DNA片段的扩增及电泳鉴定-高三-生物学-教学设计

DNA片段的扩增与电泳鉴定实验教学设计徐晶哈尔滨市第九中学校实验课名称DNA片段的扩增与电泳鉴定实验实验教学素养目标1.类比体内DNA复制的条件阐明PCR技术的基本原理，加深结构与功能相适应的生命观念。2.从分子的角度结合跨学科知识解释电泳技术的基本原理，培养学生科学思维。3.通过小组合作交流设计科学合理的实验流程，说明设置对照的意义，通过实施实验提升动手能力，能够预测实验结果并得出结论，准确分析各种影响因素，体会科学探究的一般过程。4.能对社会热点问题如转基因安全性等相关问题作出理性解释和判断，提升学生的社会责任意识。实验资源PCR仪、微量离心管、微量移液器、一次性吸液枪头、电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等）、4种脱氧核苷酸的等量混合液、2种引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、无菌水、冰盒、电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、DNAMarker、琼脂糖和核酸染料、紫外手电筒、一次性手套等。实验设计与创新点1.本节课从新课程理念出发，按照课标要求，以学生为主体来设计教学过程，实验设计从生产生活实际出发，真实情境更有利于激发学生探索的欲望，实验的同时潜移默化的提升了学生的社会责任感。研究过程层层深入，符合学生的认知规律。2.本节课很好的运用了信息技术，如希沃白板助手实时投屏，视频剪辑方面采用视频剪辑软件进行。3.本实验课使用了基因检测试纸，帮助学生理解科技在生活中实际应用，利用田间作物等作为实验材料，引导学生参与社会热点议题，增强学生对家园和祖国的热爱及自豪感。本实验将PCR实验与DNA电泳实验整合到一起，让PCR结果的检测更加准确和直观。实验操作过程中由课前做过PCR的小组同学代表指导本组同学之间操作，体现了学生之间合作互助的良好关系。设置了不同浓度的凝胶及故意将一管无菌水换成质粒DNA，在学生不知情的情况下制造污染现象，有助于提升学生勇于质疑的勇气及实验分析能力。采用了PCR试剂盒，简化了PCR操作过程中移液环节多且易错的加样程序，省去离心步骤，电泳时加样时多组一起对上下两块凝胶进行操作以及通过调节电压，使电泳速度变快，缩短了实验时间，极大的提高了课堂效率。利用了安全性高的核酸染料，安全性高。对于电泳结果的观察创新的使用了紫外手电筒，省去了凝胶成像系统的高额费用，使实验简单、易操作。实验教学过程教师活动一、导入大家都知道，我省是我国最大的粮食生产基地，针对我省寒地黑土及植物多样性的特点，2017年起，我省就已经宣布了“禁止种植转基因作物”的政策，请大家看老师手里的玉米，这些籽粒颜色多样，有人说这是转基因的作物，不安全，现在转基因作物非常普遍。对此，我们的学生小组成员代表周末进行了采样，请小组同学代表汇报一下。教师进行评价。二、提出问题、作出假设但是老师有个问题，没有检测到Bt抗虫蛋白，作物中就一定没有Bt基因吗？那根据我们所学的知识，如何更准确的检测某种作物是否含有Bt基因呢?那么整个检测流程大致思路是什么？教师引导、评价。三、设计实验PCR的原理我们已经学过，请同学们回忆PCR原理，那PCR的原理是什么呢？实际上PCR是体外模拟体内DNA复制的过程，那么PCR反应体系中都应该加入什么成分？请大家思考讨论，请完成任务1并写在导学案上在反应体系中为什么不加解旋酶？这同学注重教材的细节，值得提倡。反应体系中的引物是小组同学与老师一起在NCBI网站上查到了Bt基因序列，利用引物设计软件进行了设计，由生物公司合成。我们在进行PCR扩增时是否要设置对照？请同学们思考讨论完成任务2，PCR过程中要如何设置对照，设置对照意义是什么？引导学生回答阴性对照和阳性对照的意义并写在导学案上。指导学生设置好阳性对照组、阴性对照组和实验组。课前小组同学已经提取出了DNA，这节课我们就用这些DNA来进行扩增，下面老师来介绍一下DNA片段的扩增过程。首先看一下材料用具：PCR仪、微量离心管、微量移液器、一次性吸液枪头4种脱氧核苷酸的等量混合液、2种引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、无菌水接下来看我们一下实验步骤：①移液。按照课件上的反应体系，用微量移液器向微量离心管中依次加入各组分。我们用的PCR试剂盒，微量离心管内已经有TaqDNA聚合酶、4种脱氧核苷酸的混合液、无菌水和扩增缓冲液（里面含有镁离子），同学们需要加入的是引物1和引物2，还有需要合理设置对照组。阳性对照组加的是质粒，阴性对照组加的是无菌水，实验组分别加入提取的作物的DNA（大豆、玉米或圣女果的DNA）。并强调注意事项（事先将一管无菌水换成质粒，在学生不知情的情况下制造污染现象。）②离心。加完组分后，盖好盖子，理论上离心约10秒使反应液集中在管的底部，以此提高反应速率。后来老师经过实验，发现不离心实验效果也比较理想，所以为了节省时间，离心这步我们暂时省略。③反应。已经设置好PCR仪的循环程序，不同的实验中复性温度、循环次数是有区别的，将微量离心管放入PCR仪中进行反应。同学们注意将微量离心管放入PCR扩增仪器的小孔内。四、进行DNA片段的扩增实验小组同学进行DNA片段的扩增实验，教师巡视指导，生生合作交流。待学生做完后，提示PCR扩增的DNA产物是肉眼看不见的，这时要通过电泳对PCR产物鉴定。由于PCR等待时间长，本节课的PCR产物需下课后继续进行电泳鉴定。五、电泳原理介绍及实验那电泳的原理是什么？请同学按照预习时自己的理解来说明。你如何判断我们要检测的Bt基因的大小呢？请同学说出Marker的作用。清楚实验原理后我们就进行操作，老师介绍一下材料用具有微量离心管、微量移液器、一次性吸液枪头电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等）电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液琼脂糖和核酸染料（非EB，安全性高）等大家一起看一下实验操作步骤：（因为安全及时间问题，凝胶由小组代表事先配制好了）。1.配制琼脂糖溶液（视频展示）。（我们的核酸染料不是常用的EB，安全系数高）2.制备凝胶（视频展示）。。3.加样。由于PCR时间较长，所以本节课我们点样的样品为课前小组同学代表进行PCR实验的结果。本节课另一部分PCR结果等下课我们在进行鉴定，将小组同学扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合（本实验中已经提前混合好），再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留出一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物就是我们通常说的DNAMake（提醒这次实验最左边和最右边两个加样空不点样）。加样时要用前面的移液器来进行加样，要戴好手套，不要触碰电泳槽及电泳液，加样时请同学们可以调整观察的角度，看见加样孔，枪头不要扎破凝胶，如果手抖可以用一只手扶着另一只手的手腕。将离心管内PCR产物加入点样孔内7微升，每个电泳槽内都有两块凝胶，一大一小，同学们从两侧点样。先都加样在大块的凝胶上，顺序为阳性对照、阴性对照、实验组。1-2组为大豆组（顺序为阳性对照、阴性对照、7微升大豆DNA），3-4组为玉米组（顺序为阳性、阴性、7微升玉米DNA），5-6组圣女果组（顺序为阳性、阴性、7微升圣女果DNA），分别点上下两块胶，1、3和4组、5组点上面胶，2组和6组点下面的胶，鉴于实验条件的限制及实验操作可行性，我们从两侧往中间点样，每个电泳槽可以多个同学一起加样。4.电泳。接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。六、表达及交流好，咱们同学已经加完样了，在等待电泳结果的期间，请同学们讨论，预期实验结果，并进行分析，如果没有预期结果，原因可能是什么？请完成任务3。同学们讨论完成任务3。结果分析与评价：5.观察记录。取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。电泳结果可以通过在紫外灯下直接观察DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果，通过与指示分子大小的标准参照物DNAMarker的比对,可以估计扩增片段的大小。（紫外显示，手机拍照。投屏）。请同学们看一下自己组的结果，请同学们记录并总结，之后请同学们讨论完成任务4。你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。与同学们一起分析。如果阴性对照出现了条带，说明了什么？再请同学们再观察这两块凝胶，为什么DNA迁移速率不一样？同学仔细观察会发现两块凝胶中同样的样品迁移速率不同，与凝胶浓度有关。追问：那么哪块凝胶浓度比较大？七、应用及进一步探究利用本节课学会的检测方法，我们还可以进一步探究其他问题，如对我省粮食作物如小麦等进行进一步检测抗除草剂基因等。请同学们可下完成课外实践作业：上网查阅引物设计原则、PCR的种类及转基因安全性等相关资料。八、小结通过本节课的学习，回到我们最初的问题上来，我们检测出常见的作物玉米、大豆和圣女果中没有转入Bt基因，说明国家对于转基因技术的推广控制还是非常严格的，这也体现了大国的负责任态度。目前对待转基因技术的态度是大胆实验，谨慎推广。我们在以后的社会生活中要对待热点争议问题如转基因安全性等，不要人云亦云，积极运用所学过的生物学知识和方法，作出理性的判断，提升自己解决生产生活问题的担当和能力。感谢同学们的配合，这节课就到这里，下课。学生活动同学汇报，展示试纸，回答。学生思考后回答。学生回答投屏展示思考讨论，完成任务1学生回答思考讨论，完成任务1认识实验器具并掌握用法。掌握基本实验流程观看课前部分同学录制的视频。同学回答。互相合作，进行实验观看课前部分同学录制的视频。同学讨论，如何进行操作，并进行实验回忆视频内容讨论如何操作。学生讨论、分析，完成任务3观察、分析学生讨论、分析，完成任务4.学生回答。讨论并分析实验结果，并对原因进行分析。搜集资料，进一步加深理解。提升社会责任感。设计意图锻炼学生获取资料、收集信息的能力及语言表达能力。培养学生的质疑能力、批判性思维等高阶思维能力。温故知新。通过学生讨论，培养合作交流能力及书写规范。通过评价，树立学生信心。加深实验设计的相关知识内容的理解。分析出阳性对照和阴性对照的意义。进一步提升科学探究能力。分子生物学实验难度较大，适当给与学生指导，避免实验失败概率太大影响学生兴趣。生生合作交流，提升动手能力更好的理解实验原理。培养学生的动手实践能力及分析能力。培养学生科学思维及科学探究能力，有助于学生核心素养的提升。培养学生的分析能力及逻辑思维能力。获取信息及分析实验结果的能力及交流能力。进一步加强实验探究能力。进一步提升资料搜集、获取能力、整理资料能力。同时提升理解国家政策，体现社会责任感。提升学生大胆质疑、用于挑战、认真分析的批判性思维能力。教学反思实验的整体流程设计科学合理，让学生体会真实科学研究的一般过程。提供的实验材料和用具很多，由于时间问题，调整、简化并改进了一些步骤，提高了课堂效率，实验更容易成功，学生更容易有自豪感。在实验过程中引导学生分析如何设置对照，从而明白设置空白对照、阳性对照和阴性对照的作用和必要性，让实验结果更加准确有说服力。实验内容多，学生技术还比较生疏，要注意对学生的引导。实验原理、实验思路及实验结果的分析及预测整体都侧重培养学生科学思维和科学探究的能力，有利于学生核心素养的提升。今后的教学中应进一步加强实验教学的研究及实践。实践作业请同学们上网查阅引物设计原则、PCR的种类及转基因安全性等相关资料。导学案课题DNA片段的扩增及电泳鉴定上课教师徐晶班级姓名小组学习目标素养指向科学探究、科学思维、社会责任、生命观念具体目标1.阐明PCR技术和电泳技术的基本原理。2.尝试进行PCR技术的基本操作并用电泳鉴定PCR的产物。3.运用所学知识合理设置对照组，能够对电泳实验结果进行准确分析并得出结论。积极关注转基因技术及安全性相关问题，对社会热点问题作出理性解释和判断。学习过程材料、用具①PCR仪②微量离心管③微量移液器、一次性吸液枪头（装在枪头盒里）=4\*GB3④扩增缓冲液、4种脱氧核苷酸的等量混合液、TaqDNA聚合酶、无菌水⑤2种引物（分别标号为P1和P2）、提取的作物DNA（大豆、玉米、圣女果）、含Bt基因的质粒⑥电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等）、电泳缓冲液（均在前面一排，注意请不要触碰）⑦琼脂糖⑧核酸染料（非EB，植物中提取，安全性高）⑨凝胶载样缓冲液=10\*GB3⑩紫外手电筒课前自主预习1.实验原理：（1）DNA体外扩增的原理①PCR利用了原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。②PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器，一次PCR一般要经历30次循环。（2）电泳鉴定PCR产物的原理①DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷的电极移动，这个过程就是。②在凝胶中DNA分子的迁移速率与、DNA分子的和构象有关。③凝胶中的DNA分子通过，可以在波长300nm的下被检测出来。2.方法步骤（1）DNA片段的扩增实验操作步骤移液：用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分。离心：待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子。将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部。反应：参照参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。（2）电泳实验操作步骤配制琼脂糖溶液：根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%~1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却，加入适量的核酸染料混匀。制备凝胶：将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。加样：将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物(Marker)。电泳、观察：接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1~5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。3.注意事项（1）为了避免外源DNA等因素的污染,PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。（2）缓冲液和酶应分装成小份,并在-20℃储存。使用前,将所需试剂从冰箱拿出,放在冰块上缓慢融化。（3）在向微量离心管中添加反应组分时,每吸取一种试剂后,移液器上的枪头都必须更换。（4）在进行操作时,一定要戴好一次性手套。表达、交流1.设计实验【学习任务一】

PCR反应体系中都应该加入什么成分？请完成导学案任务1。【学习任务二】

PCR过程中如何设置对照，设置对照意义是什么？请完成导学案任务2。2.进行实验3.预期实验结果：【学习任务三】预测你的电泳实验结果，并进行分析，如果没有预期结果，原因可能是什么？请完成导学案任务3。4.结论及表达交流：【学习任务四】你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。如果阴性对照出现了条带，说明了什么？请完成导学案任务4。5.应用及进一步探究：课后实践作业学习任务单

课程基本信息学科生物学年级高二学期秋季课题DNA片段的扩增及电泳鉴定教科书书名：选择性必修3生物技术与工程出版社：人民教育出版社出版日期：2020年7月学生信息姓名学校班级学号学习目标1.阐明PCR技术和电泳技术的基本原理。2.尝试进行PCR的基本操作并用电泳鉴定PCR的产物。3.运用所学知识合理设置对照组，能够对电泳实验结果进行准确分析并得出结论。4.积极关注转基因技术及安全性相关问题，对社会热点问题作出理性解释和判断。课前学习任务1.小组同学代表进行采样。2.小组同学代表进行作物DNA提取实验。3.小组同学代表进行PCR实验。4.小组同学代表配制凝胶。课上学习任务【学习任务一】

PCR反应体系中都应该加入什么成分？请完成导学案任务1。

【学习任务二】

PCR过程中如何设置对照，设置对照意义是什么？请完成导学案任务2。

【学习任务三】预测你的电泳实验结果，并进行分析，如果没有预期结果，原因可能是什么？请完成导学案任务3。【学习任务四】你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。如果阴性对照出现了条带，说明了什么？请完成导学案任务4。推荐的学习资源1.基因工程大学教材。2.网络相关视频。

作业练习

课程基本信息学科生物学年级高二学期秋季课题DNA片段的扩增及电泳鉴定教科书书名：选择性必修3生物技术与工程出版社：人民教育出版社出版日期：2020年7月学生信息姓名学校班级学号作业练习1．下列关于核酸片段的扩增及电泳鉴定的相关叙述，正确的是（）A．PCR反应缓冲液中一般要添加ATP，以激活耐高温的DNA聚合酶B．复性温度过高可能导致PCR反应得不到任何扩增产物C．PCR的产物常通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定D．PCR技术可以直接扩增新冠病毒的遗传物质用于检测2．下列关于电泳的说法，错误的是()A．电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程B．带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动C．DNA在琼脂糖凝胶中的迁移速率与凝胶的浓度有关D．用琼脂糖凝胶电泳，DNA的电泳迁移速率完全取决于分子的大小DNA琼脂糖凝胶电泳是指利用在溶液中带负电荷的DNA分子在电场中向正极移动的原理，分离、纯化或分析PCR扩增后的待检DNA片段的生物化学技术。下列说法错误的是()A．DNA片段相对分子质量越大，迁移就越慢B．凝胶制备中加入的核酸染料能与DNA分子结合，用于分离后DNA片段的检测C．所有组分加入微量离心管后