TSH通过AKTAS160途径调控成骨细胞增殖分化影响的研究

TSH通过AKT/AS160途径调控成骨细胞增殖分化影响的研究摘要本研究本项目拟采用5-6代的小鼠成骨细胞作为实验对象，采用MTT观察不同浓度梯度的TSH，作用不同时间后大鼠成骨细胞增殖的变化；采用矿化结节染色及PNPP法测定碱性磷酸酶的活性，分析成骨细胞分化能力，揭示TSH对成骨细胞增殖分化的影响；进一步观察AKT和AS160的蛋白表达，探究TSH在细胞内的信号作用途径，揭示TSH通过AKT/AS160信号转导途径调控成骨细胞增殖分化。清楚外源性甲状腺激素长期使用对骨代谢的影响，为甲状腺激素临床合理使用提供理论和实验依据。关键词：TSH；成骨细胞；增殖分化；ALP；MTT；骨代谢甲状腺疾病是临床常见病，近几年发病率明显上升，其中亚临床甲状腺机能减退、甲状腺乳头状癌、甲状腺结节更为多见。上述疾病需要长期给予生理剂量或大剂量外源性左旋甲状腺素(L-T4)替代或补充治疗。予以外源性左旋甲状腺素，对促甲状腺激素（TSH）完全抑制被广泛应用于甲状腺乳头状或滤泡状癌等甲状腺肿瘤治疗中，完全性抑制一般指抑制TSH＜0.1mIU/L；而部分性抑制TSH被抑制在0.2-0.5mIU/L之间，用于抑制良性甲状腺结节或单纯性甲状腺肿的进展；对于亚临床甲状腺机能减退患者，治疗需要控制TSH在正常范围；除了长期给予生理剂量或大剂量外源性左旋甲状腺素(L-T4)替代或补充治疗给患者带来的获益外，是否这种长期外源性甲状腺素治疗导致机体TSH的不同水平对患者有何副作用，是非常值得我们研究的课题。一.过程1、研究对象采取本项目拟采用5-6代的小鼠成骨细胞作为实验对象2、研究材料和方法2.1主要实验仪器CO2恒温培养箱，德国Heraeus低温离心机，德国Heraeus-20℃冰箱，SANYOMedicalFreezer-70℃低温冰箱，SANYO超净工作台，YJ-1450苏州净化设备厂电热恒温水浴箱，上海医疗器械七厂自动双重纯水整馏器，D181OC上海丰胜生物技术有限公司SPECORD40紫外分光光度仪，英国analyticjena公司台式离心机，Heraeus，Megafuge1.ORBLll0S电子天平，德国SartoriuS倒置相差显微镜，日本Olympus公司pH计，Delta320梅特勒-托利多仪器上海有限公司PCR仪，Eppendorf公司紫外凝胶成像仪，美国ThermoForma公司.主要试剂DMEM/F12和RPMI1640培养基，Sino-AmericanBiotechnologyCompanyMTT，南京建成生物工程研究所PNPP，Sino-AmericanBiotechnologyCompanyNeonatalbovineserum(NBS)，四季青生物技术公司ZRGenomicDNA成套试剂盒，TiangenBiotechCompanyRT-PCR试剂盒，TiangenBiotechCompanyBiozol试剂，Sigma-Aldrich(St.Louis,USA)TRIZOL试剂，Sigma-Aldrich(St.Louis,USA)TritonX-100和Tris–HCl，武汉博士德生物技术公司1%茜素红，武汉博士德生物技术公司2%碱性磷酸酶，武汉博士德生物技术公司PBS，武汉博士德生物技术公司.2.2原代成骨细胞培养鉴定及处理①原代成骨细胞培养取新生（<24h）SD大鼠10只，体表清洗，75%酒精中浸泡10分钟，无菌条件下去头皮，削取颅盖骨，置于D-Hanks液中，剔除血管、骨膜等结缔组织，PBS冲洗3遍，清洗净的头盖骨剪碎，大小约1mm3。移入10ml0.25%胰蛋白酶溶液，37℃预消化20分钟，弃消化液。将骨片移入5mlⅡ型胶原酶溶液，37℃震荡消化50分钟，收集消化好的含细胞溶液，37℃110×g离心10分钟，弃上清液。沉淀细胞团块用DMEM/F12液冲洗2次，重新悬浮于含10%FBS，青霉素100U/L，链霉素100μg/L的DMEM/F12培养液中。剩下的骨片重复上述过程。两次获得的细胞悬液混匀以1×106/ml密度接种于50ml培养瓶，置于37℃，5%CO2饱和湿度条件下培养。24h后更换新鲜培养液，以后每48～72h换液。用0.25%胰蛋白酶消化细胞，在倒置显微镜下观察，至细胞分离、脱壁后，加入完全培养液终止消化，收集消化所得的细胞，待细胞85-90%融合，传代培养。实验前PBS冲洗细胞两遍，接种细胞于培养板上，然后加入无血清的DMEM/F12。实验细胞模型分组，分别加入不同浓度TSH和对照组，分别培养14d备用。②茜素红染色法用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗成骨细胞2遍，然后用95%酒精固定10分钟，蒸馏水冲洗，1%茜素红（PH4.2）染色，37℃浸泡60分钟，再用PBS冲洗2遍，镜下观察。③碱性磷酸酶染色法用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗成骨细胞2遍，然后用95%酒精固定10分钟，蒸馏水冲洗，2%碱性磷酸酶（PH8.2）染色，37℃浸泡30分钟，再用PBS冲洗2遍，镜下观察。3．MTT法分析细胞增殖细胞增殖能力直接反映细胞的生长情况，是评价骨形成的基本指标之一。采用MTT法对分离培养的成骨细胞增殖能力进行分析。培养半汇合成骨细胞经0.25%胰蛋白酶溶液消化后传代，10%NCS-MEM培养液重悬计数，以相同细胞密度（2×103/孔）接种于96孔培养板，容积为200μl/孔，常规培养48小时，细胞贴壁汇合90%，加入无血清DMEM/F12溶液，然后分别加入不同浓度TSH作用72h。测定MTT前3h，用PBS冲洗后更换MEM培养液100μl，同时在每孔加入10μl0.5%MTT（4℃，避光保存），培育箱孵育3h，加100μl10%SDS，37℃孵育2h。冷却至室温，酶标仪上波长570nm处，测定吸光度值(A)。细胞量与MTT吸光度值正相关。成骨细胞增殖促进率=（A干预组-A对照组）/A对照组×100%。4．碱性磷酸酶活性测定ALP为成骨细胞合成分泌的特异性功能酶，分解有机磷酸盐，诱导钙盐沉积，促进类骨质矿化。分化成熟功能活跃的成骨细胞碱性磷酸酶高表达。对硝基苯磷酸盐法（PNPP）测定细胞或培养液中ALP活性的绝对值与相应样品的蛋白或细胞量的比值（比活性Z）来分析其分化能力。培养半汇合成骨细胞经0.25%胰蛋白酶溶液消化后传代，10%NCS-MEM培养液重悬计数，以相同细胞密度（2×103/孔）接种于96孔培养板，容积为200μl/孔，常规培养48小时，细胞贴壁汇合90%，加入无血清DMEM/F12溶液，然后分别依次加入不同浓度TSH作用72h后，用PNPP法测定。取培养液10μl于96孔板，加底物反应液90μl（PNPP-DEA溶液：MgCl2﹒6H2O101.7mg，12NHCl1.95ml，DEA10ml加蒸馏水至50ml；临用前与3mmol/LPNPP等量配制），37℃水浴20分钟。加0.1mol/LNaOH90μl终止反应。酶标仪上波长405nm处，测定吸光度值(A)。通过样品A值在ALP标准曲线上读取酶活性值（U/L）。成骨细胞分化促进率=（Z干预组ALP-Z对照组ALP）/Z对照组ALP×100%。2.3成骨细胞Akt/AS160表达应用Westernblot法观察不同浓度梯度TSH作用不同时间后成骨细胞Akt/AS160表达变化，观察TSH对其影响。二、研究结果及结果分析培养细胞的鉴定1.1活体细胞观察倒置相差显微镜下，刚接种的细胞呈球形,悬浮于培养液中并逐渐沉降贴壁。24h后存活细胞基本贴壁,展开后细胞形态不规则，多呈三角形、多角形，有较多突起，单核呈卵圆形，含1-3个核仁，胞浆丰富。传代培养,生长期细胞分裂相多见，突起互相连接，细胞重叠生长,多层覆盖瓶底,呈铺路石状。细胞形态呈现梭形、多角形等多种形态。图2汇合状OB（×100）1.2碱性磷酸酶染色ALP为成骨细胞系合成分泌的标志性功能酶。分化成熟、功能活跃的成骨细胞质中ALP组织化学染色呈阳性反应。应用偶氮偶联法染色，酶活性部位与偶氮染料形成不溶性蓝色沉淀（图3）。图3OB的ALP染色（×100）1.3矿化结节茜素红染色成骨细胞具有体外矿化的功能特征，细胞传代培养，出现重叠生长，期间可见白色不透光圆形的矿化结节。茜素红染色法矿化结节染色呈红色。下图显示成骨细胞的矿化结节（图4）。图4OB矿化结节染色表1TSH对成骨细胞增殖分化的影响统计表TSHMTT%ALP%00.087±0.0211000.182±0.0191000.10.092±0.028105.7470.201±0.025110.4400.20.105±0.024120.6890.228±0.021125.2750.40.109±0.064125.2870.248±0.022136.2630.50.110±0.054143.8260.249±0.022136.81310.111±0.060127.5860.248±0.022136.26320.125±0.023143.6780.252±0.024138.46130.124±0.022142.5290.250±0.022137.36240.112±0.021128.7350.227±0.022124.72550.088±0.020101.1490.221±0.018121.429100.078±0.02289.6550.177±0.01497.253 图5TSH对成骨细胞增殖促进率影响柱状图（MTT分析法）图6TSH对成骨细胞增殖促进率影响柱状图（ALP分析法）1.4TSH对细胞AKT/AS160表达的影响为明确TSH与AKT/AS160表达水平是否有相关性。应用免疫细胞化学法检测AKT/AS160的表达阳性率，明确TSH不同浓度对成骨细胞ERα、β表达的影响。不同浓度TSH分别培养成骨细胞14d后检测。我们发现随着浓度增加，成骨细胞AKT/AS160表达在10μIU/ml的TSH浓度组增加最明显，此后随着浓度增加，但AKT/AS160表达未见明显增加。表2TSH对细胞AKT/AS160蛋白表达的影响(mean±S.D,%.)分组 AKTAS160ControlTSH(0.1μM)TSH(0.2μM)TSH(0.5μM)TSH(2.0μM)TSH(5.0μM)TSH(10.0μM)1.0±0.181.0±0.111.0±0.24*1.0±0.16*1.1±0.22*1.0±0.23*3.7±0.24﹟2.0±0.32#3.9±0.13﹟3.2±0.28#3.2±0.17﹟3.6±0.13#4.1±0.22﹟3.8±0.18#*p>0.05versuscontrol;﹟p<0.01versuscontrol;图7TSH对细胞AKT蛋白表达的影响柱状图图8TSH对细胞AS160蛋白表达的影响柱状图讨论亚临床甲状腺机能减退、甲状腺乳头状癌、甲状腺结节等甲状腺疾病是临床常见疾病，并且近几年发病率明显上升。上述疾病需要长期给予生理剂量或大剂量外源性左旋甲状腺素替代或补充治疗，而这种长期治疗对患者有何影响，是非常值得我们研究的课题。外源性左旋甲状腺素（L-T4）替代或补充治疗是否影响骨代谢，增加骨折风险，目前尚有争议。在一些横断面调查中，绝经前和绝经后外源性亚临床甲亢妇女有多部位骨密度减低，但在其他的一些研究中未得出相同的结论。一般认为长期L-T4治疗的危险极小，但国外研究认为长期超生理剂量L-T4治疗，导致骨质密度减低，并可增加与年龄有关的骨质疏松的危险。如何合理使用外源性甲状腺激素治疗上述疾病是临床上困扰医生的难题，因此研究外源性甲状腺激素对患者的影响具有十分重要的意义。目前国内外尚未见外源性甲状腺激素对骨代谢影响的报道。本课题拟采用5-6代的大鼠成骨细胞作为实验对象，采用MTT观察不同浓度梯度的L-T4和TSH，作用不同时间后大鼠成骨细胞增殖的变化；采用矿化结节染色及PNPP法测定碱性磷酸酶的活性，分析成骨细胞分化能力；通过双能X线骨密度仪检测亚临床甲状腺机能减退、甲状腺乳头状癌、甲状腺结节患者的骨密度，观察外源性甲状腺激素治疗后患者不同时段骨密度变化；揭示外源性甲状腺激素和促甲状腺激素对成骨细胞增殖分化影响，清楚外源性甲状腺激素长期使用对骨代谢的影响，为甲状腺激素临床合理使用提供理论和实验依据。本课题通过在TSH培养液中培养成骨细胞，检测MTT、ALP指标，在光镜下观察成骨细胞的形态、矿化结节等，观察到成骨细胞随着TSH浓度的增加,成骨细胞的增殖分化加强，当TSH浓度为2.0μIU/L的时候，其增殖分化程度最强，当再增加TSH的浓度的时候,成骨细胞增殖分化的程度下降，可能高浓度状态下，对成骨细胞的增殖分化有抑制作用。随着TSH浓度的变化，检测到能反映成骨细胞增殖分化的MTT和ALP指标的增长趋势一样。新疆医科大学的阿吉尼沙·阿克阿吉学者在甲状腺功能减退症TSH控制水平与骨密度的相关性研究和山东中医药大学于智超山东大学附属山东省立医院内分泌科徐进在甲状腺疾病与骨代谢的研究中发现当TSH浓度增加时可促进成骨细胞增殖分化，与本实验结果一致。应用Western

blot技术检测出AKT/AS160蛋白表达随着TSH浓度的增加而增加，在10.0μIU/L是时这两个通路的蛋白的表达最高，而且也观察到两个值的增加趋势一致。因此我们推断TSH可能通过AKT/AS160途径促进成骨细胞的增殖分化。其反映成骨细胞增殖分化的指标MTT和ALP，其高峰所对应的TSH浓度与AKT/AS160蛋白表达高峰时的TSH浓度不一致，说明可能存在其他的通路途径，需进一步探索。本实验属于体外实验，与体内实验差异较大，需再行在体实验进一步探究。五、结论综上所述，揭示出TSH增加了成骨细胞的增殖分化，并且揭示了TSH可能通过AKT/AS160信号转导途径调控成骨细胞增殖分化。六、参考文献[1]甲状腺疾病与骨代谢[J].于智超,徐进.

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