高三二轮复习生物：限制酶课件

基因工程的工具限制酶近7年天津高考限制酶选择考情表（2019-2025）年份题号核心考查内容分值估计2019​第9题酶切位点识别、双酶切结果分析（防自连、定向连接）2-4分2020​第16题双酶切应用原理（SacI&XbaI）、酶切片段数计算​2-3分2021​第16题PCR引物中引入酶切位点（BamHI）、双酶切确保方向​2-3分2022​第15题PCR引物引入新酶切位点（XhoI）以优化载体/组装基因​2-4分2023​第17题​服务于同源重组与Cre-loxP系统的载体构建基础基础支撑2024​第16题同源重组敲除实验：选择酶（SacII&EcoRI）构建打靶载体3-5分2025​第16题无缝克隆：PCR引物引入EcoRI&NotI位点实现精确组装2-3分1.通过构建模型，突破限制酶的选择这一重难点。2.通过分析典型例题，归纳总结不同类型题的解决方案。学习目标限制酶产生的一.相同的末端二.不同的末端三.互补的末端主要内容问题1.将GDNF基因插入质粒中选择什么限制酶？XhoI问题2.用DNA连接酶连接后有几种连接产物？分别是哪几种？4种，载体自连、GDNF基因自连GDNF基因正向连接、GDNF基因反向连接、一.相同的末端(2023·山东，T25)(1)如图构建重组质粒后，为了确定J

基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行

，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物________________。F1和R2(或F2和R1)PCR技术检测若

，则说明J

基因连接到质粒中且插入方向正确；若

，则说明J

基因未连接到质粒或反接。有扩增产物无扩增产物问题4.要保证目的基因正向连接，用什么方法判断呢？问题3.正反接后基因转录出来的mRNA的关系是？互补5’3’F1R1（2025·山东卷，T25）选用图中的SmaI对抗除草剂基因X进行完全酶切，再选择SmaI和_________对Ti质粒进行完全酶切，将产生的黏性末端补平，补平时使用的酶是________。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接，构建重组载体，转化大肠杆菌。二.不同的末端工程目标：将抗除草剂基因X插入T-DNA中问题1.选用图中的SmaI对抗除草剂基因X进行完全酶切，再选择SmaI和______对Ti质粒进行完全酶切？XbaI或者PstI方案一：SmaI和XbalSmaI方案二：SmaI和PstlSmaI5’3’问题2.比较两个方案的异同？相同点：都有一个粘性末端和平末端不同点：XbaI切割后露出3’端PstI切割后露出5’端5’3’GATC问题3.将产生的黏性末端补平，补平时使用的酶是________。DNA聚合酶将单个脱氧核苷酸添加到子链3’端

╳不能延伸3’GATC

╳不能延伸问题1.选用图中的SmaI对抗除草剂基因X进行完全酶切，再选择SmaI和_____对Ti质粒进行完全酶切？XbaI5’1.限制酶切割位点靠近5’端，粘性末端。末端补平规律2.限制酶切割位点靠近3’端，粘性末端。可以补平不可以补平课堂练习1.选用图示中SmaI对基因X进行完全酶切，再选择SmaI和①对Ti质粒进行完全酶切，将产生的黏性末端补平，补平时使用的酶是②。利用③将酶切后的基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接，构建成重组载体。正确是（

）D注：LB/RB：T-DNA的边界序列选项①②③AKpnIDNA聚合酶DNA聚合酶BBamHIDNA聚合酶DNA连接酶CSpeIDNA连接酶DNA聚合酶DSpeIDNA聚合酶DNA连接酶（2023·天津卷，T17）②在后续插入酶Ⅱ基因时，为继续利用URA3作为筛选标记，需切除菌株1的URA3。为此设计表达载体时，还应向URA3两端引入酿酒酵母基因组中不存在的同源区段C和C´,并以下图方式

排列才能通过同源重组达到上述目的。三.互补的末端工程目标：用同源区段C、C´敲除URA3基因。资料：Cre-LoxP系统是一种由Cre重组酶和LoxP位点组成的位点特异性重组的基因编辑技术。Cre酶来源于P1噬菌体，特异性识别loxP，催化DNA链切割与重连。LoxP序（34bp）结构为13bp反向重复+8bp核心间隔+13bp反向重复；作用：反向重复区是Cre结合位点；8bp间隔区决定loxP方向，直接影响重组。5’-ATAACTTCGTATA-GCATACAT-TATACGAAGTTAT--ATAACTTCGTATA-GCATACAT-TATACGAAGTTAT-3’3’-TATTGAAGCATAT-CGTATGTA-ATATGCTTCAATA--TATTGAAGCATAT-CGTATGTA-ATATGCTTCAATA-5’待敲基因LoxP序列LoxP序列决定loxP方向决定loxP方向同向排列

Cre酶结合位点

Cre酶结合位点

Cre酶结合位点

Cre酶结合位点三.互补的末端反向排列下面请大家观看同学们带来的

话剧：《方向决定命运：loxP的编辑密码》结论：同向敲除，反向倒位三.互补的末端（2023·天津卷，T17）②在后续插入酶Ⅱ基因时，为继续利用URA3作为筛选标记，需切除菌株1的URA3。为此设计表达载体时，还应向URA3两端引入酿酒酵母基因组中不存在的同源区段C和C´,并以下图方式

排列才能通过同源重组达到上述目的。2三.互补的末端条件1：如果loxp序列位于1条染色体上，两个loxP同向。结果：基因敲除（最常用）条件2：如果loxp序列位于1条染色体上，两个loxP反向。

结果：倒位属于哪种变异呢？染色体结构变异属于哪种变异呢？染色体结构变异归纳：拓展问题

：

如果loxp序列位于两个DNA分子(2条染色体)上，结果是怎样的呢？（仅考虑两个loxP同向）属于哪种变异呢？情境1：如果loxp序列位于2条同源染色体的非姐妹染色单体上。情境2：如果loxp序列位于2条非同源染色体上。基因重组属于哪种变异呢？染色体结构变异结果：互换（同源染色体上的非姐妹染色单体）结果：易位（非同源染色体上的片段互换）1.不破坏目的基因,保留启动子、终止子、复制原点原则、标记基因（标记基因有两个可以破坏其中一个）。2.质粒上的酶切位点只位于启动子和终止子之间。3.善用“双酶切”。4.巧用“同尾酶”。5.农杆菌转化法中，酶切点应该位于Ti质粒的T-DNA内部。

限制酶选择的要求如图所示，a链为转录模板链，为保证基因N与质粒pYL正确连接，需在引物1和引物2的5'端分别引入________和________限制酶识别序列。1.（2025·辽宁卷，T25）XhoIXbaI四、典题感悟XhoIXbaI与SpeI同尾酶

2.某真茵的w基因可编吗一种高效降解纤维素的酶，已知图中w基因转录方向为从左往右，为使放线菌产生该酶，以图中质粒为载体，进行转基因。不同限制酶的识别序列及切割位点如下表所示。请回答下列问题:应使用限制酶

切制图甲中质粒，使用限制酶

切制图乙中含W基因的DNA片段，以获得能正确表达W基因的重组质粒。EcoRI,HindIIIMfel、HindIII3．Cre酶是一种重组酶，LoxP是能被Cre酶识别的特异DNA序列。Cre/LoxP重组酶系统能够实现特异位点的基因敲除、基因插入等操作。一般而言，当一条DNA链上存在两个相同的LoxP序列且方向相同时，Cre酶能有效切除两个位点间的DNA序列，如图所示。下列说法正确的是（）A．Cre酶能将两个核糖核苷酸之间的磷酸二酯键断开B．启动子能启动绿色荧光基因翻译荧光蛋白的过程C．当有两个相同的LoxP序列时Cre酶就能有效切除一个D．无Cre酶存在的细胞因STOP的作用而无法发出荧光D脱氧核糖核苷酸需满足两个LoxP序列方向相同转录4.(2025安徽）经筛选获得一株内生放线菌，该菌株高效合成铁载体小分子，能辅助内生放线菌吸收铁离子。R基因是合成铁载体的关键基因之一。科研小组构建R基因敲除株，探究铁载体的功能。主要步骤如下：首先克隆R基因的上游片段R-U和下游片段R-D；然后构建重组质粒；最后利用重组质粒和内生放线菌DNA片段中同源区段可发生交换的原