耐高温解磷菌在中低品位磷矿堆肥过程中的磷活化效果研究

耐高温解磷菌在中低品位磷矿堆肥过程中的磷活化效果研究学生：刘小燕指导老师：刘爱玲鲁耀雄(湖南农业大学生物科学技术学院，长沙410128)摘要：湖南省中低品位磷矿资源丰富，但中低品位磷矿很难直接在农业上充分利用，为了较好利用中低品位磷矿资源，减少化学磷肥在农业上面的应用。本研究通过耐高温解磷真菌AspergillusnigerF4的固体发酵载体、碳源和氮源的优化制备解磷菌剂，并将制成活磷功能的堆肥促腐微生物菌剂应用到添加中低品位磷矿好氧畜禽粪便堆肥中，测定细菌、真菌、放线菌和解磷菌的影响及含水量、pH和有效磷的变化，并初步探讨了AspergillusnigerF4堆肥磷活化效果及作用机理。结果表明，AspergillusnigerF4以24%的谷壳和48%稻草粉为栽体、6%葡萄糖为碳源和6%蛋白胨为氮源可以制得1.534✖1011个/g的解磷菌剂，添加AspergillusnigerF4解磷菌剂与地衣芽孢杆菌剂制成的活磷功能的堆肥促腐微生物菌剂应用好氧畜禽粪便堆肥中，pH呈现两次先增加后降低的趋势；细菌、放线菌和解磷菌数先增加后降低，真菌数一直降低；含水量先增加后降低；而有效磷一直在增加；模拟堆肥20天时，矿质磷效果最好，此时AspergillusnigerF4为1.1✖107个/g，有效磷含量为2566.346g/kg，相比对照活磷效果提高了8.44%。因此，通过AspergillusnigerF4固体发酵制备菌剂配比堆肥菌剂添加到堆肥中，可以有效活化中低品位磷矿的矿质磷，生产具有较高有效磷含量的特色有机肥，减少化学磷肥的施用。关键词：中低品位磷矿；AspergillusnigerF4；畜禽粪便堆肥；pH；有效磷StudyonPhosphorusActivationEffectofPhosphorus-resistantBacteriaintheProcessofMiddleandLowGradePhosphorusCompostingStudent:LiuXiaoyanTutor:LiuAilingLuYaoxiong(CollegeofBioscienceandBiotechnology,HunanAgriculturalUniversity,Changsha410128,China)Abstract:Hunanprovinceisrichinmiddleandlowgradephosphate,butitisdifficulttomakefulluseofmiddleandlowgradephosphatedirectlyinagriculture.Theeffectofbacteria,fungi,actinomycetesandphosphorus-reducingbacteriaandthechangesofwatercontent,pHandeffectivephosphorusweredeterminedbyoptimizingthesolidfermentationcarrier,carbonsourceandnitrogensourceAspergillusnigerF4thephosphorus-resistantfungi.activationeffectandmechanismofAspergillusnigerF4compostphosphorus.TheresultsshowedthatAspergillusnigerF4using24%shelland48%strawpowderastheplant,6%glucoseasthecarbonsourceand6%peptoneasthenitrogensource,1.534✖1011gphosphorus-reducingbacteriaagentscouldbeprepared.Thenumberofbacteriaandphosphorusreducingbacteriaincreasedfirstandthendecreased,thenumberoffungidecreasedallthetime;thewatercontentincreasedfirstandthendecreased;andtheeffectivephosphorusincreasedallthetime;theAspergillusnigerF4was1.1✖107/g,effectivephosphoruscontentwas2566.346at20daysofsimulatedcomposting,andtheeffectofactivephosphoruswas8.44%higherthanthatofcontrol.Asaresult,byaddingAspergillusnigerF4compostmixturetothecompost,themineralphosphorusofmediumandlowgradephosphatecanbeactivatedeffectivelytoproducehigheffectivephosphorus.contentofcharacteristicorganicfertilizertoreducetheapplicationofchemicalphosphorusfertilizer.Keywords:Mediumandlowgradephosphate；AspergillusnigerF4；Livestockmanurecompost;pH;Effectivephosphorus1前言研究目的和意义磷是构成植物体内许多重要化合物的成分，在植物体内积极参与各种代谢，还能提高植物的抗逆性和对外界环境的适应性，在农作物生产上需要补充磷肥促进作物的生长和增产。磷肥主要是通过磷矿石获得，磷矿石资源属于不可再生资源，在中国仅能用一百年，其稀缺特性日益显现。根据磷矿的品级划分，磷矿品位(P2O5含量)>30%的磷矿为Ⅰ级磷矿，即高品位磷矿，25%<P2O5<30%为Ⅱ级磷矿，12%<P2O5<25%为Ⅲ级磷矿石。中国磷矿石品位普遍较低，只有大约10%的磷矿品位超过30%，约90%的磷矿为品位小于25%的中低品位磷矿[1]。高品位磷矿石一般不需经过选矿工艺，即可用于生产磷酸，继而生产磷肥产品，而中低品位磷矿必须经过选矿工艺提高品位，才能用于生产磷酸与高浓度磷基肥料[2]。因此，充分利用中低品位磷矿，是我国磷资源可持续高效利用的关键。长期以来，中低品位磷矿利用在工业上存在成本大、耗能高、产生大量尾矿污染环境等问题。因此，有关专家开始致力于将中低品位磷矿直接应用于农业的研究[3]。中低品位磷矿在农业上直接利用，可避免选矿富集的工艺过程，减少选矿过程中造成的磷损失，大幅度降低生产成本和生产难度；明显改善由于选矿产生的尾矿堆积造成的环境问题；显著降低能耗，延长我国磷矿的使用年限[4]。同时，还可以使中低品位磷矿中的镁、钙、铁等中微量元素得到充分利用，减少资源浪费[4]。但中低品位磷矿直接应用于农业，存在有效磷含量较低、农学效率低下这两个问题；而且活化磷肥由于具有较强的抗固定能力和较高的连续供磷能力，对农作物有较高的肥效[5]，因此如何活化利用中低品位磷矿中的难溶性磷，是我们在提高中低品位磷矿农业应用效率上亟待解决的问题。目前活化中低品位磷矿中的难溶性磷有两种方法：化学法和生物法。化学法主要利用磷矿粉与硫酸直接反应生产过磷酸钙或者加二氧化硅高温煅烧生产钙镁磷肥，生物法主要利用解磷微生物（如解磷巨大芽孢杆菌、黑曲霉、草酸青霉和根霉等）来活化磷矿中的难溶性磷，提高土壤中的磷素，供作物能吸收和利用。化学法存在能耗高、污染严重等问题。而赵鑫等[3]提出生物活化是中低品位磷矿资源高效利用的重要途径；微生物溶磷技术为我国中低品位磷矿的利用开辟了一条新的途径[6]。因此，如何利用高效的解磷微生物活化中低品位磷矿中的难溶性磷是我们未来生产磷肥的发展方向。堆肥是实现农业废弃物资源化利用的主要处理方法之一，大量研究表明，在堆肥中添加中低品位磷矿、过磷酸钙和鸟粪石可以降低堆肥过程中的氨气挥发损失，提高堆肥产品的品质，同时耐高温解磷微生物菌在堆肥过程中产生的有机酸类物质[7]，对难溶性磷具有较强的溶解能力[8-10]，可以起到活化中低品位磷矿中难溶性磷的作用。由于堆肥产品中有机酸含量过高对作物的生长发育具有毒害作用，堆肥产品中有机酸含量是其腐熟的重要指标之一，致使堆肥过程对难溶性磷转化效率受到限制。在畜禽粪便堆肥过程中，当堆肥温度达到25℃以上时，黑曲霉能快速生长，并产生大量的纤维素酶，将堆肥原料中难以分解的纤维素降解为单糖，从而为其他细菌生长提供碳源。黑曲霉在堆肥早期对升温有明显效果，可能是由于黑曲霉菌剂中有大量未萌发的孢子，孢子在堆肥系统中萌发产生热量导致升温加速，从而加快堆肥进程。因此，为提高中低品位磷矿中在堆肥中应用，湖南省农业环境生态研究所从土壤中筛选出一株具有耐高温的解磷真菌AspergillusnigeF4，在45℃的温度条件下能够生长较好，希望能够将其配比堆肥菌剂应用到利用中低品位磷矿的堆肥中，在减少氨气挥发损失的同时，能够起到活化难溶性无机磷、提高堆肥产品品质的作用。本文对耐高温解磷真菌AspergillusnigeF4在堆肥过程中对细菌、真菌、放线菌和解磷菌的影响及含水量、pH和有效磷的变化进行了研究，以期为耐高温解磷真菌在堆肥中的进一步研究和应用提供参考。1.2国内外研究现状解磷菌是一种特殊微生物功能类群，它可以溶解土壤中的难溶性磷，让植物得以吸收并利用[11]。土壤中有很多具有解磷能力的根际微生物，主要有肠杆菌属（Enterobacter）、芽孢杆菌属（Bacillus）、固氮菌属（Azotobacter）、节杆菌属（Arthrobacter）、假单胞菌属（Pseudolnonas）等[12]。解磷的芽孢杆菌属中，主要是枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、阿氏芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等[13]。唐岷宸等[13]筛选出的X-P18菌株为贝莱斯芽孢杆菌，其解磷量为495.4mg/L，属于芽孢杆菌，其解磷功能相比于国内外报道的其他解磷菌在相同解磷条件下较高。美国农业部的专家们曾在苏联引进巨大芽孢杆菌，发现这种细菌很容易溶解难溶性的石灰性磷酸盐，在西红柿田地中施用该肥料，能使其产量增加7.5%[14]。李文谦等[15]发现通过使用解磷菌来溶解磷矿粉产生可溶磷，在目前看来能够改善磷元素缺乏地区作物生长情况，提高作物的产量。SPerber等[16]检测出溶磷细菌所产生的各种有机酸，如乳酸、轻基乙酸、延胡索酸、唬拍酸等。他从土壤中分离得到的细菌中有半数以上能生长在以难溶性磷酸盐为唯一磷源的培养基上，且溶磷细菌培养基pH明显下降，认为这是细菌产酸的结果，同时也发现解磷微生物在根际的数量远远大于其在周围土壤中的数量，这可能与根际磷素消耗较快有关[17]。对曲霉的溶磷也有一些研究报道，Cerezine和Nahas等报道了液体培养过程中，随着黑曲霉菌丝体的生长，不溶性磷酸盐的溶解能力增加。王雪等[18]从土壤中分离出一株黑曲霉A2对磷矿粉的溶解能力达195mg/L，Ogbo[19]从腐烂的木薯(Manihotesculenta)中分离出一株黑曲霉对磷酸钙的溶解能力为47mg/L。Vassilev等[20-22]用甜菜残渣作培养基研究了黑曲霉对矿物磷酸盐的溶解，也发现矿物磷酸盐随着时间增加而溶解能力增加，最高达292μgPml-1。赵霞发现黑曲霉解磷复合功能菌剂组合中，不同比例的菌株组合，其解磷效杲差异显著。且复合功能菌剂中不同菌株之间会产生拮抗作用和协同作用[23]。尹瑞龄等发现将磷矿粉与有机废弃物堆肥处理，利用溶磷微生物的溶磷作用，促使磷矿粉中的难溶性磷转化为有效磷，是一种直接利用磷矿粉，提高磷肥利用率的一条行之有效的生物学途径[24]。有研究发现黑曲霉草炭堆肥对玉米均表现出不同程度的增产效果：黑曲霉7465在长岭试验点比单施草炭增产20.32%，比不接菌对照增产11.03%[25]。1.3黑曲霉简介1.3.1黑曲霉概述黑曲霉是曲霉属真菌中的常见种，在泥土、粮食和植物性产品中分布广泛。在局温、局湿环境下，黑曲霉容易大量生长繁殖，产酶生热，对紫外线及臭氧的耐性强，是一类菌丝发达，多分支，有多核的多细胞真菌[26]。黑曲霉属于子囊菌亚门丝孢目丛梗孢科。直径约15～20pm，长约1～3mm，壁厚而光滑。顶部形成球形顶囊，上面全面覆盖着一层梗基和一层小梗，小梗上带有一成串褐黑色的球状物，直径在2.5μm到4.0μm。分生孢子头呈球状，直径在700～800μm，呈褐黑色。黑曲霉菌繁衍速度非常快，一开始为白色，然后变成鲜黄色直至呈黑色厚绒状，背面无色或中央略带黄褐色。分生孢子头褐黑色放射状，分生孢子梗长短不一。顶囊球形，双层小梗。分生孢子褐色球形。广泛分布于世界各地的、性产品和中。是重要的发酵工业菌种。有的菌株还可将羟基孕甾酮转化为雄烯。生长适温37℃左右，最低相对湿度为88%，能引致水分较高的粮食霉变和其他工业器材霉变。菌丛呈黑褐色，顶囊大球形，小梗双层，分生孢子为球形，呈黑、黑褐色，平滑或粗糙。分生孢子梗由特化了的厚壁从膨大的菌丝细胞（足细胞）上垂直生出；分生孢子头状如“菊花”。黑曲霉的菌丝、孢子经常呈现各种颜色，如：黑、棕、绿、黄、橙、褐等，菌种不同，颜色也不同。黑曲霉具有发酵条件简单易控、代谢旺盛、生长周期短、产酶丰富、不产生毒性物质等优点，在食品发酵、畜牧及医药等行业均得到普遍应用。广泛分布于土壤、空气和谷物上，可引起食物、谷物和果蔬的霉腐变质，有的可产生致癌性的黄曲霉毒素。黑曲霉在发酵工业中主要用于生产淀粉酶、酸性蛋白酶、纤维素酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、柠檬酸、葡萄糖酸和没食子酸等。在食品工业上用作发酵菌种，如用于食醋生产制曲、麸曲法白酒生产制曲、柠檬酸发酵等，主要是利用此黑曲霉分泌产生淀粉酶、糖化酶、柠檬酸、葡萄糖酸、五倍子酸等的功能；在生物肥料工业上，黑曲霉具有裂解大分子有机物和难溶无机物，便于作物吸收利用，改善土壤结构，增强土壤肥力，提高作物产量的效果。是制酱、酿酒、制醋的主要菌种。是生产酶制剂（蛋白酶、淀粉酶、果胶酶）的菌种。生产有机酸（如柠檬酸、葡萄糖酸等）。农业上用作生产糖化饲料的菌种。可用来测定锰、铜、钼、锌等微量元素和作为霉腐试验菌。干酪成熟中污染会使干酪表面变黑、变质，对奶油也会产生变色。在高温、高湿环境下，黑曲霉容易大量生长繁殖产酶生热。1.3.2黑曲霉溶磷原理分泌质子(H+)是微生物分解难溶性磷的一个重要机制。一些研究表明，解磷微生物的解磷量和培养液的pH密切相关[27]。Asea等[28]研究发现，在石灰性土壤中，Penicilliumbilaji和Penicilliumcf.fuscum这两株青霉菌只有当NH4+存在时才能分解无机磷酸盐，且解磷量与pH的下降密切相关。以NH4+为唯一氮源时，培养介质的pH明显比以NO3-为氮源时的低，且解磷量前者要比后者高出许多。有研究表明桔灰青霉菌(Penicilliumaurantiogriseum)在分解钙磷酸的过程中并不分泌有机酸，而是通过吸收钙离子使磷酸根从钙磷酸盐中释放出来[29]。随后的研究表明，黑曲霉(Aspergillusniger)、简青霉(Penicilliumsimplicissimum)和桔灰青霉(Penicilliumaurantiogriseum)主要是通过同化NH4+释放质子降低微域pH，以此来增加磷酸盐的分解效率。有研究表明，黑曲霉(Aspergillusniger)、简青霉(Penicilliumsimplicissimum)和桔灰青霉(Penicilliumaurantiogriseum)主要是通过同化NH4+释放质子降低微域pH，以此来增加磷酸盐的分解效率。2实验材料和实验设计2.1实验材料2.1.1菌种来源供试黑曲霉菌株是湖南省农业环境生态研究所从土壤中筛选出的一株具有耐高温的解磷真菌AspergillusnigeF4，地衣芽孢杆菌4-22是湖南省农业环境生态研究所从土壤中筛选出来，现保藏在湖南省农业环境生态研究所实验室；采用山东长泰生物科技有限公司生产的EM菌，2.1.2实验仪器摇床NBS公司INNOVA43；电子天平HANGPING-YP2001N；双人超净工作台YJ-1700A；高压蒸汽灭菌锅YXQ；生化培养箱LRH-250；紫外可见分光光度计岛津UV-2600；pH计pHC-2A；烘箱XFM020；光学显微镜BM1000；容量瓶；三角瓶；一次性培养皿。2.1.3培养基的配制 （1）牛肉膏蛋白胨培养基（用于细菌培养）牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，琼脂20g，水1000mL，pH7.4～7.6。121℃湿热灭菌30min。（2）高氏1号培养基（用于放线菌培养）可溶性淀粉20g，KNO31g，NaCl0.5g，K2HPO4•3H2O0.5g，MgSO4•7H2O0.5g，FeSO4•7H2O0.01g，琼脂20g，水1000mL，pH7.4～7.6。121℃湿热灭菌30min。配制时注意：可溶性淀粉要先用冷水调匀后再加入以上培养基中。（3）马丁氏培养基（孟加拉红培养基，用于真菌培养）KH2PO41g，MgSO4•7H2O0.5g，蛋白胨5g，葡萄糖10g，1/3000孟加拉红水溶液100mL，琼脂20g，水900mL，自然pH，121℃湿热灭菌30min。待培养基融化后冷却55～60℃时加入链霉素(链霉素含量为30μg/mL)。（4）蒙金娜培养基（无机磷培养基，用于解磷菌培养）葡萄糖10.0g，硫酸铵0.5g，氯化钠0.3g，硫酸镁0.3g，硫酸锰0.03g，硫酸钾0.3g，硫酸亚铁0.03g，磷酸钙10.0g，氯化钾0.3g，琼脂20.0g，pH7.2±0.2(25℃)。115℃湿热灭菌15min。（5）PDA固体培养基（黑曲霉菌种活化培养基）马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，自然PH。配制方法是先将马铃薯洗净去皮，再称取200g马铃薯切成小块，加水煮烂(煮沸30分钟，能被玻璃棒戳破即可)，用八层纱布过滤，加20g琼脂，加入葡萄糖，搅拌均匀，稍冷却后再补足水分至1000毫升，分装到锥形瓶中，加塞、包扎，115℃灭菌20分钟左右后取出摇匀倒培养基，冷却后在37℃恒温培养箱培养24h，无菌生长方可使用。2.1.4实验试剂0.5mol/LNaHCO3溶液（pH＝8.5）：取42.0gNaHCO3至烧杯中，加800ml蒸馏水稀释，搅拌混匀，用NaOH溶液调节pH至8.50（用pH计测定），加水定容至1L，贮存于聚乙烯瓶中，贴好标签，注明液体名称浓度和配置时间。钼锑抗溶液：向400ml蒸馏水中缓慢加入153ml2mol/L硫酸（H2SO4），搅拌、冷却。另取10.0g钼酸铵溶于300ml约60℃的水中，冷却。然后将硫酸溶液缓慢滴入钼酸铵溶液中，搅拌，再加入100ml0.5%酒石酸氧锑钾溶液[K(SbO)C4H4O6·1/2H2O分析纯]，最后用水定容至1L，贮存于棕色试剂瓶中，贴好标签，注明液体名称浓度和配置时间。钼锑抗试剂：取1.5g左旋抗坏血酸（C6H8O6）溶于100ml钼锑抗溶液中，贮存于棕色试剂瓶中，此液需现配现用，如颜色由浅黄变为棕黄，则倒掉重新配制。0.1mg/mL磷标准溶液的配制：取KH2PO4（分析纯）在烘箱中80℃干燥2小时，冷却后精确称量0.2g，用蒸馏水定容至50ml，即为lmg/ml的标准磷溶液。测定时取10ml于100ml容量瓶中，加蒸馏水定容，即为0.1mg/ml的稀释液，用钼锑抗比色法[30]测定溶液的可溶性磷含量。2.1.5菌种的复活、培养和菌剂的制备实验所用的菌种是湖南省农业环境生态研究所从土壤中筛选出一株具有耐高温的解磷真菌AspergillusnigeF4，在实验开始前将冷藏的菌株接种到马铃薯培养基平板上，至于30℃恒温培养箱中培养4d，活化后的菌株用于试验。将培养基上的菌种用100ml无菌水刮洗到三角瓶中，制成实验所需的黑曲霉菌剂。实验室中保藏有其他两种菌剂，所以可以直接使用，不需要制作。黑曲霉菌悬液是活菌制作，细菌活性较强，应密闭避光保存。不能与抗生素、杀虫剂、杀菌剂、消毒剂、强酸强碱类产品混合使用。2.2解磷菌AspergillusnigeF4的固体菌剂的制备在禽便堆肥前我们要进行解磷菌AspergillusnigeF4固体菌剂制备，因为堆肥原材料为禽便，黑曲霉不能将禽便作为载体，此时我们就需要在禽便中加入载体、碳源和氮源来为微生物（黑曲霉）提供生长条件。利用谷壳、谷糠、稻草粉等作为载体，配合不同碳源、氮源等筛选出适合黑曲霉生长地最佳原料配比，包括最佳载体组合、最佳碳源、最佳碳源量、最佳氮源、最佳氮源量等。2.2.1孢子浓度和OD660nm标准曲线制备分别吸取黑曲霉菌悬液0、0.2、0.4、0.5、0.6、0.7ml于10ml刻度试管中中，加蒸馏水至约10ml，混合均匀，用分光光度计测定吸光度（OD660nm），用显微镜测量其孢子浓度。图SEQ表\*ARABIC1黑曲霉孢子浓度标准曲线Figure1StandardcurveofAspergillusNigersporeconcentration由上表可知，线性回归方程为y=0.1124x+0.0324（R2=0.9942），R2≥0.99，R值为相关系数，校准曲线的线性R值>0.99证明结果比较准确。2.2.2不同载体的筛选谷壳、谷糠、稻草粉三者为载体，载体重量一共占比72%，豆渣10%，麸皮10%，1%葡萄糖为碳源、1%蛋白胨为氮源，磷矿粉6%，含水量为50%，混合均匀后不同处理分装2瓶，121℃下灭菌30min，冷却后每瓶加2.5ml黑曲霉菌悬液（5%），培养9d后，取2g样品于20ml蒸馏水中，振荡30min后，从中吸取1ml菌液，加9ml蒸馏水于试管中，混合均匀后测定OD660nm值。表1不同载体组合重量占比方案Table1Weight

ratio

of

different

carrier

combinations序号载体种类和组合比例重量占比1谷壳：谷糠=1：136%：36%2谷壳：谷糠=1：224%：48%3谷壳：谷糠=2：148%：24%4谷壳：稻草粉=1：136%：36%5谷壳：稻草粉=1：224%：48%6谷壳：稻草粉=2：148%：24%7稻草粉：谷糠=1：136%：36%8稻草粉：谷糠=1：224%：48%9稻草粉：谷糠=2：148%：24%10谷壳：谷糠：稻草粉=1：1：124%：24%：24%2.2.3不同碳源的筛选选取最佳载体组合72%，豆渣10%，麸皮10%，1%蛋白胨为氮源，磷矿粉6%，加入1%不同碳源（葡萄糖、红糖、牛肉膏、可溶性淀粉、玉米粉），含水量50%，混合均匀后每个处理分装2瓶，于121℃下灭菌30min，冷却后每瓶加2.5ml黑曲霉菌悬液（5%），培养9d后，取2g样品于40ml蒸馏水中，振荡30min后，从中取1ml菌液，加9ml蒸馏水于试管中，混合均匀后测定OD660nm值。表2不同碳源组合方案Table2DifferentCarbonSourceCombinationScheme序号碳源1葡萄糖1%2红糖1%3牛肉膏1%4玉米粉1%5可溶性淀粉1%2.2.4不同碳源量的筛选选取最佳载体组合72%，豆渣10%，麸皮10%，1%蛋白胨为氮源，磷矿粉6%，加入不同量（0.5%、1%、2%、4%、6%、8%、10%）地最佳碳源，含水量50%，混合均匀后每个处理分装2瓶，于121℃下灭菌30min，冷却后每瓶加2.5ml黑曲霉菌悬液（5%），培养9d后，取2g样品于50ml蒸馏水中，振荡30min后，从中取1ml菌液，加9ml蒸馏水于试管中，混合均匀后测定OD660nm值。2.2.5不同氮源的筛选选取最佳载体组合72%，豆渣10%，麸皮10%，磷矿粉6%，加入最佳量地最佳碳源，加入1%的不同氮源（尿素、硝酸钾、硫酸铵、氨基酸、蛋白胨、豆粉），含水量50%，混合均匀后每个处理分装2瓶，于121℃下灭菌30min，冷却后每瓶加2.5ml黑曲霉菌悬液（5%），培养9d后，取2g样品于50ml蒸馏水中，振荡30min后，从中取1ml菌液，加9ml蒸馏水于试管中，混合均匀后测定OD660nm值。表3不同氮源组合方案Table3Differentcombinationsofnitrogensources序号氮源1尿素1%2硝酸钾1%3硫酸铵1%4氨基酸1%5蛋白胨1%6豆粉1%2.2.6不同氮源量的筛选选取最佳载体组合72%，豆渣10%，麸皮10%，磷矿粉6%，加入最佳量地最佳碳源，加入不同量（0.5%、1%、2%、4%、6%、8%、10%）地最佳氮源，含水量50%，混合均匀后每个处理分装2瓶，于121℃下灭菌30min，冷却后每瓶加2.5ml黑曲霉菌悬液（5%），培养9d后，取2g样品于20ml蒸馏水中，振荡30min后，从中取0.4ml菌液，加9.6ml蒸馏水于试管中，混合均匀后测定OD660nm值。2.3解磷菌剂AspergillusnigeF4在中低品位磷矿堆肥中的磷活化效果研究2.3.1磷标准曲线磷标准曲线的制作：分别吸取100mg/L的磷标准溶液0、1、2、3、4、5ml于容量瓶中，加蒸馏水至约30ml，加入钼锑抗显色剂，定容至50ml。得到0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/L标准系列溶液，利用钼锑抗比色法测定吸光度（OD880nm），绘制标准曲线。溶液中含有的可溶性正磷酸离子其浓度与含量在一定范围内成正比，通过测定吸光度能求得其含量。只有绘制标准曲线作为参考，测定的吸光度和求得的含量才有可比性。以下是测量得到的吸光度和磷标准曲线：线性回归方程为y=0.9269x-0.0094（R2=0.9976），R2≥0.99，R值为相关系数，校准曲线的线性R值>0.99证明结果比较准确，可以使用这个线性回归方程。表4磷标准曲线的对应数值Table4Correspondingvaluesofthephosphorusstandardcurve浓度X吸光度Y00.0000.10.0800.20.1650.30.2720.40.3540.50.463图2磷标准曲线Figure2Phosphorusstandardcurve2.3.2解磷菌剂AspergillusnigeF4在中低品位磷矿堆肥的试验方案堆肥原料配方为鸡粪55%(鸡粪中含有75%的谷壳，含水量为37%)，稻草粉20%(含水量为10%)，磷矿粉15%，氨基酸下脚料10%，中微量元素0.6%（氯化钠0.05%氯化钾0.05%硫酸镁0.5%）控制含水量为55%。设计5个处理，分别为：CK：EM菌剂35℃，T1地衣芽孢杆菌堆肥菌剂；T2黑曲霉解磷菌；T3黑曲霉解磷菌+地衣芽孢杆菌堆肥菌剂；T4黑曲霉解磷菌+地衣芽孢杆菌堆肥菌剂+增效剂，菌种接种量为2%，增效剂为柑橘皮，添加量为5%，每个处理设计3个平行，采用瓶装模拟试验放在烘箱中，保持稳定在40度（模拟堆肥过程中堆体中上层真菌活动的堆体温度），测定其含水量、pH、有效磷含量和微生物（细菌、真菌、放线菌和解磷菌）数量指标，用烘干法测定含水量，用pH计法测定pH，用钼锑抗比色法测定其有效磷含量。因为此次实验还需要测试黑曲霉对其他微生物的影响，所以混合后的载体不需要灭菌。每隔五天取一次样，注意每组3个平行实验都要取同位置的样品，并且样品应该等量，取样后将3个平行实验的样品放入到一个保鲜袋中，混合均匀（以此来降低实验误差，因为去不同位置的样品可能存在有的样品有菌生长，而有的样品没有），并在保鲜袋上写明是哪种处理，取样的日期，第几次取样，实验者的名字，放入-20℃的冰箱中保存。在混合均匀后从保鲜袋中取出部分测定样品的含水量、pH、有效磷和微生物数量。含水量测定：从保鲜袋中称取部分堆肥样品于培养皿中，记下培养皿的重量M1和样品的湿重M2，做好标记，将培养皿放入烘箱中烘干，3d后取出称重M3，此为干重培养皿重量之和，每个处理做三个平行实验。W含水量=（M3-M1）/M2✖100%pH测定：从保鲜袋中称取5g堆肥样品加入50ml蒸馏水于三角瓶中，每个处理做三个平行实验，150转振荡30min（在震荡过程中需要将三角瓶扎口，防止在震荡时样品中的孢子散落到空气中，污染其他实验，造成实验误差），过滤后取滤液用pH计测量。有效磷含量测定：测样品有效磷含量（W）用钼锑抗比色法。从保鲜袋中称取2.5g(m)堆肥样品于三角瓶中，加入50ml(V1)0.5mol/LNaHCO3溶液，150转振荡30min，过滤，吸取滤液10ml于三角瓶中，加入35ml蒸馏水，最后再加入5ml钼锑抗试剂，用分光光度计在OD880nm处测量吸光度，每个处理做三个平行实验。因为滤液中含有的可溶性正磷酸离子比较多，将超过分光光度计吸光度的线性范围，得到的数值不太准确，所以我们将10ml滤液改为2ml（V2）滤液加8ml0.5mol/LNaHCO3溶液，方便测量和计算。W有效磷含量=(A-a)✖V1✖50/(b✖V2✖m✖W含水量)（单位：mg/kg）A——试样吸光度；a——标准曲线的截距；50——显色时定容体积；b——标准曲线的斜率；微生物数量测定：从保鲜袋中称取5g堆肥样品加入含有50ml无菌水的三角瓶中，采用梯度稀释涂布平板法测定其细菌、放线菌、真菌和解磷菌数量。在其稀释后要注意震荡试管使其混合均匀，而且还有要注意在稀释前后都要润洗移液管，降低实验误差。稀释完成后，从试管中吸取0.1ml液体于四种平板上（牛肉膏蛋白胨培养基平板、高氏1号培养基平板、马丁氏培养基平板、蒙金娜培养基平板），用涂布器涂抹均匀，放入37℃恒温培养箱中倒置培养，每个稀释度每钟培养基涂三个平板，培养5d后分别记下其菌数。3实验结果3.1解磷真菌AspergillusnigeF4的固体菌剂制备3.1.1不同载体对AspergillusnigeF4固体发酵孢子浓度的影响在实验过程中，我们可以明显的观察到以下情况：1号2号3号8号10号载体上有较多白色的菌丝，只有部分载体上可以看到黑色的孢子；4号6号7号9号载体上黑色孢子较多，白色菌丝较少；而在5号瓶中几乎没有白色的菌丝存在。图3不同载体组合筛选结果Figure3Screeningresultsofdifferentcarriercombinations由此表可知，在只有载体组合不同的情况下，5号瓶的OD660nm值和孢子浓度是这10组中最高的一组，而且5号的孢子浓度是9号的1.29倍，由此可以证明5号产孢子最多效果最好。由此可见，在这10组载体组合中，5号为最佳组合，因此，可以确定载体为谷壳：稻草粉=1：2。3.1.2不同碳源对AspergillusnigeF4固体发酵孢子浓度的影响图4不同碳源组合筛选结果Figure4Screeningresultsofdifferentcarbonsources由此表可知，在只有碳源不同的情况下，1号瓶的OD660nm值和孢子浓度是这5组中最高的一组，而且1号的孢子浓度是2号的1.59倍，由此可以证明1号产孢子最多效果最好。由此可见，在这10组载体组合中，5号为最佳组合，因此，可以确定最佳碳源为葡萄糖。3.1.3不同碳源量对AspergillusnigeF4固体发酵孢子浓度的影响图5不同碳源量组合筛选结果Figure5Screeningresultsofdifferentcarbonsources由此表可知，在只有碳源量不同的情况下，5号瓶的OD660nm值和孢子浓度是这7组中最高的一组，6号7号比5号差一点，但加入的葡萄糖要比5号多，在工业生产中要尽可能的减少成本（在品质相差不多的情况下），且5号的孢子浓度是6号的1.05倍，由此可以证明5号产孢子最多效果最好，因此最佳碳源量为6%的葡萄糖。3.1.4不同氮源对AspergillusnigeF4固体发酵孢子浓度的影响图6不同氮源组合筛选结果Figure6Screeningresultsofdifferentnitrogensourcecombinations由上表可知，在只有氮源不同的情况下，4号瓶的OD660nm值和孢子浓度是这6组中最高的一组，5号与4号比相差不大，但在工业上氨基酸比蛋白胨成本更高，在工业生产中要尽可能的减少成本（在品质相差不多的情况下），所以后续添加的氮源为蛋白胨。3.1.5不同氮源量对AspergillusnigeF4固体发酵孢子浓度的影响图7不同氮源量组合筛选结果Figure7Screeningresultsofdifferentnitrogensourcecombinations由此表可知，在只有氮源量不同的情况下，5号瓶的OD660nm值是这7组中最高的一组，6号只比5号差一点，但加入的蛋白胨要比5号多，在工业生产中要尽可能的减少成本（在品质相差不多的情况下），所以蛋白胨的浓度为6%。3.2解磷菌剂AspergillusnigeF4在中低品位磷矿堆肥中的磷活化效果研究3.2.1解磷菌剂AspergillusnigeF4对禽便堆肥含水量的影响以下是不同菌剂对禽便堆肥含水量的影响变化图表和数值，从图表中可以明显看到：在堆肥前期，T1、T2、T3、T4这几个处理的含水量呈现逐渐增加的趋势;只有CK这一个处理在堆肥前期含水量一直在增加，没有降低趋势；在堆肥中期，CK、T1、T3、T4这几个处理的含水量呈现先增加后逐渐降低的趋势;只有T2这一个处理在堆肥中期含水量一直在增加，没有降低趋势；堆肥后期，T1和T4呈现明显的增加趋势，CK和T3又呈明显的降低趋势，T2基本上平稳，没有大的增加幅度，总的来看，在整个堆肥期间，T2一直保持上升趋势。图8解磷菌剂AspergillusnigeF4对禽便堆肥含水量的影响Figure8EffectofAspergillusnigeF4ofPhosphorus-reducingBacteriaonWaterContentofPoultryToiletComposting3.2.3解磷菌剂AspergillusnigeF4对禽便堆肥pH的影响以下是不同菌剂对禽便堆肥pH的影响变化图表和数值，从图表中明显可以看到：在堆肥前期，CK、T1、T2、T3、T4这几个处理的pH呈现先逐渐增加后降低的趋势；在堆肥中期，CK、T1、T2、T3、T4这几个处理的pH也呈现先增加后逐渐降低的趋势;堆肥后期，这几个处理又呈明显的降低趋势。图9解磷菌剂AspergillusnigeF4对禽便堆肥pH的影响Figure9TheeffectofAspergillusnigeF4onthepHofpoultrycompost3.2.4解磷菌剂AspergillusnigeF4对禽便堆肥有效磷含量的影响以下是不同菌剂对禽便堆肥有效磷含量的影响变化图表和数值，由图表中可知：在堆肥前期（0d——10d），CK、T1、T2、T3、T4这几个处理的有效磷含量都呈现逐渐增加的趋势，T2、T4增加的幅度不大;在堆肥中期（10d——20d）CK和T1的有效磷含量呈现先逐渐增加后慢慢降低的趋势，而其他三个处理的有效磷含量一直在增加，没有出现过降低的趋势；堆肥后期（20d——25d），T1和T4的有效磷含量在缓慢增加，而其他三个处理呈明显的降低趋势。整个周期内，T2和T3的有效磷含量在第20d出现最高值，T1和T4的有效磷含量在第25d出现最高值，按照下图趋势来看，CK的最高值在15d到20d之间。在第15d时，因只稀释5倍的滤液OD880nm值将要超过1.00，所以将从15d开始测量有效磷的稀释倍数改为10倍。图10解磷菌剂AspergillusnigeF4对禽便堆肥有效磷含量的影响Figure10EffectofAspergillusnigeF4ofPhosphorusAntibacterialAgentontheEffectivePhosphorusContentinPoultryToiletComposting3.2.5解磷菌剂AspergillusnigeF4对禽便堆肥微生物的影响复合菌剂在堆肥过程中的总体变化趋势是细菌最多，放线菌次之，真菌解磷菌最少。（1）解磷菌剂AspergillusnigeF4对禽便堆肥细菌的影响图11稀释倍数为10-8的禽便堆肥细菌数Figure11Numberofbacteriainpoultrycompostwithdilutionof10-8（2）解磷菌剂AspergillusnigeF4对禽便堆肥放线菌的影响图12稀释倍数为10-4的禽便堆肥放线菌数Figure12Numberofactinomycetesinpoultrycompostwithdilutionof10-4（3）解磷菌剂AspergillusnigeF4对禽便堆肥真菌的影响图13稀释倍数为10-6的禽便堆肥真菌数Figure13Numberoffungiinpoultrycompostwithdilutionof10-6（4）解磷菌剂AspergillusnigeF4对禽便堆肥解磷菌的影响图14稀释倍数为10-4的禽便堆肥解磷菌数Figure14NumberofP.colicompostedwithdilutionratioof10-4由以上四个表可知：CK的放线菌数先增加后降低，细菌和真菌数一直降低，不含解磷菌；T1的放线菌数先增加后降低，细菌数一直增加，而真菌数一直降低，不含解磷菌；T2的细菌和放线菌数先增加后降低，真菌数一直增加，解磷菌一直减少;T3细菌、放线菌和解磷菌数先增加后降低，真菌数一直降低;T4的放线菌数先增加后降低，细菌、真菌数和解磷菌数一直减少。4讨论与结论4.1解磷菌AspergillusnigeF4的固体菌剂的制备在进行筛选载体实验时，我们能明显的看到稻草粉占比比较多的几组其OD660nm值较其他几组来说相对较高，可能是因为稻草粉中不仅含有较易分解的单糖、淀粉和半纤维素，还含有难以分解的纤维素，黑曲霉能产生纤维素酶（酶系较全，活性也较强），将稻草粉中难以分解的纤维素降解为单糖。同时我们发现载体实验中使用的豆渣有部分成块，在固体发酵中可以看到成块豆渣上生长了大量孢子，产生孢子团，合理猜测可能是因为豆渣所能提供的营养丰富。而在筛选碳源的实验中，我们发现葡萄糖和可溶性淀粉效果最好，但可溶性淀粉较葡萄糖来说差一点，原因可能是葡萄糖是微生物最容易同化利用的碳源，可被直接吸收利用，微生物在含有葡萄糖的培养基上生长迅速，无适应期；而淀粉等大分子碳水化合物需经菌体细胞所产生的胞外淀粉酶分解后才能被吸收利用。淀粉分解的最终产物为葡萄糖。在筛选碳源量的实验中，我们不难发现葡萄糖浓度过高和过低，都不利于微生物生长，葡萄糖浓度过高会引起微生物渗透失水，抑制微生物的生长；葡萄糖浓度过低时供应不了太多微生物的碳源所需，碳源有限，微生物繁衍到后期将不能在繁衍，以此来抑制微生物的生长。在筛选氮源量的实验中，我们不难发现蛋白胨浓度过高和过低，都不利于微生物生长。蛋白胨当中不仅含有丰富的氨基酸，特别是含硫氨基酸较多，而且含有更多的细菌生长需要的维生素和其它生长因子。蛋白胨含有丰富的营养物质，被视为微生物生长必不可少的营养物质。蛋白胨对菌种发酵有着明显的正向效果[31]。蛋白胨浓度过低时不足以给大量微生物提供营养，过高时会引起微生物渗透失水而死亡。制备解磷菌AspergillusnigeF4的固体菌剂的最佳配比为：载体72%（谷壳24%，稻草粉48%），豆渣10%，麸皮10%，6%葡萄糖为碳源、6%蛋白胨为氮源，磷矿粉6%，含水量为50%。未来我们将继续探究解磷菌AspergillusnigeF4固体菌剂的最佳无机盐（微量元素）、培养条件等等。4.2解磷菌剂AspergillusnigeF4在中低品位磷矿堆肥中的磷活化效果研究分析解磷菌剂AspergillusnigeF4在中低品位磷矿堆肥中的磷活化效果研究结果可知：微生物产酸提高培养基的磷含量，然后微生物可能改变它们的代谢机制，释放有机物于培养介质中，形成有机磷化合物而降低溶液中的磷含量，这就迫使微生物再次利用这些化合物作为能源，导致磷的第二次释放。在整个过程中pH值变化几次，产生不同的有机磷化合物，直至缺乏营养死亡[32]。王富民等[33]研究发现，黑曲霉在液体和固体培养基中的发酵过程都会产生草酸、柠檬酸、乳酸和琥珀酸等，这些代谢产生的有机酸会使溶液的pH下降;赵小蓉等在研[34]究曲霉溶解磷矿粉的过程中同样发现曲霉可以产生有机酸使溶液pH下降，而且有机酸的总量会随着培养时间的增加而增加。由图表13可知，在整个堆肥过程中，T3在第20d的有效磷含量最高，达到了2566.346mg/kg，相比对照活磷效果提高了199.812g/kg，可见解磷菌剂AspergillusnigeF4可以作为解磷菌剂投入生产，在农业上使用。在整个实验过程中，我们进行了禽便的高温堆肥，成本低廉，没有二次污染，且堆肥过程中的高温可以有效地杀死禽便中的病原菌，而且禽便堆肥不仅可以解决环境中的有机固体废弃物，还可以用于提高磷的活化效果，提高农作物产量。整个实验都在湖南省农业环境生态研究所的实验室完成，取材比较方便。同时，我们觉得解磷菌数量较少的原因可能是稀释涂布的浓度太大，也可能是这个条件不足以让AspergillusnigeF4大量生长。经过我们探究发现AspergillusnigeF4在柑橘皮上生长迅速，合理猜测在堆肥原料中加入切碎的柑橘皮可以增加AspergillusnigeF4的菌数，加快其繁衍速度。AspergillusnigeF4在中低品位磷矿堆肥中中的解磷强度表现出了较好的效果，但在大量堆制(不灭菌)的条件下，如何创造AspergillusnigeF4发育的优势条件，以充分发浑AspergillusnigeF4的解磷能力等方面，尚需进一步研究。堆肥的pH降低有利于减少铵态氮挥发，起到固定堆肥中的氮的作用，未来我们将继续朝这个方向努力。解磷菌剂AspergillusnigeF4在中低品位磷矿堆肥中活化磷的应用对我国磷肥的原料、生产工艺和产品性能等方面具有重要意义：扩充磷资源库；工艺简单、节支低碳、成本低；提升肥效。同时还具有比较广的应用范围。参考文献[1]张海鹏,刘强,彭建伟,等.中低品位磷矿在农业生产上的应用展望[J].南方农业学报,2012,43(4):433–480.[2]陶俊法.云南磷肥工业展望[J].磷肥与复肥,2004,19(5):1–3.[3]赵鑫,蔡慢弟,董倩倩,李云驹,申建波.中低品位磷矿资源高效利用机制与途径研究进展[J].植物营养与肥料学报,2018,v.24;No.121,277-286.[4]黄雷,王君,廖宗文,等.中低品位磷矿直接利用技术研究进展[J].化工矿物与加工,2012,41(4):32–37.[5]卫尤明,廖宗文,毛小云.低品位磷矿的深度开发与磷肥的高效利用[J].磷肥与复肥,2020,v.35;No.216,35-37+45.[6]苗俊艳,王艳语,许秀成.中低品位磷矿及磷尾矿的综合利用现状[J].硫磷设计与粉体工程,2019,No.153,4+16-18+32.[7]魏自民,席北斗,赵越,等.城市生活垃圾外源微生物堆肥对有机酸变化及堆肥腐熟度的影响[J].环境科学,2006,27(2):376-380.[8]MakelaM,GalkinS,HatakkaA,etal.Productionoforganicacidsandoxalatedecarboxylaseinlignin-degradingwhite-rotfungi[J].EnzymeMicrobTechnol,2002,30:542-549.[9]RoukasT.Citricacidproductionfromcarobpodbysolidstatefermentation[J].EnzymeMicrobTechnol,1998,24:54-59.[10]SinghCP,AmbergerA.Organicacidsandphosphorussolubilizationinstrawcompostedwithrockphosphate[J].BioresourTechnol,1998,63:13-16.[11]张素.基于ARTP黑曲霉高效解磷菌株的选育及特性研究[D].贵州大学,2019[12]张云霞,雷鹏,许宗齐,等.一株高效解磷菌BacillussuntilisJT-1的筛选及其对土壤微生态和小麦生长的影响［J］.江苏农业学报,2016,32（5）：1073-1080.[13]唐岷宸,李文静,宋天顺,谢婧婧.一株高效解磷菌的筛选及其解磷效果验证[J].生物技术通报,1-8.[14]KatznelsonH,PetersonEA&RouattJWPhosPh。`te一dissolving一nicroogranismsonseedandIntherootzoneofPlants.Ca一1.J.Bot.1962,4():1181一1186[15]李文谦,施凯楠,朱星扬,茅燕勇.解磷菌对中低品位磷矿粉的最佳溶解工艺研究[J].中国果菜,2019,v.39;No.250,16-20.[16]SPerberJ.I.Solutionofmix1eralpl1osPl1atesbysoilbaeteria.Nautre.1957,180:994一995[17]SPerberJ.1.Theincidenceofapatite一solubilizingorganismsintherhizosphereandsoil.Aust.J.AgrieRes,1958,9:778一781[18]王雪，刘颖，辛雨，等．无机解磷真菌A2的分离鉴定及解磷条件的响应面优化．曲阜师范大学学报：自然科学版，2016，42（4）：73-78[19]OgboFC.Conversionofcassavawastesforbiofertilizerproductionusin