V-GMS的质量表征研究

第二部分正文引言在侵袭性真菌病中，最常见的是侵袭性肺曲霉菌病，主要由烟曲霉引起，有较高的发病率和死亡率[1]。伏立康唑(voriconazole,VRZ)是第二代三唑类抗真菌药，可以用于治疗侵袭性曲霉菌病[2]。但是VRZ水溶性低并且稳定性差，限制了其在临床上的应用。VRZ注射剂使用辅料磺丁基醚β-环糊精能有效提高其水溶性和稳定性，但有文献报道该辅料有肾脏毒性[3]。VRZ片剂溶出度低，治疗反应差[4]。因此有必要使用新的制剂方法来降低毒副作用，提高药物疗效。微球(microspheres,MS)是指药物溶解、分散或吸附在高分子材料骨架中，形成的微小球状实体，可采取口服、注射或皮下埋植等多种给药系统。作为一种新型给药递送系统(Newdrugdeliverysystem,NDDS)，打破了传统剂型的局限，被用于满足临床治疗不同的用药需求[5]。药物与适宜的载体材料制成微球后，可提高稳定性、实现缓释或控释、提高患者用药依从性、实现药物靶向治疗等[6]。在制备微球的众多方法中，乳化交联法是最常用的方法之一。该法制备微球成本较低、条件温和、操作步骤简单方便，不会破坏和降低负载药物的化学结构和生物活性[7]。氧化海藻酸钠(Oxidizedsodiumalginate,OSA)是由高碘酸钠氧化海藻酸钠(Sodiumalginate,SA)制备而成，含有两个醛基，可以与蛋白多肽类等生物活性物质中的氨基发生席夫碱反应，因此可以用于该类物质的交联[8]。作为一种新型天然交联剂，可以有效克服传统交联剂如戊二醛、甲醛等因材料降解而引发的对细胞的损伤作用[9]。本实验以OSA为交联剂，采用乳化交联法制备伏立康唑明胶微球(V-GMS)，以期能够解决VRZ溶出度低和稳定性差的问题。考察影响微球质量的因素，优化微球制备工艺，并对其外观形态、黏连度、平均粒径、包封率及载药量进行考察，为后续进一步研究V-GMS的稳定性、生物利用度及动物体内实验奠定基础，推动VRZ微球制剂在临床上的应用。1仪器与材料1.1仪器仪器厂家电子天平梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司IKAHS7型数显加热磁力搅拌器江苏省科学器材有限公司DHG-9123A型电热恒温鼓风干燥箱上海一恒科技有限公司新型DZ-280/2SE小型真空封装机广州市赛豪机械有限公司SCIENTZ型超声波细胞粉碎机宁波新芝生物科技股份有限公司SCIENTZ型超声波细胞粉碎机隔音箱宁波新芝生物科技股份有限公司SK8200HP型超声波清洗器上海科导超声仪器有限公司TU-1810型紫外-可见分光光度计北京普析通用仪器责任有限公司E200MV型生物显微镜南京尼康江南光学仪器有限公司低速台式离心机上海安亭科学仪器厂数显恒温水浴锅杭州大卫科教仪器有限公司NicoletiS10型傅里叶变换红外光谱仪东莞市欧诺斯仪器有限公司1.2材料试剂批号及厂家高碘酸钠批号7790-28-5，上海凛恩科技发展有限公司无水乙醇批号20200416，杭州双林化工试剂有限公司异丙醇批号20180801，杭州汉诺化工科技有限公司液状石蜡批号20130401，江苏强盛功能化学股份有限公司伏立康唑批号V129745，阿拉丁乙二醇批号1926109，阿拉丁司盘80批号J1417009，阿拉丁明胶批号20160729，国药集团化学试剂有限公司海藻酸钠批号F20080312，国药集团化学试剂有限公司2方法与结果2.1新型天然交联剂OSA的制备根据相关文献[10]，采用高碘酸钠氧化SA的方法制备OSA：（1）精密称取10.00g海藻酸钠，分散在50mL无水乙醇中，得到混悬液；精密称取8.64g高碘酸钠，溶于50mL纯化水中，得到溶液。（2）将溶液加到混悬液中，遮光搅拌一定时间，滴加与高碘酸钠相同摩尔量的乙二醇终止反应。（3）将该反应混合液加到4倍体积的无水乙醇中，静置一段时间后，弃上清液。用纯化水溶解，再用无水乙醇沉淀，反复洗涤沉淀3次。（4）抽滤，得到白色产物。将该产物放置于白纸上，于50℃环境下烘干10min。计算OSA的产率，约为88.8%。2.1.1氧化机理SA含有相邻的两个羟基，利用强氧化剂高碘酸钠可以断裂C-C键，与IO4-反应生成环张力较小的络化物，进一步脱水，最终生成含有两个醛基结构的化合物——OSA，IO4-则被还原为IO3-[11]。具体反应过程如图1所示。图1海藻酸钠氧化机理Fig.1Theoxidationmechanismofsodiumalginate2.1.2结构表征通过东莞市欧诺斯仪器有限公司NicoletiS10型傅里叶变换红外光谱仪(FT-IR)，表征OSA与SA的结构，如图2所示。OSA从OSA与SA的红外谱图可以看出，经过高碘酸钠氧化后，OSA在1715cm-1附近出现了一个新的吸收峰，这是-CHO的对称伸缩振动峰；在3420cm-1附近吸收峰增强，这是-CHO的面内弯曲振动峰。说明可以利用高碘酸钠氧化SA的方法，以制备含有醛基的OSAOSASASA图2氧化海藻酸钠与海藻酸钠的红外光谱图Fig.2FT-IRspectraofOSAandSA2.1.3OSA与SA的性能比较SA分子链上的某些化学基团可以和Ca2+发生配位反应，长链的SA分子就会在Ca2+的交联作用下聚在一起，形成不溶于水的凝胶球——海藻酸钙微球。分别取等量1%的OSA水溶液和SA水溶液于两支试管，滴加等量5wt%的CaCl2溶液，观察现象。结果如图3所示。OSA呈混悬状态，而SA则形成不溶于水的凝胶球。OSASAOSASA图3氧化海藻酸钠与海藻酸钠的性能比较Fig.3TheperformancecomparisonofOSAandSA2.2空白GMS的制备采用乳化交联法制备空白GMS：（1）称取适量明胶于盛有冷水的烧杯中，溶胀。加热至50℃，搅拌一定时间至明胶完全溶解，配制成一定浓度的明胶水溶液作为水相，若有气泡则静置一段时间。（2）液状石蜡中加入适量的乳化剂司盘80作为油相，温热至50℃。（3）将水相滴加至油相中，以一定转速搅拌乳化一定时间后，立即转移至冰水浴中。（4）加入适量OSA进行固化交联，一定时间后加入适量异丙醇进行脱水。抽滤、洗涤、干燥，即得黄色的空白GMS。2.2.1正交设计试验2.2.1.1因素及水平安排以乳化交联法制备空白GMS的方法为基础，根据相关参考文献及单因素考察试验结果，选择对微球成球影响较显著的三个因素即搅拌速率(A)、油水相比(B)及乳化剂用量(C)作为考察对象，每个因素选取3个水平，因素水平见表1。考察主要因素时，保持其他因素不变。对微球成球情况进行研究分析，包括外观形态、黏连度及平均粒径。表1正交试验因素水平表Tab.1Factorsandlevelsusedinorthogonalarraydesign因素水平123A(r·min-1)500700900B(mL:mL)5:110:115:1C(%)1.52.02.52.2.1.2试验安排按照L9(34)正交设计表进行试验安排，如表2所示。表2正交设计表Tab.2DesignoforthogonaltestofGMSpreparation组号A(r·min-1)B(mL:mL)C(%)1111212231334212522362317313832193322.2.2正交设计试验结果将每个试验组制备的微球分别置于生物显微镜下观察其外观形态和黏连度，观测100个微球并测定其平均粒径。正交试验结果见表3。表3正交试验结果Tab.3ResultsoforthogonaltestofGMSpreparation组号外观形态黏连度平均粒径(μm)1规则圆整分散良好，无黏连23.352规则圆整分散良好，无黏连36.833不规则黏连严重13.524规则圆整分散良好，无黏连14.745规则圆整黏连严重17.186不规则黏连严重22.117规则圆整分散良好，无黏连15.838规则圆整分散良好，无黏连22.359规则圆整分散良好，无黏连10.72由表可知，第1、2、4、7、8、9组制备的微球外观规则圆整，且分散良好，不存在黏连现象。其中，第4、8、9组制备的微球粉末较细致。取适量微球分散在一定浓度的苯酚红乙醇溶液中，搅拌一定时间后，吸取适量微球于表面皿。待分散介质挥发后，将微球轻涂于载玻片，滴加液状石蜡助分散，在生物显微镜下观察。可见微球呈亮黄色的球形，表面光滑圆整，分散良好，粒径分布较均匀，且无明显的黏连现象。如图4所示。10μm10μm图4明胶微球生物显微镜图片Fig.4ThemicroscopepictureofGMS各试验组制备的微球的平均粒径在10.72~36.83μm范围，其中第8组制备的微球粒径分布更均匀。通过对各正交试验组制备的微球的外观形态、黏连度及平均粒径的比较，筛选出制备微球质量较好的试验组——第8组，确定制备空白GMS的最优处方工艺是A3B2C1，即：搅拌速率900r·min-1，油水相比10:1，乳化剂用量1.5%。2.2.3重现性分析按照确定的空白GMS的最优处方工艺反复重现，其外观形态、黏连度及平均粒径相差不大。2.3V-GMS的制备采用乳化交联法制备V-GMS：（1）将VRZ溶于少量无水乙醇，加入适量一定浓度的明胶水溶液，加热至50℃，混合均匀后作为水相，若有气泡则静置一段时间。（2）液状石蜡中加入适量的乳化剂司盘80作为油相，温热至50℃。（3）将水相滴加至油相中，以一定转速搅拌乳化一定时间后，立即转移至冰水浴中。（4）加入适量OSA进行固化交联，一定时间后加入适量异丙醇进行脱水。抽滤、洗涤、干燥，即得V-GMS。2.4V-GMS的质量表征2.4.1VRZ标准曲线的绘制精密称取VRZ25mg，置于烧杯中，加纯化水溶解，转移至250mL容量瓶中，定容，摇匀，得储备液。取储备液适量在200～400nm波长范围内进行紫外扫描。如图5所示，VRZ在256nm处有最大吸收。分别精密量取储备液5.0mL、7.5mL、10.0mL、12.5mL、15.0mL、17.5mL、25.0mL于50mL容量瓶中，用纯化水定容，配制浓度分别为10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL、25μg/mL、30μg/mL、35μg/mL、50μg/mL的VRZ标准溶液。按照紫外分光光度法，用纯化水作空白对照，在256nm波长处测定吸光度；以吸光度(A)对浓度(C)进行线性回归，得到回归方程：A=0.0209×C-0.0004(R2=0.999)；结果如图6所示。VRZ溶液的吸光度值在10～35μg/mL浓度范围内，呈现良好的线性关系。图5伏立康唑紫外扫描图Fig.5TheUVscanningmapofVRZ图4伏立康唑在纯化水中的标准曲线Fig.4ThestandardcurveofVRZinpurifiedwater2.4.2回收率试验精密称取VRZ标准品适量，配制VRZ标准溶液，配制10μg/mL、20μg/mL、35μg/mL三个浓度样品，然后在最大吸收波长256nm处测定吸光度，测定VRZ的含量，每个样品重复测量三次，计算回收率。回收率试验结果如表4所示。表4伏立康唑溶液回收率（n=3）Tab.4RecoveryofVRZsolutionreferencesubstances(n=3)浓度(μg/mL)回收率(%)平均回收率(%)RSD(%)1231098.85100.43101.17100.151.1820101.6599.62101.55100.941.1335101.60100.25100.18100.680.80由上表可知，该测定方法回收率高，介于100%~101%之间且RSD＜2%，符合方法学要求。2.4.3精密度试验选取低、中、高3个浓度（10μg/ml、20μg/ml、35μg/ml）的标准溶液，每个浓度1天内重复测定5次，计算日内相对标准偏差。按照相同的方法每天同一时间进行测定，每个浓度1天测定1次，连续测定5天，计算日间相对标准偏差。精密度试验结果如表5所示。表5精密度试验结果（n=5）Tab.5Resultsofprecision(n=5)浓度日内日间(μg/mL)平均值(μg/mL)RSD(%)平均值(μg/mL)RSD(%)109.982.09.962.142020.171.020.413.143535.070.935.672.08由上表可知，日内精密度RSD＜2%，日间精密度RSD＜15%，该方法精密度高，符合方法学要求。2.4.4V-GMS的外观形态、黏连度及平均粒径使用生物显微镜观察微球的外观形态和黏连度并测定其平均粒径。所制备的V-GMS形态为球形，外观规则圆整，表面光滑，分散良好，粒径大小均匀，平均粒径为20.09μm，如图5所示。图5伏立康唑明胶微球生物显微镜图片Fig.5ThemicroscopepictureofV-GMS2.4.4V-GMS的载药量及包封率将制备的V-GMS研磨至碎，用无水乙醇超声溶解VRZ，离心后取上清液，以无水乙醇为空白对照，在最大吸收波长256nm处测定吸光度，并利用标准曲线计算出微球中VRZ的含量。每批微球平行测定3次，根据下列公式计算微球包封率和载药量。微球载药量=(微球中VRZ的含量/微球的总重量)×100%微球包封率=(微球中VRZ的总量/投药量)×100%表5伏立康唑明胶微球载药量及包封率（n=3）Fig.5V-GMSdrugloadingandencapsulationrate（n=3）样品载药量(%)包封率(%)12.9814.9722.7815.0333.2515.28平均3.0015.093讨论3.1乳化交联法乳化交联法是指在搅拌或超声等外力作用下，利用表面活性剂，根据药物和高分子载体材料的性质，制成W/O或O/W型等单乳化或复乳化的乳化体系，再加入合适的交联剂使之固化成微球。含有醛基的交联剂可以和含有氨基或羟基的高分子载体材料之间发生席夫碱缩合反应，从而交联固化微球。药物则溶解、分散或被吸附在高分子载体材料、聚合物基质中[7,12]。3.2载体材料的选择用于微球制备的载体材料，可以根据其来源大致分为天然高分子材料和合成高分子材料两大类，前者主要包括蛋白质类（明胶、白蛋白）和多糖类（葡聚糖、壳聚糖、海藻酸盐、淀粉）[13]。明胶作为一种大分子的亲水胶体，是非常重要的天然高分子材料之一。其来源广泛，性质稳定，具有成膜性、生物可降解性、与机体组织良好的生物相容性，因此是一种优良的载体材料[14]。由明胶制备的载药微球的药物包封率和载药量都较高[15]，而且可以实现药物的缓释或控释和靶向治疗作用，从而可以明显提高药物的治疗效果，减少生物组织和器官损伤，减轻毒副作用[16]。3.3搅拌速率搅拌速率对微球的粒径与粒径分布有显著的影响，只有当搅拌速率达到一定程度时，才可以使分散相分散成微小的乳滴，从而形成均一稳定的乳化体系。搅拌速率越快，剪切力越大，形成的乳液液滴直径越小，因而制备的微球粒径也越小。但是当搅拌速率过快时，有可能使微球不规整或碎裂，也可能会使粒径较小的微球重新聚合为较大的微球，反而使粒径分布范围广。相反，当搅拌速率过小时，形成的微球粒径较大，圆整度亦较差。3.4油水相比影响微球形态最直接的因素是油、水两相的容积比，简称相容积比。实际上，当乳化体系的相容积比在40%~60%范围内时比较稳定。当分散相的体积小于25%时，乳化不够完全，形成的乳滴容易分层，稳定性较差；超过60%时，乳滴与乳滴之间的距离很近，易发生碰撞而合并，甚至引起转相，因而使制备的微球分散性较差，黏连现象严重。因此在制备乳化体系时，应慎重考虑分散相和连续相的相容积比，以利于形成均一稳定的乳化体系。3.5乳化剂用量乳化剂用量是影响微球制备工艺的另一个重要因素。当乳化剂用量在0.5%～2.5%范围内，乳化剂用量越大，微球平均粒径越小，粒径分布越窄。当乳化剂用量过少时，不能充分乳化乳液，使乳化时间较长。当乳化剂用量为3.5%时，微球平均粒径反而增大，这是由于乳化剂用量过大，乳化体系黏度增加，搅拌过程中形成的乳滴直径增大，因而使微球的平均粒径有所增大。而且乳化剂用量过大会造成微球外观形态不规则圆整，表面不光滑，分散性较差，有黏连现象。亦会造成乳化剂浪费，增加制备工艺的生产成本。4结论本实验选取明胶为载体材料，OSA为交联剂，采用乳化交联法制备V-GMS的最优处方工艺为：搅拌速率900r·min-1，油水相比10:1，乳化剂用量1.5%。所制备的载药微球的平均粒径为20.09μm，外观规则圆整，分散良好且无黏连，载药量为3.00%，包封率为15.09%。参考文献[1]庾胜,张碧波.两性霉素B脂质体与伏立康唑治疗侵袭性肺曲霉菌病临床对比观察[J].山东医药,2016,56(04):86-88.[2]赵波,刘思佳,赵博欣,等.呼吸科肺部真菌感染住院患者伏立康唑血药浓度监测分析[J].中国医院药学杂志,2018,38(15):1644-1647.[3]AsharaKC,PaunJS,SoniwalaMM,etal.MicroemulgelofVoriconazole:anUnfathomableProtectiontoCounterFungalContagiousness[J].NephronClinicalPractice,2017,59(4):461-471.[4]辛伟,张素娟,杨丽霞,等.伏立康唑片的制备及其质量评价[J].中国现代应用药学,2013,30(02):151-154.[5]王振旺.乳化交联法制备壳聚糖微球及其包载药物的研究[D].天津大学,2007.[6]AminabhaviTM,NadagoudaMN,MoreUA,etal.Controlledreleaseoftherapeuticsusinginterpenetratingpolymericnetworks[J].ExpertOpiniononDrugDelivery,2015,12(4):669-688.[7]邓阳全,邵丽,杨银,等.乳化交联法在载药微球制备中的应用及研究进展[J].世界科技研究与发展,2009,