SMYA汤中当归的质量控制研究

SMYA汤中当归的质量控制研究SMYA汤中当归的质量控制研究【摘要】目的：对SMYA汤中当归的含量测定建立一种分析方法，测定汤剂中当归药材的质量标准。方法：选择高效液相色谱法（HLPC），色谱柱：WatersSunFireC18(250×4.6mm，5μm）；流动相：乙腈-0.085%磷酸（10:90）；流速：0.9ml/min；柱温：35℃；检测波长：316nm，对SMYA汤中当归主要成分阿魏酸作定性定量测定。结果：在线性范围为0.42372~84.744μg•ml-1内阿魏酸的浓度与峰面积呈良好线性关系，相关系数R为0.9999，加样回收率平均为100.7%，相对标准偏差为1.4%（n=9）。结论：所建立的高效液相色谱分析方法快速简便、准确、专属性强。【关键词】SMYA汤；当归；阿魏酸；HPLCTheQualityControlResearchofangelicasinensisinSMYAdecoction[Abstract]Objective:AnanalyticalmethodwasestablishedforthedeterminationofangelicasinensisinSMYAdecoction.Method:ThemaincomponentofangelicasinensisinSMYAdecoctionwasdeterminedbyhighperformanceliquidchromatography(HLPC).Chromatographiccolumn:WatersSunFireC18(250x4.6mm,5m);Mobilephase:acetonitrile-0.085%phosphoricacid(10:90);Flowrate:0.9ml/min;Columntemperature35℃;Detectionwavelength:316nm.Result:Theconcentrationofpaclitaxelhasagoodlinearrelationshipwiththepeakareainthelinearrangeof0.42372~84.744μg•ml-1.ThecorrelationcoefficientRwas0.9999,theaveragerecoverywas100.7%,andtherelativestandarddeviationwas1.4%(n=9).Conclusion:ThemethodofHPLCisrapid,simple,accurateandspecific.[Keywords]SMYAdecoction;angelicasinensis;Ferulicacid;HPLC目录引言 11文献综述 21.1选题依据及研究背景 21.2相关研究进展 31.3处方药材分析 32实验材料 42.1仪器 42.2试药 53SMYA汤中当归的含量测定 63.1色谱条件 63.2溶液的制备 63.3方法学考察 124讨论 134.1SMYA汤当归的含量测定指标的选择 134.2供试品制备溶剂的选择 134.3供试品制备提取方法和时间的选择 144.4结果分析 14结论 15参考文献 16致谢 17引言SMYA汤最早出现于《神医秘传》，由华佗编写，用来治疗“发于手足指趾之端，先疹后痛，甲黑后溃败，节节脱落”之症，后来被收录于清代《验方新编·卷二》，为中华民族流传悠久的名方[1-2]。本方由金银花、当归、玄参和甘草四味药组成，具有清热解毒、滋阴凉血、活血化瘀等功效。主治血栓闭塞性脉管炎（民间称为“脱疽”），后临床亦用其来治疗糖尿病和类风湿性关节炎引发的并发症、红斑狼疮、原发性血小板增多症，辅助治疗支气管扩张、动脉粥样硬化、心肌梗塞、高脂血症、高血压病，预防骨折术后的血栓形成等疾病3-8。由于SMYA汤是中国民间流传下来的古方，有千百年大量的临床经验和例子，现代医药学家对SMYA汤的研究大都是基于临床上的延伸治疗方向，缺乏对其质量标准的研究，对于其质量要求没有明确的指标，对其所使用的药材更是缺乏质量控制的研究，而药材的质量也影响着方剂对病症的治疗效果。由于当归的质量优劣受环境因素影响波动很大[9]，故本课题选取SMYA汤中当归作质量控制研究。通过建立新的高效液相色谱法，测定方中当归的主要成分阿魏酸含量，研究SMYA汤中当归的质量标准，为该方中当归药材的质量控制提供参考依据。1文献综述选题依据及研究背景血栓闭塞性脉管炎，亦称作脱疽、脉管炎、Buerger's病，其发病机制不明确，治疗较困难，有相关研究认为其发病与内皮功能障碍有关[10]。患者多为青壮年，尤其是有严重吸烟史的人。临床表现为：多发于下肢，病肢持续性或一时性苍白绀紫、灼热刺痛，皮肤颜色上举时变白，下垂时变红，后出现行走时小腿肌肉疼痛，脚趾麻木，停之则症状消失的现象；病情严重则出现足趾坏疽发黑、休息痛、间歇性跛行、游走性血栓性静脉炎等症状[11]。SMYA汤清热解毒，活血化瘀，可从根本上改善血栓闭塞性脉管炎所引起的症状，临床上主要用于治疗血栓闭塞性脉管炎。药材质量的优劣对方剂的疗效有很大的影响，而SMYA汤中当归的活血化瘀功能对治疗血栓闭塞性脉管炎有很大的影响，建立该方剂中当归可靠的质量标准，为SMYA汤疗效控制提供药材质量的依据。相关研究进展中药汤剂，以中医理论为指导，对药物进行浸泡或煎煮，去掉滤渣取药汁制成的液体剂型，是中国使用最早也是最广泛的剂型之一[12]。由于中药汤剂一般由多种药材混合煎制，有整体治疗等的特点，成分复杂，质量难以监控，不仅使汤剂的疗效带来不稳定性，而且给其临床使用带来很大的安全隐患[13-15]。处方中所用药材的优劣对其质量有很大的影响，在先进的分析技术的出来之前，人们对其处方质量控制皆靠肉眼辨别药材的形状来判断。随着科学发展，出现越来越多的简便、快速且准确的检验技术。Guang-HuaLu等[16]、NorikoShinjyo等[17]建立了当归药材的阿魏酸含量测定方法，并制定了阿魏酸的含量限度。ShijunShao等[18]运用HPLC法探索当归药材的有效成分。钱芳等[19]用薄层色谱法对方剂中药材进行定性鉴别，用高效液相色谱法测定其含量，从而研究解毒利湿合剂的质量标准。米文娟[20]采用了DNA分子鉴定技术为定性方法，HPLC法测定含量，研究砂仁质量标准。冯玉等[21]采用超高效液相色谱仪建立相关指纹图谱，测定所研究的汤剂中槲皮苷的含量，进行质量研究。缪红等[22]联合薄层色谱法、显微鉴别法和高效液相色谱三种方法，探讨大黄泻火散的质量标准。薄层色谱法、显微鉴别法、DNA分子鉴定法、HPLC和UPLC等先进技术的出现，推动了中药汤剂研究的发展，为其质量控制提供了科学技术保证。SMYA汤作为古老的中药汤剂，虽有丰富的临床经验基础，但其质量标准研究方面较缺乏，近年来已一些学者研究SMYA汤的质量控制。如李彩霞等[23]通过建立高效液相色谱特征图谱，对SMYA汤水提物进行质量控制及评价；卜洪鹏[24]运用薄层色谱法和高效液相色谱法对SMYA汤颗粒进行定性定量测定，为其颗粒的工艺制备提供质量标准。尚无研究对本方中药材进行质量标准的控制，建立其药材质量的科学检测方法，可为SMYA汤的疗效控制提供药材质量指标。处方药材分析SMYA汤具有显著的清热解毒效果，对血管炎症有良好的作用，且活血化瘀对血栓亦有一定的治疗效果，因而临床上主要用来治疗血栓闭塞性脉管炎。该处方由金银花、玄参、当归、甘草四味药构成，具有清热解毒、滋阴凉血、活血化瘀等功效。金银花因其主要发挥清热解毒功效，在该汤剂中作为君药；玄参滋阴解毒、泻火凉血，由于其与金银花结合能使清热解毒功效更为显著，故为臣药；当归活血滋阴，与玄参联合发挥养血滋补功效，故为佐药；甘草有清热解毒之效，同时可在药物中起到调和作用，故为使药[25-26]。以下是该汤剂药材功效成分概述：金银花性寒味甘，有清热解毒、宣散风热的效果，尤以清解血毒为所长。具有抗炎解毒、抑制病原微生物、抗氧化、抗血小板凝聚、提高人体免疫力等功效[27]。其主要化学成分为绿原酸类的有机酸化合物、黄酮类如木犀草苷、挥发油类等[28]。玄参清热解毒，滋阴凉血，主要用于咽炎、烦渴便秘、高血压等，具有镇痛、抗凝抗氧化、预防心脑血管疾病等作用[29]。玄参的有效成分为多糖类、苯丙素类、环烯醚萜类等[30]。当归性温味辛甘，补血、活血、滋阴，用于虚寒腹痛、血虚心悸、月经不调、腹痛便秘、风湿痹痛等症候。具有促进机体造血、镇痛抗炎、抗肿瘤、抗心血管疾病等作用[31-32]。当归有效成分为黄酮类、多糖类、有机酸例如阿魏酸和挥发油例如蒿本内酯等。甘草性平味甘，解表散热、益气补中、滋阴养血、润肺、除咽痛，具有抗病毒、抗癌、抗炎等功效。其主要化学成分为黄酮类化合物、三萜皂苷类[33]。2实验材料2.1仪器电子天平（JJ500型，常熟市双杰测试仪器厂）、万分之一天平（BSA224S-CW，德国sartorius）、超声波清洗仪（250w，40KHz，深圳市洁力特超声洗净设备有限公司）、液体加热器（FT-30H，500w，50Hz，深圳市正云科技有限公司）、低温冷却循环泵（DLSB-10L/20，巩义市予华仪器有限责任公司）、磁力搅拌水浴锅（HCJ-6D，常州澳华仪器有限公司）、高效液相色谱仪（LC-20AT）、色谱柱：WatersSunFireC18(250mm×4.6mm，5μm）。2.2试药甲醇，分析纯，广东光华科技股份有限公司，批号：20170929。阿魏酸对照品，中国食品药品检定研究院，批号：120927-201617；当归药材，批号：180501；金银花药材，批号：180601；甘草药材，批号：180601；玄参药材，批号：180404。药材均购自广州至信集团。3SMYA汤中当归的含量测定3.1色谱条件色谱柱：WatersSunFireC18(250×4.6mm，5μm）；流动相：乙腈-0.085%磷酸（10:90）；流速：0.9ml/min；柱温：35℃；检测波长：316nm。3.2溶液的制备3.2.1对照品溶液的制备精密称取阿魏酸对照品适量，置于50ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，即得含阿魏酸浓度为42.372ug·ml-1的对照品储备液。3.2.2SMYA汤的处方工艺制备称取金银花药材15.0g，玄参药材15.0g，当归药材10g和甘草药材5g，以上四种药材加水700ml，浸泡30分钟，煮沸，保持微沸30分钟，过滤，收集滤液。滤渣再加水700ml，煮沸，保持微沸30分钟，滤过，收集滤液。合并两次滤液，常压浓缩至体积低于500ml。冷却后，加水定容至500ml，即得SMYA汤全方。3.2.3供试品溶液的制备精密量取SMYA汤全方10ml，置具塞锥形瓶中，水浴蒸干，加入20ml甲醇，称定重量，超声30min，补足失重，滤过，取续滤液即得。3.2.3阴性对照品溶液的制备按照SMYA汤的处方工艺制备缺当归药材的阴性样品，按照3.2.3项下的方法制备阴性对照品溶液。3.3方法学考察3.3.1线性关系考察精密量取阿魏酸对照品溶液一定量于容量瓶中，用甲醇定容，分别制成浓度为0.42372、2.1186、4.2372、21.186、42.372、84.744ug/ml的系列浓度的标准溶液，按“3.1”色谱条件进行检测。以峰面积Y为纵坐标，浓度X为横坐标，得出阿魏酸对照品溶液的标准曲线，求得线性回归方程：Y=56492X-3079.3,相关系数R=0.9999。如以下表和图，结果显示阿魏酸对照品溶液在0.42372~84.744μg·ml-1的浓度区域内呈现出较好的线性关系。表1阿魏酸对照品溶液的回归方程、相关系数和线性范围回归方程相关系数R范围阿魏酸对照品Y=56492X-3079.30.99990.42372~84.744μg•ml-1图图1阿魏酸对照品溶液的线性图3.3.2专属性考察精密取阴性溶液、阿魏酸对照品溶液、供试品溶液各10μL，用“3.1”色谱条件进行进样分析，结果表明阴性溶液色谱图在阿魏酸对照品色谱图上无相对应的色谱峰出现，专属性良好。A为阴性溶液、B为阿魏酸对照品溶液、C为供试品溶液图2专属性考察色谱图3.3.3稳定性试验取同一份供试品溶液，按照“3.1”项色谱条件，分别在0、3、9、12、18、24h，测定供试品中阿魏酸的峰面积，得出结果如表2所示，24h以内阿魏酸在供试品溶液中保持稳定。表2阿魏酸稳定性试验结果时间/h039121824峰面积172821169900171718170646169036171396平均值170919.5RSD/%0.83.3.4精密度试验取2.3.2项下标准曲线中间点对应的对照品溶液，连续进样6次，进样量10µl，测定阿魏酸对照品的峰面积，结果见表3，计算出RSD为1.2%。结果表明该方法精密度良好。表3精密度试验结果编号123456峰面积172821171023172346166726171433171223平均值170928.6667RSD/%1.23.3.5重现性试验精密量取SMYA汤全方10ml，分别置6个具塞锥形瓶中，水浴蒸干，加入20ml甲醇，称定重量，超声30min，补足失重。精密吸取6个供试品溶液各10μL，按照“3.1”项色谱条件进行测定。结果见表4，重现性试验RSD为2.0%，试验方法重复性较好。表4重现性试验结果编号123456峰面积172821180236175187180324175109172358平均值176005.8333RSD/%2.03.3.6加样回收率试验精密量取SMYA汤全方5ml9份，置具塞锥形瓶中，水浴蒸干，分成低中高浓度三组，分别精密加入三个梯度量（分别为80%、100%、120%）的对照品，对照品浓度为42.372ug·ml-1，加甲醇20ml称定重量，超声30min，补足失重。各精密吸取10μL，按照“3.1”项色谱条件进行测定。结果见表5，回收率在98.0%~102.0%以内，RSD在0.2%~0.8%以内。表5加样回收率试验结果编号加入对照品体积/ml浓度ug·ml-1峰面积回收率%平均回收率%RSD%低浓度10.42.49137544101.96101.80.220.42.48137049101.6030.42.48137182101.70中浓度40.83.2418000498.5490.00.450.83.2718139099.2960.83.2618100999.08高浓度71.24.22235163101.96101.50.881.24.21234963101.8791.24.16231977100.603.3.7样品含量测定按照“3.2.2”项处方工艺制备SMYA汤全方6份，各精密量取10ml，分别置6个具塞锥形瓶中，水浴蒸干，加入20ml甲醇，称定重量，超声30min，补足失重。各精密吸取全方供试品溶液10μL，按照“3.1”项色谱条件进行测定。结果见表6，RSD为0.7%。表6样品含量测定结果全方-1全方-2全方-3全方-4全方-5全方-6平均值峰面积183559181378182482182669182446180054182098含量（ug/ml）3.303.273.283.293.283.243.28RSD/%0.74讨论4.1SMYA汤当归的含量测定指标的选择当归的有效成分有黄酮类、有机酸、挥发油、多糖类等。含量测定指标选择不仅要考虑其疗效的代表性，也要考虑提取难度、可检测性、稳定性等方面，挥发油类例如蒿本内酯，难以控制其稳定性，不易提取和制备供试品，而黄酮类和多糖类则没有有机酸类化合物容易提取。本课题选取有机酸类的阿魏酸作为当归含量检测指标，是因为阿魏酸是当归的有效成分之一，制备条件简单易行，且在制备工艺中能保持稳定。4.2供试品制备溶剂的选择其他实验条件相同的情况下，通过对比水、甲醇、乙醇、70%甲醇和50%甲醇5种不同溶剂所制备的供试品结果显示，以甲醇为提取溶剂效果更好，因而本实验选取甲醇作为供试品制备的溶剂。4.3供试品制备提取方法和时间的选择其他实验条件相同的情况下，对比回流提取15min、30min、45min和超声30min的不同提取方法和时间制备供试品结果显示，以超声30min为提取时间和方法效果更好，因而本实验选取超声30min作为供试品制备的提取方法和时间。4.4结果分析不同地理位置、气候差异和储存方法会对药材的有效含量产生很大的影响，有效含量的巨大差异会造成处方疗效不一，因此对药材质量的控制很有必要。在平行6份制备的样品含量测定结果看，所建立的该方法相对标准偏差小，较为准确，可为SMYA汤中当归的质量控制提供实验依据和参考。结论本实验通过建立新的高效液相色谱方法，测定SMYA汤中当归的含量，从而建立该汤剂中当归药材的质量标准。经过评估选择阿魏酸作为该汤剂中当归的含量测定指标，对实验的提取溶剂和提取方法时间作考察选择，并通过方法学考察证明，该实验方法具有较好的专属性、稳定性、重现性，制备工艺简便，检测方法快速、精确、可靠，可作为SMYA汤当归质量控制参考依据和评估标准。参考文献：[1]于红俊,孙文亮,左艳敏,李建秀.四妙勇安汤浅谈[J].光明中医,2014,29(10):2214-2215.[2]郑亮,王梦月,陈钟,李晓波.四妙勇安汤研究进展[J/OL].中成药:1-5[2019-02-26].[3]陈亚勇,于天启.四妙勇安汤加减治疗原发性血小板增多症的临床观察[J].中医临床研究,2018,10(32):107-108.[4]王旭.四妙勇安汤辨证加减治疗2型糖尿病合并痛风的疗效观察[J].双足与保健,2018,27(19):187-188.[5]刘三元.抵当汤合四妙勇安汤对髋关节周围骨折患者下肢深静脉血栓的预防作用分析[J].光明中医,2018,33(24):3678-3680.[6]张洁,李灵生,张琼.四妙勇安汤治疗支气管扩张症浅谈[J].实用药物与临床,2018,21(02):218-220.[7]李雨,黄瑞音,钟巍,陈芳,王红蕊,隗合坤.四妙勇安汤合抵当汤加减治疗老年无痛性急性非ST段抬高型心肌梗死临床研究[J/OL].河北中医,2019(01):31-35[2019-02-25].[8]刘佳,李中宇.李中宇教授运用四妙勇安汤加减治疗亚急性皮肤型红斑狼疮临床观察[J].辽宁中医药大学学报,2018,20(04):124-127.[9]王婕.当归药材的质量标准与道地性研究[D].兰州大学,2012.[10]Naomi.Idei,Kenji.Nishioka,Junko.Soga,etal.VascularFunctionandCirculatingProgenitorCellsinThromboangitisObliterans(BuergerʼsDisease)andAtherosclerosisObliterans[J].Hypertension,2011,57(1):70-78.[11]黄群,冷玉杰.四妙勇安汤治疗血管闭塞性脉管炎的临床中药学研究[J].中医药信息,2016,33(05):73-76.[12]孙守祥.中药汤剂的历史发展与未来改进探讨[J].时珍国药研究,1997(02):76-77[13]胡嫦娥.浅述中药制剂质量标准的制订[J].世界最新医学信息文摘,2018,18(41):176-177.[14]陆雪秋.中医古代传统制剂文献研究[D].中国中医科学院,2017.[15]郭友成,武小樱.试析中药汤剂在当前临床应用中面临的问题[J].医学信息(中旬刊),2010,5(12):3852-3853.[16]Guang-HuaLu,KelvinChan,KelvinLeung,Chi-LeungChan,Zhong-ZhenZhao,Zhi-HongJiang.AssayoffreeferulicacidandtotalferulicacidforqualityassessmentofAngelicasinensis[J].JournalofChromatographyA,2005,1068(2).[17]NorikoShinjyo,HiroyukiFuchino,NobuoKawahara,AtsuyukiHishida.Determinationof(E)-ferulicacidcontentintherootofAngelicaacutiloba:asimplechemicalevaluationmethodforcrudedrugqualitycontrol[J].JournalofNaturalMedicines,2018,72(3).[18]ZhenzhongWang,ShijunShao.EvaluationoftheQualityofAngelicasinensisbyHigh-PerformanceLiquidChromatography[J].AnalyticalLetters,2014,47(18).[19]钱芳,刘睿.解毒利湿合剂质量标准研究[J].现代中药研究与实践,2019(01):49-52.[20]米文娟.基于水煎液胃肠道代谢吸收的砂仁质量评价研究[D].北京中医药大学,2018.[21]冯玉,田宇柔,高乐,范帅帅,李军山,牛丽颖.合欢花饮片标准汤剂质量标准评价的建立[J/OL].中国现代中药:1-12[2019-02-26].[22]缪红,徐丹洋,苏健.大黄泻火散质量标准改进研究[J].中国药业,2018,27(23):19-23.[23]李彩霞,王翀,姜艳艳,刘斌.四妙勇安汤水提物HPLC特征图谱研究[J].北京中医药大学学报,2018,41(04):329-335.[24]卜洪鹏.四妙勇安颗粒制备工艺及其质量标准研究[D].山东中医药大学,2016.[25]黄玉欣,赫志强,柳祯,朱玲娟,张雪.四妙勇安汤中的