SAA校准品的制备

PAGE2PAGE学号16208030089SAA校准品的制备【摘要】目的和意义：制备出校准效能准确并且稳定存在的SAA校准品原料。方法与思路：以SAA蛋白为研究对象,突变其氨基酸序列，构建原核表达载体,诱导大肠杆菌表达相应蛋白,纯化出校准效能准确并且稳定存在的SAA校准品原料。创新性：突变SAA1的氨基酸序列，将SAA1的第60位氨基酸D突变为N、第71位氨基酸H突变为R，使其更接近SAA2的氨基酸序列，从而使校准品在校准系统时能同时把SAA1和SAA2检测出来，减少因两者间的差异导致的系统误差。【关键词】氨基酸突变；SAA；校准品PreparationofSAAcalibrator[Abstract]Objectiveandsignificance：SAAcalibrationrawmaterialswithaccuratecalibrationefficiencyandstableexistenceareprepared.Methodsandideas：TakingSAAproteinasresearchobject,mutationofitsaminoacidsequence,constructionofprokaryoticexpressionvector,inductionofEscherichiacolitoexpressthecorrespondingprotein,purificationofSAAcalibratorrawmaterialswithaccurateefficiencyandstableexistence.Innovation：MutatingtheaminoacidsequenceofSAA1,mutatingthe60thaminoaciddofSAA1inton,andmutatingthe71staminoacidhintortomakeitclosertotheaminoacidsequenceofSAA2,thusenablingthecalibratortosimultaneouslydetectSAA1andSAA2whencalibratingthesystem,andreducingthesystemerrorcausedbythedifferencebetweenthetwo.1立题目依据1.1国内外研究现状分析：校准品是一种材料或者物质，可用于校准测量系统，评价测量程序或为材料赋值。由于其与病人样品基质效应相似，能克服纯标准品与病人样品之间的基质差异，所以可以替代标准品用于日常校准测量系统，评价测量程序或为材料赋值工作。然而临床检验领域标准物质采用的基体和成分极易发生变化、稳定性较差。因此，与其它应用领域标准物质相比，临床检验领域标准物质研制难度较大，成功率较低［1］。另外，有研究发现，校准品的不确定度水平会影响互换性评价结果［2］。而目前市面上所售的SAA校准品大多是只优化了密码子的产品，SAA1与SAA2差异仍不变，因此，当用所制备的校准品去校准系统时，互换性不高，往往只能校准同一系统，对于其他系统的校准不确定性高。01.2实验目的及意义：校准品是一种材料或者物质，某一种或多种特性值只够均匀并被良好确定，用于校准测量系统，评价测量程序或为材料赋值。由于其与病人样品基质效应相似，可以克服纯标准品与病人样品之间的基质差异，所以可以替代标准品用于日常校准测量系统，评价测量程序或为材料赋值工作。临床检验领域标准物质采用的基体和成分极易发生变化、稳定性较差。因此，与其它应用领域标准物质相比，临床检验领域标准物质研制难度较大，成功率较低［1］。临床检验领域校准品大多为人血清基质，如混合血清等。血清淀粉样蛋白A(SerumamyloidA，SAA)属于载脂蛋白异质类蛋白家族，在人体内主要由肝细胞分泌,在急性时相反应中发挥了重要作用［2］。其有四位家族成员：SAA1和SAA2基因编码的急性期SAA、SAA3编码的表观假基因，SAA4编码的组成型SAA。在机体受到刺激时，如炎症、感染、肿瘤等，受细胞因子的作用，急性期SAA合成增加，成为体内主要的SAA，因而其表达水平明显升高。［3］。正常人血清中SAA含量较低，病人血清中含量较高，但临床样本收集受限，且SAA天然结构复杂，稳定性差，故天然提取难度较大。基于此，我们拟采用体外重组的方法获得SAA重组蛋白，以期为临床提供一种诊断性能好、具有价格优势的校准品试剂，其在炎症诊断方面也具有巨大应用价值。在机体发生炎症、感染等情况时，A-SAA在体内降解速度明显减慢，A-SAA的合成则明显增加，血清A-SAA水平明显升高，通过细胞黏附、内吞作用经细胞表面或细胞内蛋白酶降解［4］。由于SAA1与SAA2同源性较高，因此，基质效应显著，用SAA1校准品校准系统时受SAA2影响较大。基于此，我们拟采取突变SAA1氨基酸序列的方法使SAA1与SAA2的同源性提高，减少基质效应，使新组合的检测系统的病人标本检测结果和原配套检测系统的病人标本检测结果具有可比性。同时，大肠杆菌生长周期短，转化率高，诱导后表达量高，生产成本低，是一个十分优质的表达系统，可以为校准原料的规模生产提供基础。1.3创新点：本课题不同于以往只优化密码子的做法来制作校准品，而是采取采取突变氨基酸序列的方法来制作。突变SAA1的氨基酸序列，将SAA1的第60位氨基酸D突变为N、第71位氨基酸H突变为R，使其更接近SAA2的氨基酸序列（如下图），从而使校准品在校准系统时能同时把SAA1和SAA2检测出来，减少因两者间的差异导致的系统误差。氨基酸突变图1.4参考文献：[1]秦霄雯,樊超,任宏伟.基于单质细胞成分提取固定技术的血液分析仪校准品制备工艺[J].医疗装备,2015,(第4期).[2]陈宝荣,王惠民,张传宝,全灿,宋德伟.检验医学标准物质互换性评价中应重点关注的几个问题[J].临床检验杂志,2016,34(11):801-803.[3]谭保林.血清淀粉样蛋白A在疾病应用中的研究进展[J].中国社区医师,2019,(第3期).[4].CantariniL，GianiT，FioravantiA，etal.SerumamyloidAcirculatinglevelsanddiseaseactivityinpatientswithjuvenileidiopathicarthritis[J].YonseiMedJ，2012，53(5)：1045-1048.2实验方案2.1实验内容1）SAA1基因的获取：根据NCBI数据库中的信息，获得SAA1的氨基酸序列以及核酸序列。2）SAA1M基因的获取：采用点突变技术，突变SAA1的基因序列，将SAA1的第60位氨基酸D突变为N、第71位氨基酸H突变为R，得到的基因命名为SAA1M。3）克隆载体与表达载体的构建以及转化：PCR扩增SAA1M基因，扩增产物与质粒pMD-18T连接并转化至DH5α感受态细胞，在含氨苄的LB培养板上培养12-16h。随机挑取单克隆，37℃，250rpm培养过夜，提取重组质粒，PCR扩增后双酶切鉴定，然后测序。将测序正确的重组质粒和表达质粒pET32分别用StuI和HindIII双酶切、连接并转化至DH5α感受态细胞，在含氨苄的LB培养板上培养12-16h。随机挑取单克隆37℃，250rpm培养过夜，转化大肠杆菌BL21，得到含SAA1M的大肠杆菌菌种。4）大肠杆菌的培养及诱导表达：37℃，250rpm活化菌种3h。接菌加氨苄抗性37℃220rpm培养3h，IPTG诱导过夜。5）SAA1M蛋白的纯化：收菌，采用高压匀浆法破碎大肠杆菌，终浓度为20%的饱和硫酸铵沉淀蛋白，NI柱纯化。6）SAA1M校准原料的效能分析：用固定浓度的抗体与校准原料反应，绘制校准曲线，再利用多种已知浓度的抗体与校准原料反应，观测校准曲线的准确度。37℃考核，放置七天，与4℃放置七天比较，偏差在10%以内。2.2技术路线2.3方法与材料2.3.1方法：采用点突变技术，在不改变SAA蛋白结构和功能基础上突变SAA1蛋白的氨基酸序列，将SAA1的第60位氨基酸D突变为N、第71位氨基酸H突变为R，使其与SAA2的氨基酸序列更接近，同时在人血清样品中检测到两者的可能性提高。采用高压匀浆技术破碎大肠杆菌，提取SAA蛋白。再采用硫酸铵沉淀技术和亲和层析技术，纯化出大肠杆菌表达的SAA蛋白。用用此方法纯化出来的SAA蛋白与采用同样技术纯化出来的未做突变氨基酸序列改变的SAA蛋白和采用同样技术纯化出来的未做突变氨基酸序列改变但优化了密码子的SAA蛋白分别校准已知系统，分析检出率和校准度，从而验证效能。2.3.2材料：克隆质粒pMD-18T；表达质粒pET32；DH5α感受态细胞；高速离心机；高压匀浆机；硫酸铵；NI柱。2.4前期研究基础：无3可行性分析3.1理论可行性：有研究表明，突变替换了天然SAA蛋白的4个氨基酸序列，可提高其体外稳定性，并且用其方法所得的蛋白最大可能的保持其活性，保留了天然SAA蛋白的抗原性［5］。也有研究发现，优化了密码子后所得的基因重组血清淀粉样蛋白SAA抗原活性较高［6］。3.2技术可行性：本课题难点在于定点突变技术突变目标氨基酸，基因工程以及蛋白质工程老师已经跟我们详细讲述，且我所在菲鹏生物股份有限公司对我们实习生采取了一对一导师制，遇到困难可寻求解题思路。后续构建原核表达载体诱导表达等，基因工程已亲自动手构建及纯化过，实操了几遍。技术上来说可行性高。3.3条件可行性：我所在平台--菲鹏生物股份有限公司专注于体外诊断原料和解决方案业务，是国内规模最大、综合实力最强的体外诊断原料供应商。本次课题所需的设备材料均来自菲鹏生物股份有限公司，设备完善，材料充足。还有一对一的导师从旁指导。4创新性分析创新点：本课题不同于以往只优化密码子的做法来制作校准品，而是采取采取突变氨基酸序列的方法来制作。突变SAA1的氨基酸序列，将SAA1的第60位氨基酸D突变为N、第71位氨基酸H突变为R，使其更接近SAA2的氨基酸序列，从而使校准品在校准系统时能同时把SAA1和SAA2检测出来，减少因两者间的差异导致的系统误差。5预期实验结果点突变后的SAA校准原料与抗体反应度强、稳定性高。原料用于测量系统，测量程序评