高三生物二轮复习课件基因工程

基因工程1、限制酶的选择2、PCR引物的设计、选择3、电泳结果的分析新课推进难点一、限制酶的选择1、限制酶的作用：能够识别双链DNA分子的

，并使每一条链中特定部位的

断开。磷酸二酯键特定脱氧核苷酸序列2、限制酶的作用结果：黏性末端黏性末端平末端DNA两条单链的切口处，伸出几个核苷酸，刚好能互补配对，这样的切口叫黏性末端。切口处是平整的，这样的切口叫平末端。①选择的限制酶不能位于目的基因内部，如图甲不能选择限制酶SmaⅠ。②选择的限制酶位于目的基因的两侧，且不同。如图甲可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也能被切出相同的黏性末端，如图乙)。一、限制酶的选择3、限制酶的选择：(1)根据目的基因选择限制酶(2)根据质粒的特点选择限制酶(如图)②限制酶位于启动子与终止子之间一、限制酶的选择①不破坏四大元件③考虑基因转录的方向(3)根据Ti质粒的T－DNA片段选择限制酶。图中甲、乙、丁Ti质粒均不宜选取，而丙Ti质粒宜选取(假设切割目的基因的限制酶为XbaⅠ和SacⅠ)。一、限制酶的选择1.(2025·青岛二模)普通水稻含铁量极低，研究人员通过改良相关基因，培育出了含铁量比普通水稻高60%的转基因水稻。图1为改良基因及Ti质粒的示意图，该质粒含有氨苄青霉素抗性基因、LacZ基因及一些酶切位点，图2为后续培养过程。下列叙述正确的是一、限制酶的选择A.需要用限制酶XmaⅠ和NheⅠ对Ti质粒进行切割B.培养基2与培养基3加入的生长素和细胞分裂素比例不同C.在含氨苄青霉素的培养基中能够生长的农杆菌细胞中一定含有改良基因D.筛选含重组质粒的农杆菌时，应该在培养基中加入X－gal，目标菌落

为蓝色√一、限制酶的选择引物基础知识回顾2、作用：引物能使

从引物的

开始连接脱氧核苷酸。3、结合部位：引物结合在模板链的_____端1、概念：

3’是一小段能与

的一段

的

.3’端4、设计引物：需以目的基因的

为依据5.引物

端可以修饰，

端不可修饰（应用）为使PCR扩增的目的基因能与运载体正确连接，需要在两种引物的5'端添加不同限制酶的识别序列。5‘3’DNA母链碱基序列互补配对短单链核酸耐高温的DNA聚合酶两端核苷酸序列二、PCR引物的设计、选择突破一

引物的设计原则①引物能与DNA模板通过碱基互补配对结合;②2种引物之间不能互补配对;③某一引物不能自身折叠出现局部碱基互补配对;④需要在2种引物的5'端添加不同的限制酶的识别序列;⑤引物不能太短。书写引物序列，一般从引物的5′端向3′端书写，避免误判。二、PCR引物的设计、选择

例1.如图为X蛋白的部分基因序列，所示序列为引物结合的部分，据图分析：（写出引物前6位碱基序列）扩增X蛋白基因所需的引物序列是________________；_______________。5′-ATGCCG-3′5′-TGATCT-3′定点突变PCR、融合基因PCR、反向PCR1、根据目的基因设计引物二、PCR引物的设计、选择例2：如图为保证双功能醇醛脱氢酶基因(Adh)能通过双酶切以正确方向插入质粒,需设计引物1和引物2,为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接，需在引物的____端加上限制性酶切位点，且常在2条引物上设计加入不同的限制性酶切位点，主要目的是________________。其中引物1的序列为5'-

3'。

GGTACCGTACCTTTGT使DNA片段能定向（正确）插入表达载体5'2、根据限制酶的碱基序列设计引物二、PCR引物的设计、选择变式训练：5’SacI和PstICTGCAGTTAG二、PCR引物的设计、选择1.(2025·秦皇岛一模)通过对多种植物研究表明，钝化植物对外源乙烯的敏感性比抑制内源乙烯的生物合成可以更为有效地延长植物的采后寿命。科学家从草莓中提取乙烯受体Ers1基因，通过基因工程将Ers1基因反向连预测演练接在启动子后，筛选转入反义Ers1基因的草莓，达到延长储藏期的效果。在使用相关技术获得DNA后，需要通过PCR技术进行扩增Ers1基因(如图)。为使目的基因与质粒连接，在设计PCR引物扩增Ers1基因时需添加限制酶XhoⅠ(识别序列为5′—CTCGAG—3′)的识别序列。已知Ers1基因左端①处的碱基序列为—TTCCAATTTTAA—，则其中一种引物设计的序列是5′______________________________3′。在PCR体系中，加入的dNTP可提供_____________。原料和能量—CTCGAGTTCCAATTTTAA—二、PCR引物的设计、选择2.研究人员利用纤维素生产菌(酪氨酸合成缺陷型)合成了黑色纤维素薄膜。蛋白T7RNAP是一种噬菌体RNA聚合酶(T7RNAP的N端或C端单独存在时不能发挥作用，二者结合可形成完整的T7RNAP)，nMag和pMag是在蓝光环境下能够相互结合的两种光敏蛋白。研究人员通过PCR技术获得融合基因，并将不同类型的启动子与相关基因连接，构建成基因表达载体，然后将其导入受体菌，获得了所需的工程菌。研究人员利用PCR技术实现编码T7RNAPN端的基因下游序列与编码nMag的基因上游序列的无缝连接，获得编码T7RNAPN端－nMag的融合基因，由图可知，引物2的5′端9个碱基序列为5′_____________________3′，如此设计引物2的目的是_______________________________________________________________。用同样的方法获得编码pMag－T7RNAPC端的融合基因。—CCTGCACCT—

使T7RNAPN端基因的下游添加与nMag基因的上游相同的序列二、PCR引物的设计、选择3.(2025·聊城二模)大豆中转录调控因子Y蛋白可以和某些基因启动子序列结合，促进其表达以增强大豆对干旱和盐胁迫的抗性。研究人员通过逆转录获得Y基因并将其下游终止密码子对应序列剔除，然后与载体上绿色荧光蛋白基因(GFP)进行拼接获得融合基因。成功表达的Y－GFP融合蛋白可用于Y蛋白调控机理的研究。研究中首先要对Y基因进行PCR扩增。PCR反应要在一定的缓冲液中进行，缓冲液中一般需要加入Mg2＋，其原因是__________________________。如图所示Y基因序列为转录的_________(填“模板链”或“非模板链”)。DNA聚合酶需要Mg2＋激活非模板链已知EcoRⅠ识别序列为5′－GAATTC－3′，BamHⅠ识别序列为5′－GGATCC－3′，这些限制酶识别序列不影响融合蛋白基因的表达。为使Y基因正确接入载体并成功表达出Y－GFP融合蛋白，Y基因下游扩增引物应为5′－________________－3′(包括添加的限制酶识别序列，共写12个碱基)。GGATCCATGTTC二、PCR引物的设计、选择突破二

引物的选择(1)利用PCR技术扩增ccxy13基因时，应从与对应链互补的a、b、c、d中选择

作为引物。例1：b和c二、PCR引物的设计、选择规律1：引物结合在模板链的3′。例2：(2023·山东，25节选)(1)如图构建重组质粒后，为了确定J

基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物_______

。已知

J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的________(填“a链”或“b链”)相应部分的序列相同。F1和R2(或F2和R1)

a链

规律：鉴定目的基因是否正确插入质粒时，一种引物与质粒互补结合，另一种引物与目的基因DNA互补结合。二、PCR引物的设计、选择1、(2022·山东，25节选)某种类型的白血病由蛋白P引发，蛋白UBC可使P被蛋白酶识别并降解，药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机理，需构建重组载体以获得融合蛋白FLAG－P和FLAG－PΔ。PΔ是缺失特定氨基酸序列的P，FLAG是一种短肽，连接在P或PΔ的氨基端，使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合，但不影响P或PΔ的功能。①为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是________________________________________________________，为使PCR产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的______(填“3′端”或“5′端”)。能与P基因模板链3′端的一段碱基序列互补配对的短单链核酸5′端突破三

引物的修饰二、PCR引物的设计、选择②PCR扩增得到的P基因经酶切连接插入载体后，与编码FLAG的序列形成一个融合基因，如图所示，其中“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后，融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同。据图分析，出现该问题的原因是___________________________________________________________________________________________________。修改扩增P基因时P基因编码链的第一个碱基与EcoRⅠ识别序列的最后两个碱基编码一个氨基酸，导致mRNA的密码子被错位读取使用的带有EcoRⅠ识别序列的引物来解决该问题，具体修改方案是_______________________________________________。在引物中的EcoRⅠ识别序列3′端添加1个碱基二、PCR引物的设计、选择2、(2021·天津，16节选)研究者将乳酸菌的乳酸脱氢酶基因(LDH)导入酿酒酵母，获得能产生乳酸的工程菌株。如图为构建表达载体时所需的关键条件。在设计引物扩增乳酸脱氢酶编码序列时，为使扩增出的序列中编码起始密码子的序列由原核生物偏好的GTG转变为真核生物偏好的ATG，且能通过双酶切以正确方向插入质粒，需设计引物1和2。其中引物1的5′端序列应考虑_____________________和________________。包含BamHⅠ的识别序列将GTG改为ATG二、PCR引物的设计、选择 1、电泳的概念

通过电泳技术将一个混合物样品在介质上分成区带，经过染色后，可以在介质上显示出区带。高中生物考查到的电泳图一般是根据碱基对的数量(bp)作区分，即相同数目碱基对的基因是一种条带，电泳图中处于同样位置。三、电泳图谱分析2、两种常考的电泳结果分析①等位基因A和a所含碱基对数量(bp)不同三、电泳图谱分析若一个基因是由另一个基因发生碱基对替换而来，则A和a所含bp相同，二者仅碱基顺序不同，则需经过限制酶切割再电泳。如限制酶SamⅠ的识别位点仅A基因有，a基因没有。在下图中，假定基因A和a长度均为1350bp，因仅A含有SamⅠ限制酶酶切位点，所以仅A基因被切开成两段，即1150bp和200bp。需注意，切开后的两段长度和应为未切开时的长度。②等位基因A和a所含碱基对数量(bp)相同三、电泳图谱分析考向1结合遗传系谱图的分析，考查科学思维1.(2024·山东卷，8)如图为人类某单基因遗传病的系谱图。不考虑X、Y染色体同源区段和突变，下列推断错误的是(

)DA.该致病基因不位于Y染色体上B.若Ⅱ－1不携带该致病基因，则Ⅱ－2一定为杂合子C.若Ⅲ－5正常，则Ⅱ－2一定患病D.若Ⅱ－2正常，则据Ⅲ－2是否患病可确定该病遗传方式三、电泳图谱分析2.(2025·八省联考陕西卷，16)先天性肾性尿崩症(CNDI)主要与AQP2和AVPR2基因有关，两基因中任一突变均可致病，其中一个基因位于X染色体。现有甲、乙两个CNDI家系如图(a)，对两家系部分成员的AQP2基因检测结果如图(b)。不考虑其他因素的影响，下列判断错误的是(

)DA.基因AVPR2突变引起的CNDI属于伴X染色体隐性遗传B.就AQP2基因而言，甲Ⅱ1与乙Ⅰ1基因型相同的概率为2/3C.乙Ⅱ2产生的每个次级精母细胞含有0或2个致病基因D.若甲Ⅱ3与乙Ⅱ1结婚，其子代男孩患CNDI的概率是1/3三、电泳图谱分析3.(2024·新课标卷，5)某种二倍体植物的P1和P2植株杂交得F1，F1自交得F2。对个体的DNA进行PCR检测，产物的电泳结果如图所示，其中①～⑧为部分F2个体，上部2条带是一对等位基因的扩增产物，下部2条带是另一对等位基因的扩增产物，这2对等位基因位于非同源染色体上。下列叙述错误的是(

)DA.①②个体均为杂合体，F2中③所占的比例大于⑤B.还有一种F2个体的PCR产物电泳结果有3条带C.③和⑦杂交子代的PCR产物电泳结果与②⑧电泳结果相同D.①自交子代的PCR产物电泳结果与④电泳结果相同的占1/2三、电泳图谱分析4.(2024·安徽卷，19)一个具有甲、乙两种单基因遗传病的家族系谱图如下。甲病是某种家族遗传性肿瘤，由等位基因A/a