RHD基因型分型的应用

第一章前言1.1研究目的本研究拟开发一种通用的简单、快速的靶向富集测序方法，用于对中国人群RhD基因型的精准分型。本研究的出发点为以下两点：①RhD血型与输血：正常人血中一般不存在天然的RhD抗体。所以在第一次输血时，通常不会发现Rh血型不合的情况。RhD阴性的个体在输受了RhD阳性的血液之后，可免疫产生抗RhD抗体。如果该个体再次输受RhD阳性的血液，就可能会导致溶血性输血反应的发生。因此有必要对个体的RhD血型进行检测②RhD与新生儿溶血病。新生儿溶血病是影响儿童健康状况和生存质量的重要疾病。尽管它们发病率较低，但绝大多数在孕期无法发现，而严重患病的缺陷胎儿大多数情况下会发生死亡。此外，Rh溶血还可引起新生儿黄疸（皮肤、眼睛变黄）、心衰、贫血甚至大脑死亡。这将给孕妇及其家人带来沉重的打击，给家庭带来巨大的痛苦。通过靶向富集测序技术对孕妇外周血游离DNA的检测也可用于无创产前诊断，大大减少出生缺陷，同时也可以科学理性的指导优生优育以及人工辅助生殖。1.2靶向富集测序的优势及现有方法基于低覆盖度全基因组测序的方法，需要对全基因组进行建库且需要的测序数据量多，成本较高。而靶向富集测序选择性的富集目的区域，需要的测序数据量少，成本相比于全基因组测序大大降低，靶向富集测序能够避免消耗大量的测序、存储和分析资源，简化信息分析流程，提高目的区域测序深度，提高检测的灵敏性和准确性。DNA靶向富集测序技术的关键在于对目标分子的捕获与扩增，目前已有多种方法可实现目标区域的靶向富集：传统的PCR或多重PCR技术、微液滴PCR技术、固相或液相杂交捕获技术、选择性的环化探针法。基于以上靶向富集方法的产品包括AgilentTechnologies的HaloPlex（选择性环化PCR）和SureSelect（液相杂交），Illumina的Nextera（液相杂交）和TruSeq（液相杂交），IonTorrent/ThermoFisherScientific的IonAmpliseq（多重PCR）以及RocheNimbleGen的SeqCapEZ（液相杂交）。但是，上述方法操作时间长，实验繁琐，不利于自动化建库，成本高。此外，探针的捕获效率也限制了数据利用率。上述的几种富集平台在DNA靶向富集方面有一定的局限性。而采用锚定多重PCR并结合巢式PCR的扩增的方式则可尽可能的保证目标区域的特异性和均一性[1]；然后在PCR的过程中引入测序接头序列，在DNA富集的同时完成二代测序上机文库的制备，这样可以避免进行常规二代测序文库所需要的复杂的文库制备过程，更为便捷[2]。1.3RhD基因分型的研究方法比较以往扩增RhD基因判定RhD基因型的方法主要有三种：①扩增RhD基因外显子10的3′非翻译区序列[3]；②扩增外子7[4]；③扩增内含子4[5]。这些方法都是扩增单一的RhD基因片段，因此，当有RhD基因的变异体表型时，就可能发生误差，导致假阳性或假阴性结果。随着对RhD基因及其分子遗传机理的深入研究，RhD基因的检测思路和策略也在不断变化。在RhD基因定型检测方面，由检测RhD基因某个单一的外显子，发展到检测多个甚至全部外显子。目前国内外针对RhD基因分型的主要策略为PCR-SSP的方法，但基本都是针对基因组DNA。在面对胞外游离DNA时，由于游离DNA具有起始量低、高度片段化等特点。其方法并不能很好的实现基因分型。而对胞外游离DNA的RhD基因分型是我们进一步研究胎儿RhD血型无创产前的关键所在。因此，我们需要研发一套适用于中国人群的、对基因组DNA和胞外游离DNA都能进行检测的方法，用于RhD基因型分型。1.4研究策略针对RhD基因的分型，我们首先对RhD基因和RHCE基因设计多重PCR引物。针对模拟样本进行靶向文库制备，通过模拟样本测试来评估RhD基因多重引物的各项性能。文库经BGISEQ-500平台进行靶向高深度测序后进行数据分析。基于模拟数据，评估该方法的稳定性。完成引物测试和实验稳定性测试之后。进行真实样本测试，以评估该方法用于检测RhD基因型的可靠性。第二章研究背景2.1Rh血型系统Rh血型抗原由位于1号染色体短臂1p34.3-1p36.1[3]上两个紧密连锁高度同源的RHD和RHCE基因编码。RHD基因编码红细胞膜上的RhD蛋白。缺乏功能性RHD基因的D阴性个体不产生D抗原，并且可被RhD阳性血免疫。剩下四种4种常见Rh抗原（C，c，E和e）的表位在由RHCE基因编码的RhCE蛋白上表达。有研究表明：在灵长类进化过程中，RHD基因是由RHCE基因重复产生的[4]。RHD基因和RHCE基因不仅结构相似，而且序列高度同源。二者同源性高达96%以上。RHD基因第1、2、8外显子的编码区与RHCE的相应序列相同，并不是RHD的特异性序列不能作为引物序列区[5]。而RHD基因的4、5、6、7、9外显子的核苷酸序列与RHCE基因序列存在部分差异，例如RHD基因外显子10比RHCE基因外显子10大，两个基因的3’端非编码区存在序列差异，RHD和RHCE基因内含子4大小分别为426bp和1075bp，RHD基因内含子4缺失649bp[6]。Rh血型系统是新生儿和胎儿溶血疾病中最重要的血型系统。在临床输血中，该系统的D抗原是ABO血型系统的A和B抗原后面第三个最相关的抗原。在过去的十年中，分子技术与血清学检测相结合已被用于研究不同种族群体中编码D抗原的RHD等位基因。RhD表型主要分为以下几类：①RhD阳性：其血清学表现为能与所有的Rh血型系统的单克隆抗血清发生凝集。分子生物学表现为具有全部的正常RHD基因。②RhD阴性：研究发现不同种族Rh阴性个体中存在RHD基因完全缺失、RHD基因部分缺失、RHD基因完整三种情况。③弱D表型：弱D型通常是由于RHD基因编码区发生碱基突变，进而使得编码的RHD蛋白氨基酸发生替换。这种氨基酸替换主要位于RhD蛋白胞质区或跨膜区，因此影响该蛋白有效插入红细胞膜，而导致红细胞膜RhD蛋白表达的抗原位点数目减少，但抗原表位数目基本不变[7]。现实生活中，具有这种亚表型的人在献血时常常被标记为“D阳性”。而当接受血液时，他们有时被当作“D阴性”。事实上，大多数“弱D”患者可以接受“D阳性”血液而没有并发症。④部分D表型：区分弱D和部分D是十分重要的。弱D表型是由于红细胞上D抗原数量减少所致。而部分D表型是由于D抗原表位的改变所致。因此，在部分D中，D抗原的数量不减少，但蛋白质结构发生改变。部分D个体可以被免疫产生所缺失抗原表位的抗体。⑤Del表型：主要存在亚洲人群中，大约26%RhD阴性中国人为Del表型。邵超鹏和Chen等人研究中国人主要表现为RHD1227G>A碱基突变。2.2分子生物学检测RhD血型的必要性血清学检测的是RHD基因的表现型，分子生物学检测的是RHD基因的基因型。在多数情况下，绝大多数医院对RhD血型的确定仅简单的行血清学检测[8]。但血清学初筛检测存在假阴性率高的问题，例如常规的血清学检测常常会将DEL型血判定为RHD阴性血，从而导致在输血时直接将DEI型血液输给患者。造成临床输血事故。也有报道血清学误判弱D1型、弱D2型供者为D阴性，输注给D阴性受者，结果发生原发性抗-D。因此，对RhD基因进行精准的分型，在保障临床输血安全等方面起到十分重要的作用。常规的血清学检验虽然有着十分重要的作用，但是在常规的实验操作中受收到很多因素的影响。如操作者的主观因素、实验设备的参差不齐、各种实验条件的不确定性。最重要的是常规血清学检验在检测稀有血型时容易出现假阴性或假阳性。国内外学者针对此问题也设计了许多检测RhD基因型的方法，如采用实时荧光定量PCR的方法检测RhD基因型。但国内外RhD阴性表型除分布频率不同以外，RhD阴性表型相应的基因型遗传背景也存在很大差别。白种人群绝大多数RhD阴性表型的分子基础为RHD基因的完全缺失；大多数非洲黑人的RhD阴性表型存在RHD假基因型；而包括中日韩在内的东亚人群中，RhD阴性表型存在由以下3种情况造成：①RHD基因完全缺失②RHD-CE-D杂合等位基因③DEL(1227G>A)[9]。因此，设计一套针对中国人群的RhD基因分型方法是十分必要的。第三章研究过程3.1实验材料3.1.1研究对象收集由青岛大学附属医院黄岛产科通过血清学方法检测到的21例RhD阴性个体的外周血样本。所有21位RhD阴性个体均知情同意。RhD阳性样本由华大基因研究院提供。3.1.2主要实验试剂①Endrepairennzymesmix、T4DNALigase②NIFTY-Adapters（华大制造）③QubitTMdsDNAHSAssayKit④Q5HotStartHigh-Fidelity2XMasterMix⑤AMPF1Primer、BCPrimer、LibFPrimer⑥上下游引物（生工生物工程（上海）股份有限公司）⑦Sterilepurifiedwater⑧无水乙醇⑨PEG32Beads、AxygenBeads⑩琼脂糖3.1.3主要实验设备①移液枪②高速离心机③PCR仪（美国ABI公司）④Vortex振荡器⑤Qubit3.0荧光定量仪3.2实验步骤3.2.1血浆游离DNA的提取孕妇血浆DNA抽提按Magen公司的MagPureCircµlatingDNAKitB说明操作。（1）在2.0ml离心管中，加入15µl蛋白酶K和20µlMagPureParticlesG。（2）转移300ml血浆样本至含有蛋白酶K的离心管中，震荡混匀5秒。（3）加入420µlBufferMLE至样品中，混匀15秒。56℃15min。期间颠倒混匀多次。（4）转移至磁力架上，静置3~5分钟吸附磁珠，小心吸弃所有溶液。（5）加入500µlBufferMW1，涡旋混匀15秒。（6）转移至磁力架上，静置两分钟吸附磁珠，小心吸弃所有溶液。（7）加入500µlBufferMW2，涡旋混匀15秒。（8）转移至磁力架上，静置两分钟吸附磁珠，小心吸弃所有溶液。（9）重复7-8步一次。（10）短暂离心，收集管壁上的液滴。转移至磁力架上，小心吸弃所有溶液。（11）空气干燥7-10分钟（12）加30~50BufferTE，涡旋打散磁珠。静置3~5分钟。（13）转移至磁力架上，静置3分钟。转移DNA溶液至新的1.5ml离心管中。3.2.2gDNA打断、纯化gDNA打断所用为仪器：CovarisLE220（Axygen96孔PCR板）（1）打开变压器电源（输入/输出电压为220/110V）（2）打开恒温水浴锅开关，一般温度设为4℃，特殊要求可调节（3）打开CovarisLE220仪器开关和计算机（4）平稳地取出CovarisLE220水槽，往水槽中加入去离子水至相应位置，小心将水槽放入仪器内对应位置（5）打开桌面CovarisLE220软件，点击Continue，转换器架将自动向下移动至相应位置（6）按下仪器上白色按钮（DEGASPUMP）进行排气，排气至少45分钟（7）利用QubitdsDNABRAssay方法对样品基因组定量（8）在96孔PCR板（Axygen）用来打断的孔中放入一根专门用来打断的塑料小棒，用1×lowTE（或者EBbuffer）将1-10µg样品稀释至80µl后加入相应的96孔中，并用封膜机封膜（9）按住仪器绿色按钮（DOOR）开门，将96孔PCR板放在架上，注意方向正确！（10）点击Configue，进入程序设置页面，左界面Sequence选择打断顺序，WellPlate选择50014396position6mmtube7mmoffsetcrimp,右界面Bathtemplimit设为20℃，上述界面参数设置如下：Duty/cycle(%)21Intensity500Cycle/burst500Time(s)5cycleof2minuteseach（11）核对程序设置和位置是否正确，点击Return返回主界面，点击主界面CheckAlignment，使样品移动至指定位置；点击Start，确认对话框内容后打断样品。（12）将打断后的样品缓缓吸出，放入1.5mlEP管中保存（13）出3µl的样品用于电泳检测，打断后主带在150~200bp打断后DNA纯化条件如下：（1）将100µl打断后的DNA转入1.5ml的EP管中，加入1倍体积的XP磁珠（2）室温下静置5min（3）将EP管放到磁力架上至液体澄清（4）用移液器小心将上清转移至新的1.5ml的EP管中（注意不要碰到磁珠）（5）在新的EP管中加入0.5倍的XP磁珠，室温下静置10min（6）将EP管放到磁力架上至液体澄清（7）用移液器小心地去除上清（注意不要吸到磁珠），保持EP管在磁力架上，加入500µl75%的乙醇洗涤磁珠表面（8）除去乙醇（9）重复步骤（7）-（8）（10）尽量完全去除乙醇，待磁珠干燥后用TE溶解5min（11）转移EP管至磁力架上，取上清至新的1.5ml的EP管中，定量。3.2.3DNA靶向富集文库制备通过末端修复、接头连接和两轮巢式PCR实现目标区域富集，获得最终文库。①末端修复：（1）将末端修复的试剂置于冰上融化，充分混匀后轻微离心；（2）在样品离心管中按照如下体系配制末端修复反应体系，充分混匀后轻微离心；试剂体积（µl）提取的cfDNAsolution40EndrepairBuffer9.4Endrepairennzymesmix0.6Totalvolume50（3）将离心管放置在Thermomixer中37℃孵育30min，65℃15min，（注意65℃时需要盖热盖）②接头连接：（1）将接头连接的试剂置于冰上融化，充分混匀后轻微离心；（2）在产物离心管中按照如下体系配制接头连接反应体系，充分混匀后轻微离心；试剂体积（µl）上一步反应产物502XLigationbuffer24NIFTY-Adapters5T4DNALigase1Totalvolume80注：DNALigase应在把其他试剂加好充分混匀后，最后加入。（1）将离心管放置在Thermomixer中23℃孵育30min；（2）提前取出AxygenBeads置于室温平衡30min；（3）取60µlAxygenBeads加入一新的1.5ml离心管中，将反应产物完全转移至准备好的磁珠里，用枪反复吹打混匀，室温孵育5min；（4）轻微离心，将离心管放置在磁力架上静置2min使磁珠完全吸附到管壁，小心吸取并弃去上清（5）保持离心管在磁力架上，加入200µl75%现配乙醇，上下颠倒洗涤，静置30s，然后小心吸取并弃去上清，重复一次（要完全去除残留的乙醇，可以把管子拿下磁力架离心轻甩，放回磁力架，用小枪吸干残留乙醇)；（6）保持离心管放置在磁力架上，打开管盖，室温下静置5min风干（磁珠表面不发光）；（7）加入20µlTE，用枪反复吹打混匀，vortex10s，室温下静置5min；（8）轻微离心2s，将离心管置于磁力架上2min使磁珠完全吸附到管壁，小心吸取上清并将其转移至一个新的200µl离心管中；③2stPCR：（1）将所需试剂置于冰上融化，充分混匀后轻微离心；（2）在产物离心管中按照如下体系配制接头连接反应体系，充分混匀后轻微离心；试剂体积（µl）DNA20Q5HotStartHigh-Fidelity2XMasterMix25USPPrimerMix(10uM)2.5AMPF1Primer(10uM)2.5Totalvolume50（3）按照如下程序进行PCR反应：98℃5min1cycle98℃10s10cycles62℃2min72℃5min1cycle16℃holdHolding（3）取50µlAxygenBeads加入一新的1.5ml离心管中，将反应产物完全转移至准备好的磁珠里，用枪反复吹打混匀，室温孵育5min；（4）轻微离心，将离心管放置在磁力架上静置2min使磁珠完全吸附到管壁，小心吸取并弃去上清；（5）保持离心管在磁力架上，加入200µl75%现配乙醇，上下颠倒洗涤，静置30s，然后小心吸取并弃去上清，重复一次（要完全去除残留的乙醇，可以把管子拿下磁力架离心轻甩，放回磁力架，用小枪吸干残留乙醇)；（6）保持离心管放置在磁力架上，打开管盖，室温下静置5min风干（磁珠表面不发光）；（7）加入20µlTE，用枪反复吹打混匀，vortex10s，室温下静置5min；（8）轻微离心2s，将离心管置于磁力架上2min使磁珠完全吸附到管壁，小心吸取上清并将其转移至一个新的200µl离心管中；④2ndPCR：（1）将所需试剂置于冰上融化，充分混匀后轻微离心；（2）在产物离心管中按照如下体系配制接头连接反应体系，充分混匀后轻微离心；试剂体积（µl）DNA17.5Q5HotStartHigh-Fidelity2XMasterMix25DSPPrimerMix(10uM)2.5LibFPrimer(10uM)2.5BCPrimer2.5TotalVolume50（3）按照如下程序进行PCR反应：98℃5min1cycle98℃10s20cycles62℃2min72℃5min1cycle16℃holdHolding（4）取50µlAxygenBeads加入一新的1.5ml离心管中，将反应产物完全转移至准备好的磁珠里，用枪反复吹打混匀，室温孵育5min；（5）轻微离心，将离心管放置在磁力架上静置2min使磁珠完全吸附到管壁，小心吸取并弃去上清；（6）保持离心管在磁力架上，加入200µl75%现配乙醇，上下颠倒洗涤，静置30s，然后小心吸取并弃去上清，重复一次（要完全去除残留的乙醇，可以把管子拿下磁力架离心轻甩，放回磁力架，用小枪吸干残留乙醇)；（7）保持离心管放置在磁力架上，打开管盖，室温下静置5min风干（磁珠表面不发光）；（8）加入20µlTE，用枪反复吹打混匀，vortex10s，室温下静置5min；（9）轻微离心2s，将离心管置于磁力架上2min使磁珠完全吸附到管壁，小心吸取上清并将其转移至一个新的200µl离心管中；⑤样本定量按照QubitTMdsDNAHSAsssayKit操作说明进行定量。⑥凝胶电泳配制2%的琼脂糖凝胶，按照常规操作对DNA产物进行凝胶电泳。电泳条件为180v电压，25min。⑦Pooling每个测序lane需要160ngDNA。根据样本量的所需测序深度的要求合理分配每个样本DNA的投入量。然后补TE到48µl。⑧单链环化（1）95℃变性5min后立即放置冰上2-3min环化试剂体积（µl）DNA48环化反应缓冲液13连接酶混合液1Total62备注：环化后的DNA直接取15µlmakeDNB⑨酶切消化试剂体积（µl）ssDNA62EXOI1.95EXOIII0.75Total64.7反应条件：37℃30min4℃Hold⑩产物用85µlPEG32磁珠纯化，溶于32µlTE缓冲液。然后进行ssDNA定量。3.2.4高通量测序将构建好的DNA文库送测。利用BGISEQ500(中国华大基因公司)测序仪采用PE50的策略对富集文库进行高通量测序。所谓PE50是双向测序的一种。采用此策略，BGISEQ500平台可以对DNA片段从正向和反向进行各50bp的双端测序。测序由国家基因库（深圳大鹏）测序中心完成。待测序完成后，测序中心工作人员将会反馈下机数据。3.2.5数据筛选原始下机数据中存在部分能比对到多个参考基因组位点的reads。我们会对这些reads进行去除，以确保每个reads能唯一的比对到参考基因组上，从而保障数据的准确性。然后根据比对到参考基因组上的位置筛选目标序列进行分析。3.3实验结果对1例RhD阳性的女性gDNA做4例重复，1例RhD阳性的男性gDNA做4例重复。共8例样本的靶向富集产物进行定量结果（表Ⅰ）：表Ⅰ：8例gDNA靶向富集产物定量结果ID浓度（ng/µl）M133.6M237.2M340.4M439.8F136.4F235.7F338.8F429.8对8例样本的RhD和RHCE外显子测序比对率做图（图Ⅱ、图Ⅳ）。发现除RhD基因的8号外显子未检出外，其余19个外显子均可检出。因为所用样本均为经过血清学验证的RhD阳性样本，所以不存在8号外显子缺失的情况。而且RhD8号外显子不具备特异性。考虑8号外显子未检出的原因有以下两点：①针对RhD和RHCE8号外显子设计的引物对RHCE的8号外显子有偏好性。②用生物信息学方法统计时将RhD基因的8号外显子的序列归为RHCE基因的8号外显子序列。对样本之间的比对率做拟合优度检验作图（图I、图Ⅲ）。结果良好，证明该靶向富集测序技术对RhD样本的检测稳定性较好。图Ⅰ：原始数据拟合优度检验图Ⅱ：原始数据外显子比对率统计图图Ⅲ：去重数据拟合优度检验图Ⅳ：去重数据外显子比对率作图在RhD阳性的4例女性样本中，均检测出RHD(1227G>A）突变，检测结果如下表：表Ⅱ：四例RHD(1227G>A）突变检出的数据统计chrposrefTotal(reads)ATCGNdeldiff_or_low_qualitysecond_max_percentmutationchr1_RHD25648453G20115001860000.0746268656716G>Achr1_RHD25648453G96835009330020.0361570247934G>Achr1_RHD25648453G70253106480020.0754985754986G>Achr1_RHD25648453G80549007560030.0608695652174G>A第四章结论4.1RHD基因型分型的应用在预防新生儿溶血中的应用：对胎儿血型的预测主要分为侵入性与非侵入性产前诊断两大类[13]。侵入性手段虽然诊断准确率高，但往往需要通过有创手术获得胎儿样品，如绒毛膜穿刺、羊水穿刺、脐带血穿刺。然而，这种取样方式存在一定的流产风险。1997年，自Lo等［14］首次证实孕妇血浆含有胎儿DNA以来，孕妇血浆中的胎儿游离DNA便成为产前非侵入性研究胎儿遗传信息的重点。在后继的研究中发现孕妇外周血中确实存在胎儿DNA，早至孕期7周就可以通过母体外周血检测胎儿DNA，其浓度随妊娠周期的增长而增加，有研究显示孕中期和孕晚期胎儿游离DNA的浓度高于孕早期，分别占母体血浆总DNA的3．4％和6．2％，至32周时达到高峰。因此，对孕晚期RhD阴性孕妇的血浆游离DNA进行靶向富集测序检测RhD基因型，一旦检出RhD阳性的基因型就证明其所怀胎儿为RhD阳性血。这时即可告诫孕妇、医师采取必要的措施防止新生儿溶血等情况的发生。此外，并不是所有RhD阴性的孕妇都需要进行产前诊断。当RhD阴性孕妇的丈夫为RhD阴性或者纯和阳性时，可以预见他们的婴儿必定是RhD阴性或阳性。只有当其丈夫的RhD基因型为杂合时，无法直接预测胎儿的RhD血型。这时才需要对胎儿的RhD血型进行产前诊断[15]。因此，RhD基因型的准确分型就显示了其在胎儿RhD血型无创产前中的重要地位。在临床输血中的应用：此方法可用于RhD相关疑难血型血清学标本基因型检测，并指导临床实践。如Del表型孕妇，无需接受不必要的抗-D免疫球蛋白注射;Del表型患者可以安全输注RhD阳性血液，以节约稀有的RhD阴性血液;RhD阴性孕妇丈夫RHD基因合子型分析，以推测胎儿发生RhD相关新生儿溶血病的风险;对于弱D、部分D及Del表型的献血者作为RhD阳性血液处理，而对于这些变异基因型的患者，则需要结合不同型别的特点，将其作为RhD阳性或阴性患者对待等。4.2实验结论西方科学家对RhD基因分型的工作开展较早，但由于RhD阴性的分布频率和遗传背景都与中国人群相去甚远。所以，适用于西方人群的RhD基因分型策略并不适用于对中国人群的基因分型。因此，建立一种基于中国人群的RhD基因分型方法十分必要。本研究的分型方法包括：第一步对RHD和RHCE的全部各10个外显子以及13各中国人群热点突变进行靶向富集。Shi-HuiYe等人采用序列特异性PCR和直接测序等手段对2493例汉族人群RhD阴性血样本进行了综合研究。鉴于我国RhD阴性频率只有3‰~4‰，其研究所囊括的人群总数量级接近百万。所以本文所选择的要扩增的RhD等位基因均来自上述研究（表Ⅲ)。第二步利用高通量测序技术对富集产物进行测序，对RhD基因进行分型。表Ⅲ：2493例RhD阴性样本的分型情况RHD个数（百分比)d/d1685（67.59%）RHD-CE(2-9)-RHD/d163（6.54%）RHD(711delC)/d19（0.76%）RHD(78delC)/d1（0.04%）RHD(520G>A+1080-1089delTCCAGGTCCT)/d1（0.04%）RHD(1227G>A)/d467（18.73%）RHD(1227G>A)/RHD(1227G>A)49（1.79%）RHD(1227G>A)/weaktype152（0.08%）WeakDtype15/d62（2.49%）WeakDtype24/d1（0.04%）weakDtype25/d1（0.04%）WeakDtype33/d2（0.08%）RHD(438G>C)/d1（0.04%）RHD(101A>G)/d1（0.04%）RHD(357T>C)/d,DBO-21（0.04%）RHD(436G>A)/d1（0.04%）DVItype3/d31（1.24%）DVtype2/d4（0.16%）RHD(697G>A)/d,DHK1（0.04%)Total2493（100%）针对这些位点，我们设计了10对上下游引物，同时扩增RHD和RHCE基因。因为RHD和RHCE基因高度同源，所以可以设计可同时扩增这两个基因相应外显子的引物[16]。只需在对测序数据进行信息分析时找出各自特异性SNP就可将两者区分开来。在上述八例RhD阳性样本中，均未检测到8号外显子。中国人群尚未有发现RHD基因8号外显子单独缺失导致的RHD阴性基因型，而且上述样本均为血清学验证过的阳性样本。所以基本可以排除样本本身RHD8号外显子缺失的情况。因此，我们针对可能存在的8号外显子引物对RHCE基因具有明显偏好性的情况更换了两次引物，结果仍不理想。所以分析更可能的原因是信息分析过程存在的问题，未能将RHCE基因的8号外显子和RHD基因的8号外显子区分开来。针对这一点，我们将会在进一步的研究中进行改进。初步考虑更换用来区分二者的特异性SNP来进行改进。其实，8号外显子对RHD基因分型的意义不大，很多学者采用PCR-SSP的方法进行RHD基因分型的时候，都不会对RHD的8号外显子进行扩增。综合来看，目前该方法的这一不足会不对RhD基因的正确分型产生非常大的影响。此外，我们还设计了5对上下游引物扩增该13个突变位点。上述8例样本中有四例（同一样本的四例重复）检出了RHD(1227G>A)突变，其余位点均正常。证明其为中国人群常见Del型。下一步将对收集到的21例RHD阴性样本进行检测，继续评估该方法的可靠性。总的来说，该靶向富集测序技术检测RHD基因型准确可靠，经过完善后可用于进一步研究。致谢我首先要感谢我的论文指导老师：青岛大学的王斌老师和华大基因研究院的杨林老师。王老师和杨老师在我论文撰写过程中及时对我遇到的困难和疑惑给予悉心指点，提出了许多有益的改善性意见。投入了十分多的心血和精力。我对两位老师对我的帮助和关怀表示诚挚的谢意！同时，感谢青岛大学华大基因创新学院和华大基因研究院对我的栽培，使我在大学四年的时光中积累了丰富的专业知识和科研技能。此外，我还要感谢朋友以及同学们在论文编写中带给的大力支持和帮助。也要感谢参考文献中的作者们，没有他们做的工作就不可能有这篇论文的完成。最后，感谢论文评阅老师们的辛苦工作！参考文献YeS-Hetal.AComprehensiveinvestgationofRhDpolymorphismsinthechineseHanpopµlationinXi’an[J].BloodTransfus,2014,12:396-404.ZongliZhengetal.AnchoredmultiplexPCRfortargetednext-generationsequencing[J].NatMed.,2014,20