3.2基因工程的基本操作程序（第1课时）课件高二下学期生物人教版选择性必修3

第2节

基因工程的基本操作程序【本节聚焦】1.基因工程的基本操作程序主要包括哪几个步骤？2.基因工程操作的每一步涉及的技术和方法有哪些？第三章

基因工程从社会中来思考：1.你知道转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗？2.培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤呢？抗虫棉的培育过程2.基因表达载体的构建（核心）1.目的基因的筛选与获取3.将目的基因导入受体细胞4.目的基因的检测与鉴定抗虫基因Ti质粒重组DNA分子将目的基因插入染色体DNA中苏云金杆菌与载体拼接普通棉花（无抗虫特性）棉花细胞抗虫棉提取导入抗虫基因（Bt抗虫蛋白基因）重组DNA分子1.目的基因的筛选与获取2.基因表达载体的构建3.将目的基因导入受体细胞4.目的基因的

检测与鉴定(含抗虫基因）（含有并表达抗虫基因）从社会中来知识拓展：基因的结构基因1基因2基因3DNA片段放大基因通常是有遗传效应的DNA片段；能编码特定的蛋白质非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游能转录相应的mRNA，进一步编码（翻译）出蛋白质的DNA区段不能转录为相应的mRNA，不能编码蛋白质的区段不能转录为相应的mRNA，不能编码蛋白质的区段获取目的基因一般获取哪一部分的DNA片段？基因编码区知识拓展：基因的结构与RNA聚合酶结合位点RNA聚合酶识别并结合的位点，驱动基因转录出mRNA启动子终止子本质：位置：作用：是一段有特殊序列结构的DNA片段；位于基因上游；也是一段有特殊序列结构的DNA片段；位于基因下游；终止转录本质：位置：作用：启动子终止子非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游原核细胞的基因结构知识拓展：基因的结构编码区非编码区非编码区内含子外显子启动子终止子外显子：内含子：能转录相应的mRNA，进一步能编码蛋白质的DNA序列。能转录相应的mRNA，但却不能编码蛋白质的DNA序列，然后在翻译前就被剪切掉。真核细胞的基因结构知识拓展：基因的结构【总结】原核细胞与真核细胞的基因结构比较不能编码蛋白质的序列=

非编码区原核生物的基因：不能编码蛋白质的序列真核生物的基因：=非编码区+内含子原核细胞真核细胞不同点编码区是

的编码区是间隔的、

的相同点都由能够编码蛋白质的

和具有调控作用的

区组成的连续不连续编码区非编码一、目的基因的筛选与获取(1)概念：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。(2)实例：与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。主要指的是编码蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用的因子。1.目的基因资料：苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白（Bt抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。科学家将“杀虫基因”转入棉花中，棉花产生Bt抗虫蛋白抵抗虫害。目的基因那么，如何筛选目的基因呢？一、目的基因的筛选与获取2.目的基因的筛选：苏云金杆菌制成杀虫剂掌握目的基因的功能掌握目的基因的结构防治棉花害虫发现杀虫作用与Bt基因有关掌握Bt基因的序列深入了解Bt基因的表达产物(Bt抗虫蛋白)如何掌握？抗虫原理？

当Bt抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。思考：Bt抗虫蛋白会不会对人畜产生危害？Bt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体。Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因怎么获得？一、目的基因的筛选与获取测序技术序列数据库序列比对工具利用测序技术、序列数据库（如GenBank）、序列对比工具（如BLAST）等，找到合适的目的基因DNA测序仪核苷酸序列比对氨基酸序列比对美国国家生物信息中心测定核酸和蛋白质序列以碱基顺序或氨基酸残基顺序为基本内容的分子生物信息数据库把感兴趣的序列跟已经存在的序列数据库进行比较的工具。通过比对识别相关的序列，从而能获得目的基因和蛋白质的功能。拓展：掌握基因结构和功能的技术方法一、目的基因的筛选与获取利用PCR获取和扩增目的基因从基因文库中获取从生物组织中直接获取人工合成

前提：方法：DNA合成仪基因比较小、核苷酸序列已知通过DNA合成仪用化学方法直接合成（常用）3.获取目的基因常用的方法

先对目的基因进行扩增获取一个Bt基因之后，是否就该立即开始准备转基因操作？

抗虫基因快速获得大量抗虫基因苏云金杆菌提取PCR一、目的基因的筛选与获取4.利用PCR获取和扩增目的基因PCR是

的缩写。它是一项根据＿＿＿＿＿的原理，在

提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对

的技术。（1）PCR的概念：中文全称原理操作环境目的PCR扩增仪聚合酶链式反应DNA半保留复制体外目的基因的核苷酸序列进行大量复制PCR由穆里斯等人于1985年发明，为此，穆里斯于1993年获得诺贝尔化学奖。离心管一、目的基因的筛选与获取2.原理：DNA半保留复制，即在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。4.利用PCR获取和扩增目的基因一、目的基因的筛选与获取DNA复制的条件:原则:③能量：亲代DNA的两条链4种游离的脱氧核苷酸解旋酶、DNA聚合酶、DNA连接酶等由细胞代谢提供的ATP①模板：②原料：④酶：

碱基互补配对原则从子链的5'端向3'端延伸方向:特点:边解旋边复制、半保留复制

、多起点双向复制体外复制怎么改进体外用高温代替体外需用耐高温的DNA聚合酶子链合成需要引物

引物为DNA聚合酶提供了游离的3′端，使DNA聚合酶从3′端延伸子链。(DNA聚合酶不具有从头合成子链的功能)4.利用PCR获取和扩增目的基因一、目的基因的筛选与获取引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。3’5’DNA母链13’5’DNA母链23’5’引物13’5’引物2什么是引物？3’5’DNA母链13’5’DNA母链2引物可以是DNA单链，也可以为RNA单链，体内的DNA复制通常以RNA单链为引物体外（PCR）一般以DNA单链为引物用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸。引物结合在模板链的3’端一、目的基因的筛选与获取体内DNA复制参与的组分在DNA复制中的作用PCR中参与的组分解旋酶DNA母链4种脱氧核苷酸DNA聚合酶引物（通常为小的单链RNA）无需解旋酶，用高温代替DNA（目的基因）模板4种脱氧核苷酸(dNTP)耐高温的DNA聚合酶(Taq酶）引物（通常与两条模板链结合的2种为小的单链DNA）反应还需要其它条件，如缓冲液（一般添加Mg2+）、和控温设备打开DNA双链提供DNA复制的模板合成子链的原料催化合成DNA子链使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸(3)PCR的进行需要的条件4.利用PCR获取和扩增目的基因dNTP和ATP类似,不但可以提供原料还可以提供能量，无需添加ATP。根据目的基因两端的核苷酸序列设计引物,是利用PCR筛选和扩增出该目的基因的关键一、目的基因的筛选与获取(4)PCR反应的过程4.利用PCR获取和扩增目的基因一、目的基因的筛选与获取当温度超过_____以上时，

断裂，双链DNA解聚为两条

。

氢键单链DNA待扩增的DNA片段(1)变性：变性90℃3’3’5’5’3’5’3’5’不需要解旋酶思考：变性的温度为何是90℃以上的一个温度范围，而不是95℃？因为变性的温度与氢键的数量有关。当氢键数量越多时，所需温度就越高；反之，当氢键数量越少时，所需温度也就越低。(4)PCR反应的过程4.利用PCR获取和扩增目的基因一、目的基因的筛选与获取(4)PCR反应的过程4.利用PCR获取和扩增目的基因当温度下降

到左右时，

种引物通过

与两条单链DNA结合。

3’5’3’5’碱基互补配对引物15’3’引物25’3’(2)复性：50℃两由于DNA双链是反向平行的，所以需要两种引物思考：为什么需要引物？引物结合在模板链的什么位置？①因为Taq酶不能从0开始添加核苷酸。②引物结合在DNA模板链

3'端位置，引导子链从5'端→3'端方向复制。一、目的基因的筛选与获取(4)PCR反应的过程4.利用PCR获取和扩增目的基因当温度上升到____左右时，溶液中的4种_________在耐高温的_______________的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。

脱氧核苷酸DNA聚合酶72℃(3)延伸：(Taq酶)3’5’3’5’引物15’3’引物25’3’Taq酶3’Taq酶3’思考1：为什么温度要上升至72℃？思考2：Taq酶结合在引物的3’还是5’端？72℃是Taq酶的最适温度Taq酶结合在引物的3’端一、目的基因的筛选与获取耐高温的DNA聚合酶(Taq酶）4种脱氧核苷酸（dNTP）引物待扩增的DNA片段（模板）5’5’

变性

复性

延伸温度上升到90℃以上，双链DNA解聚为单链当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下合成新的DNA链。长度相同但C-G含量高的引物需要设定的复性温度较高(4)PCR反应的过程一、目的基因的筛选与获取(4)PCR反应的过程一、目的基因的筛选与获取①DNA分子有_____个②总链数_____条③不含引物的链数：___④含引物的链数_____⑤含引物1或2的链数：______⑥仅含引物1的DNA数：______⑦仅含引物2的DNA数：______⑧引物1、2均含有的DNA数：_____⑨不含引物的DNA数：______⑩需要引物的总数：______2n2n+122n+1-2循环n次：2n-1112n-202n+1-2★(4)PCR反应的过程PCR反应的过程动画：

利用PCR技术扩增目的基因，在第几轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段(即出现完整的目的基因)？占？2nDNA片段：引物数量：2n＋1－2第一轮循环的产物作为第二轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环的产物；第二轮循环的产物作为第三轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮的产物；第二轮循环的产物第三轮的产物完成以后，常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物PCR扩增仪2nDNA片段：引物数量：2n＋1－2受热变性引物

耐高温的DNA聚合酶PCR技术

(1)过程：(2)条件：DNA模板、分别与两条模板链结合的2种_______、四种______________、____________________。引物脱氧核苷酸耐高温的DNA聚合酶（3）结果：1个模板DNA分子经过n轮PCR，以_____方式扩增，可以扩增出

个DNA片段，共需要引物数量为

个。指数2n2n＋1－2【知识小结】一、目的基因的筛选与获取用PCR可以扩增mRNA吗？课本P79mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。1.逆转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA链，形成RNA-DNA杂交分子；2.核酸酶H降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链，使之变成单链DNA；3.以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子，即cDNAcDNA知识拓展：基因的结构编码区非编码区非编码区内含子外显子启动子终止子外显子：内含子：能转录相应的mRNA，进一步能编码蛋白质的DNA序列。能转录相应的mRNA，但却不能编码蛋白质的DNA序列，然后在翻译前就被剪切掉。真核细胞的基因结构一、目的基因的筛选与获取

利用PCR技术扩增目的基因，在第几轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段(即出现完整的目的基因)？5’3’5’5’第一次循环第二次循环3’5’第三次循环3’3’一、目的基因的筛选与获取5.PCR产物鉴定PCR过程可以在

中自动完成，完成以后，常采用

来鉴定PCR的产物琼脂糖凝胶电泳PCR扩增仪探究•实践——DNA片段的扩增及电泳鉴定(1)DNA片段的扩增①移液：用微量移液器依次将各组分加入微量离心管中。（注意：酶和缓冲液要在冰块上缓慢融化，用后置于-20℃冰箱中保存。酶和缓冲液一般分装成小份，避免反复融化导致活性降低甚至失活）②离心：待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率）③反应：参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。循环程序变性复性延伸预变性94℃,5min//30次94℃,30s55℃,30s72℃,1min最后一次94℃,1min55℃,30s72℃,1min

使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合预变性：三、实验步骤探究•实践——DNA片段的扩增及电泳鉴定①熔化：电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。②倒模:将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。③凝固:待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。（2）制备凝胶三、实验步骤探究•实践——DNA片段的扩增及电泳鉴定（3）进行电泳①加液：将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。②加样：扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。③电泳：接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳④观察鉴定:取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。三、实验步骤探究•实践——DNA片段的扩增及电泳鉴定三、实验步骤注意：1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。4.在进行操作时，一定要戴好一次性手套。5.PCR扩增不能随意加大试剂用量。探究•实践——DNA片段的扩增及电泳鉴定四、实验结果及分析评价[思考1]你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？

以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。进行电泳鉴定的结果应该是一条条带。[思考2]你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。①如果扩增不成功，可能的原因有：

漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。②如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：

引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；复性温度过低；DNA聚合酶的质量不好；模板DNA出现污染；Mg2＋浓度过高等。(1)用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列()(2)PCR体系中一定要添加从受体细胞中提取的DNA聚合酶()(3)PCR技术中，DNA模板链上碱基G和C的比例越高，DNA变性解链的温度就越高。()(4)PCR除需要耐高温的DNA聚合酶、解旋酶、4种脱氧核苷酸和DNA模板之外，还需要引物等基本条件。(

)解析：PCR不需要解旋酶的参与。(5)PCR的每一个循环都包括变性→复性→延伸三个步骤，延伸后的产物又可以作为下一个循环的模板。(

)√×√×√【基础过关】1.目的基因是否成功导入受体细胞，可以通过PCR等手段检测，下列关于DNA片段的扩增及电泳鉴定原理的叙述,正确的是 (

)A.在一定的pH条件下DNA分子可带上正电荷或负电荷B.带电DNA分子在电场的作用下会向着与它所带电荷相同的电极移动C.DNA分子在凝胶中的迁移速率与DNA分子大小、构象等有关,与凝胶等无关D.凝胶中的DNA分子直接可以在波长为300nm的紫外灯下被检测2.用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时,得到以下电泳图谱。其中1号为DNA标准样液(Marker),10号为蒸馏水,PCR时加入的模板DNA如图所示。据此作出的分析,错误的是 (

)A.PCR产物的分子大小在250～500bp之间

B.3号样品为不含目的基因的载体DNAC.9号样品对应植株不是所需的转基因植株

D.10号确定反应体系等对结果没有干扰ABDNA分子需要经过染色大本P82课堂小结课堂练习PCR无需解旋酶，用高温代替1.下列有关体内DNA复制与PCR技术比较的叙述，错误的是A.二者子链的延伸方向相同，均为5′端→3′端B.二者均需要解旋酶破坏氢键来实现解旋C.体内DNA复制需要能量，PCR反应也需要能量D.二者遵循的碱基互补配对原则相同√课堂练习7/82.下图表示利用PCR技术扩增目的基因的部分过程，其原理与细胞内DNA复制类似。下列叙述错误的是A.耐高温的DNA聚合酶总将游离的脱氧核苷酸连接到3′端B.在第三轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段C.引物之间或引物自身发生碱基互补配对，则不能有效扩增目的基因D.从理论上推测，第三轮循环产物中含有引物A的DNA片段占3/4√思考：能不能直接将目的基因导入受体细胞，为什么？如果不能，如何避免该结果的发生呢？

①游离的DNA进入细胞后，一般会直接被分解。

②就算没有被破坏且能进行转录和翻译，游离的DNA也无法跟着细胞分裂进行复制，导致子代细胞中不再含有目的基因。核心工作——基因表达载体构建二、基因表达载体的构建1.目的：2.基因表达载体的组成：（1）使目的基因在受体细胞中稳定存在，且可以遗传给下一代；（2）使目的基因能够在受体细胞中表达和发挥作用。思考：各个元件有什么作用？二、基因表达载体的构建目的基因：能控制表达所需要的特殊性状启动子：位置：基因的上游功能：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。复制原点：DNA复制的起始位点终止子：位置：基因的下游功能：终止转录标记基因：便于重组DNA分子的筛选和鉴定。2.基因表达载体的组成：（启动子=起始密码?）（终止子=终止密码?）辨析：“启动子与终止子”和“起始密码子与终止密码子”启动子与终止子位于DNA分子中