、扩增片段长度多态性AFLP、序列标签位点STS等。第三代分子标记也是以PCR技术为基础的一些新型分子标记，包括SNP标记、表达序列标签EST标记等。常用的分子标记技术有RFLP、AFLP、SSR、ISSR、RAPD。1.3.3.1RFLP限制性内切酶片段长度多态性（RestrictionFragmentLengthPolymorphism，RFLP）分子标记是指通过利用同种限制性内切酶酶切消化DNA后，不同的个体之间由于发生了碱基突变而产生不同的同源序列片段，再通过凝胶电泳将这些片段分开。随后与克隆DNA探针进行Sorthern杂交和反射显影，就能获得反映个体特性的RFLP图谱。通过分析RFLP连锁图谱，可用于定位基因的研究和作物育种的研究。RFLP与其它遗传标记相比：①变异丰富，无论是自交系、杂交系还是系内不同个体中都存在RFLP变异；②变异稳定，不受外界环境的影响，直接以遗传基因为研究对象；③分子标记区分度高；③标记为共显性，能够区分纯合显性和杂合显性，且等位基因没有相互作用。RFLP存在问题是应用该技术需要有饱和的RFLP连锁图，但目前除了玉米、水稻等作物外，其他植物的RFLP连锁图的“饱和”程度不高，且RFLP技术操作繁琐，甚至需要使用反射性物质同位素等，实验所需仪器设备价格比较昂贵。1.3.3.2AFLP扩增片段长度多态性标记（AmplifiedFragmentLengthPolymorphism，AFLP）是由荷兰科学家PieterVos等在1995年发明的一种将RFLP与PCR技术相结合分子标记技术。AFLP与RFLP的区别是前者是用PCR技术来进行检测而不是用Sorthern杂交。AFLP分子标记技术是通过两种限制性内切酶对基因组进行酶切，两种限制性内切酶一种为低频剪切酶可识别位点为6碱基，另一种是高频剪切酶，可识别位点是4碱基。经过两种剪切酶酶切后，产生不同分子量的限制性片段，再使用连接酶将双链链头连接到DNA片段的末端，以接头序列和相邻的限制性位点序列，作为引物结合位点，在Taq聚合酶的作用下进行扩增，扩增产物经反射性同位素标记和聚丙烯酰胺凝胶电泳分离分析比较。AFLP技术的优点是①分析所需的DNA样品量极少，对模板DNA浓度变化不敏感；②实验可重复性好；③多态性高，扩增条带数量多且分子量小，分辨率高。但是由于AFLP对研究所用模板DNA质量要求较高，操作复杂和实验费用较高，有需要时要使用反射性同位素，限制了AFLP的广泛应用。1.3.3.3SSR简单序列重复（SimpleSequenceRepeat，SSR）是指在真核生物的基因组中串联状简单重复序列，如常见的微卫星序列（AAT）n或者（TG）n等。SSR序列在不同的基因型中重复次数不同，具有长度多态性，而SSR两侧多是保守的单一序列，可由此作为引物设计位点，扩增SSR序列。SSR分子标记的技术路线是进行DNA酶切后收集酶切片段连接载体，合成末端标记的SSR探针，筛选含SSR的阳性克隆用于测序，根据测序结果设计引物进行PCR扩增。SSR技术的优点是①技术所需的DNA样品量少且对样品质量要求不高；②是共显性的标记可鉴别纯合子和杂合子；③扩增序列多态性高，分布整个基因组。SSR的缺点是设计引物需要对SSR两端序列进行测序，要构建基因文库等，前期准备工作繁多，实验费用较高。1.3.3.4ISSR简单序列重复间区（InterSimpleSequenceRepeat，ISSR）是Zietkeiwitcz等于1994年发展起来的一种微卫星基础上的分子标记。ISSR是在SSR序列的3’端或5’端加上2-4个随机核苷酸并以此作为特定的引物，在进行PCR扩增，再进行聚丙烯酞胺凝胶电泳分辨。只有与锚定在SSR序列3’端或者5’段的序列相配对的序列才能被扩增，提高了PCR扩增的专一性。ISSR的优点是①ISSR引物不需要像SSR引物那样先测出SSR两端的简单序列，实验费用较低；②ISSR可在不同物种之间通用，不需要具有较强的种特异性；③ISSR扩增多态性较高，可获得的信息量多且精确度高；④检测方便不需要使用放射性同位素，广泛应用于植物品种鉴定，绘制遗传图谱等领域。1.3.3.5RAPD随机扩增多态性DNA技术（RandomAmplificationPolymorphicDNA，RAPD）又称任意引物PCR。RAPD是以一系列不同的随机排列的寡核苷酸作为引物一般是含有10个碱基的随机序列，通过设计的PCR模板反应在Taq聚合酶的作用下扩增得到长度不一的多态性DNA片段，将扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳分析，经EB染色来检测扩增产物的多态性。扩增产物的多态性可以反应出基因组的多态性。RAPD扩增的多态性产生因为与引物结合的位点上或者与引物结合的序列之间发生了突变。不同的DNA模板，用同一引物扩增可以得到相同的条带，也可以得到不同的条带。而仅在某一特定模板中出现的条带就可作为该模板的分子标记。RAPD分子标记技术的优点是①用于RAPD扩增反应的引物可随机选定和合成，无需特意设计，也不用预先知道研究对象的基因组序列；②实验研究所用的DNA模板量少，对模板DNA质量要求相对不太高；③同一套引物可以在不同物种之间通用，适用性高；④PCR反应体系退火温度低，一般为35℃~37℃，有利于引物与模板DNA稳定结合，同时允许错误配对发生，增加引物配对的随机性，增加RAPD的检出率；⑤实验操作简便，快速，实验研究费用相对较低。但是RAPD分子标记技术重复性较差，与实验人员的操作密切相关，需要设置重复性实验。RAPD分子标记可以准确的鉴别出品种之间的遗传差异，为育种人员提供丰富的亲本资源。本实验研究利用RAPD技术，从DNA水平上进行遗传分类，探究不同株系之间的挥发油成分与遗传关系的关联，以筛选出遗传稳定的高产天然右旋龙脑的梅片树株系，为梅片树定向选育和开发改良提供理论依据。宋爱云等【12】用RAPD技术将6个芳樟醇含量高的株系和2个含量低的株系进行PCR反应扩增，计算遗传相似性数进行聚类分析，鉴定出8个样品的亲缘关系和遗传多样性。研究结果表明RAPD技术可在分子水平上鉴别出微小的差异。刑建宏等【13】研究樟树叶挥发油中的成分是否主要受遗传控制。通过用RAPD进行扩增聚类分析，研究结果表明樟树叶的挥发油成分在遗传上具有一定的稳定性。本研究旨在利用RAPD分子标记技术对广东工业大学大学城校区内梅片树进行分析，以探讨梅片树的遗传多样性和研究梅片树之间的遗传关系与梅片树叶挥发油成分之间的联系。2材料与方法2.1研究材料用于遗传分析的的材料均采自广东工业大学大学城校区生长的梅片树，取春天萌芽长度约5-8cm，叶片较嫩颜色偏绿，又有一定硬度的梅片树叶片，装进保鲜袋并标号（1~7），立刻运回实验室进行DNA提取。2.2研究设备与试剂主要设备：冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司），PCR仪（BIORADT100TMThermalCycler），电泳仪（DYY—7C型），电泳槽（北京市六一仪器厂），凝胶成像系统（BIO-RADLaboratories–Segrate(Mllan)Italy），ZF—90型暗箱紫外透射仪（上海顾村电光仪器厂），恒温金属浴（杭州博日科技有限公司）主要试剂：DNA提取试剂盒；dNTP、Tap聚合酶、10xbuffer、DDH2O；随机引物F系列F1~F20，G系列G1~G20，K系列K1~K20，见表2.1；Maker、Loldingbuffer、goldview购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。表2.1用于梅片树RAPD分析的随机引物引物序列5’—3’引物序列5’—3’引物序列5’—3’SBSF-01ACGGATCCTGSBSG-01CTACGGAGGASBSK-01CATTCGAGCCSBSF-02GAGGATCCCTSBSG-02GGCACTGAGGSBSK-02GTCTCCGCAASBSF-03CCTGATCACCSBSG-03GAGCCCTCCASBSK-03CCAGCTTAGGSBSF-04GGTGATCAGGSBSG-04AGCGTGTCTGSBSK-04CCGCCCAAACSBSF-05CCGAATTCCCSBSG-05CTGAGACGGASBSK-05TCTGTCGAGGSBSF-06GGGAATTCGGSBSG-06GTGCCTAACCSBSK-06CACCTTTCCCSBSF-07CCGATATCGGSBSG-07GAACCTGCGGSBSK-07AGCGAGCAAGSBSF-08GGGATATCGGSBSG-08TCACGTCCACSBSK-08GAACACTGGGSBSF-09CCAAGCTTCCSBSG-09CTGACGTCACSBSK-09CCCTACCGACSBSF-10GGAAGCTTGGSBSG-10AGGGCCGTCTSBSK-10GTGCAACGTGSBSF-11TTGGTACCCCSBSG-11TGCCCGTCGTSBSK-11AATGCCCCAGSBSF-12ACGGTACCAGSBSG-12CAGCTCACGASBSK-12TGGCCCTCACSBSF-13GGCTGCAGAASBSG-13CTCTCCGCCASBSK-13GGTTGTACCCSBSF-14TGCTGCAGGTSBSG-14GGATGAGACCSBSK-14CCCGCTACACSBSF-15CCAGTACTCCSBSG-15ACTGGGACTCSBSK-15CTCCTGCCAASBSF-16GGAGTACTGGSBSG-16AGCGTCCTCCSBSK-16GAGCGTCGAASBSF-17AACCCGGGAASBSG-17ACGACCGACASBSK-17CCCAGCTGTGSBSF-18TTCCCGGGTTSBSG-18GGCTCATGTGSBSK-18CCTAGTCGAGSBSF-19CCTCTAGACCSBSG-19GTCAGGGCAASBSK-19CACAGGCGGASBSF-20GGTCTAGAGGSBSG-20TCTCCCTCAGSBSK-20GTGTCGCGAG2.3RAPD分析方法2.3.1总DNA的提取原理及方法原理：由于梅片树叶中含有较多的多糖类和多酚类等次生物质，容易对提取的DNA质量造成纯度不高或者产量低的不良影响。提取植物DNA的方法一般有十二烷基硫酸钠（Sodiumdodecylsulfate，SDS）法和十六烷基三甲基溴化铵法（cetyltrimethylammoniumAmmoniumBromide，CTAB）。SDS是一种阴离子去污剂，在提取植物DNA中与蛋白质、多糖等物质结合；而CTAB是一种阳离子去污剂，在提取植物DNA是与DNA结合，是DNA与蛋白质、多糖等物质分离。刑建宏等【11】用RAPD技术分析樟树遗传关系是，讨论了影响PCR效果的重要因素之一是模板DNA的质量，在试验前期探讨了适合植物DNA提取的方法，用改良的CTAB法在提取过程中增加氯仿抽提次数等来提高DNA质量。本实验采用原理基于CTAB法的植物基因组DNA提取试剂盒提取梅片树总DNA。CTAB是一种阳离子去污剂，可以溶解细胞膜，能与DNA形成复合物，将DNA与蛋白质多糖类等次生物质分离。在高盐浓度溶液中可溶，当降低溶液的盐浓度到达一定程度时，会从溶液中沉淀。通过低温高速离心就可将CTAB与DNA的复合物同蛋白质、多糖类物质分开。再将CTAB与DNA的复合物沉淀溶解于高盐溶液，加入乙醇使DNA沉淀，而CTAB又能溶解于乙醇，从而将DNA分离提取出来。本研究所有的植物基因组DNA提取试剂盒中BufferGP1和BufferGP2是裂解液，使细胞裂解。β—Mercaptoethanol是β-巯基乙醇，能抑制多酚及其他物质氧化，同时能降低多酚类物质对DNA的影响。BufferBL是平衡液，用于激活离心柱中硅基质膜的活性，改善吸附柱的吸附能力并提高吸附柱的均一性和稳定性。BufferWP1是洗涤液，用于去除蛋白质，多糖类物质等其他成分。BufferWP2是去盐液，用于降低溶液中盐离子浓度，使CTAB—DNA的复合物从溶液中沉淀出来，BufferWP1和BufferWP2中含有大量的无水乙醇，能将CTAB溶解，与DNA分离。Elution是DNA洗脱液，将DNA分子从离心柱的硅基质膜上洗脱出来。DNA提取与纯化步骤：按试剂盒说明书，预先加入32ml无水乙醇于BufferWP1中，加入64ml无水乙醇于BufferWP2中，室温密闭储存。将采取的新鲜叶片清洗干净，擦干，剪去大叶脉和叶梗，将叶片剪碎。取碎叶片100mg，加入液氮研磨成粉（样品不超过100mg）实验开始前，在1.5ml离心管中加入800μl的BufferGP1，于65℃下预热，然后加入β-Mercaptoethanol至终浓度为0.1%。加入500μl氯仿，持续快速颠倒混匀3min，12000rpm离心5min。小心吸取上层水相转入一个新的离心管中，加入700μlBufferGP2,充分混匀。将混匀的液体转入离心柱中（分次转入，每次700μl），12000rpm离心1min，弃废液。离心柱收集管中的液体重复转入离心柱中，11000rpm离心1min，弃废液。加入700μlBufferWP1(使用前加入无水乙醇)，11000rpm离心1min，弃废液。加入700μlBufferWP2(使用前加入无水乙醇)，11000rpm离心1min，弃废液。加入500μlBufferWP2，12000rpm离心1min，弃废液。再次12000rpm离心2min，将离心柱置于新的离心管中，并打开离心柱盖，于室温或37℃恒温箱放置5~10min直至无明显乙醇味。在离心柱中加入50μlElution(37-65℃预热)，室温放置2~5min，12000rpm离心2min。离心得到的溶液再次加入离心柱中，室温放置2min，12000rpm离心2min。所得的溶液为纯化后的DNA。2.3.2DNA浓度的测定DNA在260nm处有最大吸收峰，蛋白质在280nm处有最大吸收峰，而小分子和盐在230nm处有吸收峰。当OD260为1时，相当于双链DNA的浓度为50μg/ml，单链DNA的浓度为40μg/ml，因此检测时当所测得OD260值在0.1~1.0之间较为准确。DNA浓度（μg/ml）=OD260×50×稀释倍数取几μl样品DNA，加入几μl的TE溶液，稀释几倍，用紫外分光光度计测定在A260、A280和A230的值，根据A260/A280的比值和A230/A260的比值来判断DNA的纯度，当比值在1.8~2.0之间说明DNA纯度较高；若比值较高则说明DNA样品中含有RNA，若比值较低则说明DNA样品中有蛋白质残留。当A230/A260的比值在0.4~0.5之间说明DNA样品中残留的盐和小分子物质较少；若比值较高说明有盐类物质残余。进一步确定DNA的纯度，取1μl的DNA溶液进行浓度为0.8%琼脂糖凝胶电泳与模板DNA比较。实验步骤如下：琼脂糖凝胶的制备：取50×TAE缓冲溶液10ml，加入蒸馏水500ml稀释为1×TAE缓冲溶液，待用。称取0.16g的琼脂糖于100ml锥形瓶中，加入20ml1×TAE缓冲溶液，放入微波炉里加热至琼脂糖全部熔化，取出摇匀，注意不要产生气泡，得到浓度为0.8%琼脂糖凝胶液。胶板的制备：预先电泳梳子和长槽固定好，待上述的琼脂糖凝胶液冷却至室温时，加入1μl的goldview溶液，充分摇匀。沿着胶槽内壁缓慢的将琼脂糖凝胶液倒入槽中，注意不能产生气泡。待胶液完全凝固后，取出梳子，将胶块放入电泳槽中。加样：预先在透明手套上点1μl的10×loadingbuffer，再用微量移液器取4μlDNA样品加入到1μl的loadingbuffer，充分混匀。用微量移液器小心将混匀后的样品加入到样品槽中，样品总体积不可超过样品槽容量。并加入对照的分子量为15000模板DNA。电泳：加样完成后，该上电泳槽盖子，接通电源。电泳电压为100V，电流强度为100mA，电泳时间为15分钟。电泳结束后，利用凝胶成像系统对琼脂糖凝胶进行观察，调节距离和光线，保存照片。2.3.3PCR反应体系PCR技术是一种在扩增合成特异DNA片段的技术。PCR扩增反应一般由3步组成：模板高温变性；引物与模板退火；引物沿模板延伸。这3步反应组成一个循环，通过多次循环后，可将模板DNA迅速扩增。DNA模板在高温环境下变性，双链解开为单链；当温度降低时，引物与模板DNA的单链互补配对结合，引物与模板DNA单链互补的位置决定扩增片段的长短；在Taq聚合酶的作用下，在高温时以dNTP为原料，按照碱基互补配对原则，沿着模板DNA的5’段向3’段延伸，合成DNA新的互补链。经过多次的循环到达将目的DNA扩增放大到百万倍。根据前期预实验的结果和相关参考文献，建立确定反应体积为20μl系统，PCR反应体系如下：RAPD引物0.4μl模板DNA6μldNTP2μlTaq聚合酶0.5μl10×Buffer2μlddH2O9.1μl（1）RAPD反应体系为：20μl反应体系，各个反应物的终浓度是ng模板DNA，mmol·L-1MgCl2，nmol·L-1引物，μmol·L-1dNTPs，UTaqDNA聚合酶，10×Buffer。（2）扩增程序：94℃预变性5min；然后38个循环（94℃变性30s，36℃退火30s，72℃延伸90s）；最后72℃延伸7min；4℃保存。2.3.4扩增产物检测和引物的筛选PCR反应结束后，取4μl的扩增产物与1μl的loadingbuffer在透明手套上充分混匀，用微量移液器小心的加入到0.8%琼脂糖凝胶的加样孔中，盖上电泳槽盖，立即接通电源。电泳电压为100V，电流为100mA，电泳时间为15分钟。电泳结束后利用凝胶成像系统观察并拍照记录保存。以3棵不同的梅片树的DNA为模板，按照上述筛选出的反应条件和PCR扩增程序对所购买的60个随机引物进行RAPD扩增，将扩增结果进行电泳观察根据琼脂糖凝胶电泳的结果，从60个引物中筛选出有扩增条带、且条带清晰、重复性较好的7个引物。以7棵不同的梅片树样品的基因组DNA作为模板，用筛选出来的7个引物，按照PCR反应体系和设定的扩增程序进行RAPD扩增，扩增后的产物进行琼脂糖凝胶电泳观察拍照记录。引物筛选的条件为：样品有条带，且条带清晰不弥散。2.3.5数据处理与分析方法根据RAPD扩增反应后的电泳结果记录的清晰可重复的条带，对于同一引物扩增的产物，迁移速率相同的条带记为1个位点，有条带出现的为扩增阳性，记录为1，没有条带出现的为扩增阴性，记录为0，将所得数据输入Excel2010建立原始表征数据矩阵，用于进一步分析。在任一位点上若有一个或者一个以上个体不同于其他个体，即这个位点为一个多态性位点。统计多态性位点和多态性位点的占总条带数的比例。根据RAPD扩增的结果，以Nei—Li相似系数法来计算遗传相似性系数（geneticsimilaerity，GS）根据公式：GS＝2NXY/(NX+NY)其中Nxy为种间共有的扩增条带数，Nx为X种具有的扩增条带数，Ny为Y种具有的扩增条带数。遗传距离（genenticdistance，GD）根据公式GD＝1－GS.将遗传距离矩阵输入计算机，利用NTsys软件用UPGMA法对其进行聚类分析和构建样品的聚类树状图。3结果与分析3.1梅片树基因组DNA提取和检测分析以梅片树的嫩叶为材料，利用植物DNA提取试剂盒进行DNA的提取，提取后DNA用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测纯度，电泳图见图3.1。A260/A280的比值为xxx，比值在1.8~2.0之间证明DNA纯度较高；A230/A260的比值为xxx，在0.4~0.5之间说明DNA样品中残留的盐和小分子物质较少。DNA的在260nm下测得OD260为xxx在0.1~1.0之间。DNA浓度为xxxxxx10987654321M10987654321M1-10分别为编号不同的梅片树样品基因组、M为15000的标记DNA图3.1梅片树样品的DNA电泳检测图3.2引物的筛选将所购买的60个引物以梅片树基因组DNA为模板按照设定的扩增反应和扩增系统进行RAPD扩增，将有扩增条带、条带清晰不弥散，重复性较好的引物筛选出来，见图3.2。从60个引物出一共筛选出7个合适的引物，见表3.1。987654321M987654321M泳道1、2、3是引物F1，4、5、6是引物G8，7、8、9是引物K17分别对1、2、3号梅片树基因组DNA扩增结果图3.2部分引物PCR筛选结果表3.1经过筛选的7个用于RAPD扩增引物引物序列5’—3’引物序列5’—3’引物序列5’—3’SBSF-01ACGGATCCTGSBSG-06GTGCCTAACCSBSK-15CTCCTGCCAASBSF-05CCGAATTCCCSBSG-13CTCTCCGCCASBSK-16GAGCGTCGAASBSK-17CCCAGCTGTG3.3RAPD扩增结果与聚类分析4讨论4.1