测定肉制品中8种人工合成着色剂

正文1材料与方法1.1主要试剂与材料1.1.1甲醇，色谱纯，ThermoFisherScientific；1.1.2乙酸铵，色谱级，Aladdin；1.1.3石油醚，分析纯，XiLongScience；1.1.4无水乙醇，分析纯，SinopharmChemicalReagentCo.,Ltd；1.1.5氨水，分析纯，SinopharmChemicalReagentCo.,Ltd；1.1.6标准物质苋菜红溶液、日落黄溶液、胭脂红溶液、柠檬黄溶液，0.5mg/ml，中国计量科学院；赤藓红溶液、酸性红溶液,1mg/ml，北京海岸鸿蒙标准物质技术有限责任公司；新红、诱惑红固体，100mg，北京海岸鸿蒙标准物质技术有限责任公司；1.1.7提取液：无水乙醇与去离子水以体积比7:3比例混合；1.1.8实验用样品：市售火腿肠。1.2主要器材与设备UltiMate3000高效液相色谱仪，ThermoFisherScientific；旋转蒸发器，BUCHILabortechnikAG；超声波清洗器,ShanghaiKudosUltrasonicInstrumentCo.Ltd；台式离心机，HunanKaidaScientificInstrumentCo.,Ltd；不同规格的移液枪数只、50mL具塞离心管数只、25mL鸡心瓶数只、10mL容量瓶数只、50mL容量瓶数只、一次性针头过滤器数只、微孔滤膜(0.45μm，AgilentTechnologies)1.3色谱条件1.3.1仪器条件色谱柱使用的是AgilentBridgeC18色谱柱(4.6×150mm，5μm)，色谱柱温度设定为35℃；检测器为紫外检测器，波长设定为254nm[3]；流动相使用的是色谱级甲醇和0.02mol/L乙酸铵溶液，进样体积为10μL，流速为1ml/min。1.3.2梯度洗脱程序梯度程序见表1。表1梯度洗脱表流动相洗脱时间(min)1101318甲醇（%）590905乙酸铵（%）95101095注：乙酸铵浓度为（0.02mol/L）。1.4样品前处理方法1.4.1试样的提取试样经过简单预处理后，称取5g(精确至0.001g)的样品于50ml离心管中，加少量石油醚超声5min。待石油醚自然蒸发干后重复两次。待脂肪被完全除去后加入10ml提取液，超声提取15min，使试样与提取液充分接触。最后上离心机离心5min取上清液，以上步骤重复提取两次，合并提取液，等待下一步上柱净化[4]。1.4.2试样的净化首先将固相萃取小柱（上海安谱实验科技有限公司）活化，用的是5mL甲醇和5mL去离子水。待甲醇和去离子水过柱后，下一步上样。将全部待净化液过柱，控制流速。待净化液过柱后用5mL甲醇-水（6:4）淋洗。最后用10ml10%氨水-甲醇（1:9）洗脱，收集洗脱液于鸡心瓶中[5]。然后上旋转蒸发器蒸去多余液体，此过程需要控制温度在40℃。蒸发至接近完全干燥后用水定容至5ml，用一次性针头式过滤器配合0.45μm滤膜过滤装瓶，等待进一步上机检测。1.5标准系列的确定准确称取新红0.00057g，诱惑红0.00064g于10ml容量瓶中，分别吸取酸性红溶液0.5ml，赤藓红溶液0.5ml，胭脂红溶液0.5ml，柠檬黄溶液1ml，日落黄溶液1ml，苋菜红溶液1ml于同一容量瓶中，用水定容至10ml，制成浓度为50μg/ml的合成着色剂混合标液中间液。分别吸取中间液0.04ml，0.1ml，0.2ml，1ml，2ml，4ml于10ml容量瓶中，制成合成着色剂混合标液工作液。新红的浓度为0.228、0.57、1.14、5.7、11.4、22.8μg/ml；诱惑红的浓度为0.256、0.64、1.28、6.4、12.8、25.6μg/ml；胭脂红的浓度为0.1、0.25、0.5、2.5、5、10μg/ml；其余的组分浓度为0.2、0.5、1、5、10、20μg/ml。2结果与讨论2.1样品前处理条件的确定首先对样品进行除脂，用石油醚除去样品的脂肪可使后续步骤更加顺利进行，并且可有效防止干扰峰的出现[1]。在最新国家标准中，合成着色剂的检测方法只有高效液相色谱法一种。在这个方法中，色素提取这一步有两种方法，分别是聚酰胺吸附法和液-液分配法。但是这两种方法操作复杂、过程繁琐、费时费力，有相当多的实验步骤，也用到相当多的器材与试剂，在实际操作过程中实行起来并不方便，很难实现日常实验的需要。关晓月、张昊天等人便是采取的是聚酰胺吸附法，结果虽然很好，但是其过程步骤繁冗琐碎，并不是最好的选择[6]。因此本方法改用固相萃取的方式来进行色素提取。本次选用的是CNWPoly-seryGB5009.35-2016食品中合成着色剂专用SPE小柱，用该固相萃取柱进行色素的提取和净化[7]。过程包括了固相萃取小柱的活化、上样、淋洗、洗脱。洗脱后收集的液体即是色素提取完成后的含有色素的收集液。和国标相较之下更加方便快捷，节省了大量的试剂和器材，节约了相当的经济成本和人力成本[8]。2.2样品色素提取液的确定本次实验所用的提取液为无水乙醇和水以体积比7:3混合而成。经过试验，该提取液提取样品中合成着色剂的效果较好。经过查阅其他文献资料可知提取液还有体积比7:2:1的乙醇-氨水-水的提取液。经过试验，该提取液效果也很好，不过后续需要一步调节pH值的步骤。最后决定用体积比7:3的乙醇-水作为本次实验所用的提取液[9]。2.2.1流动相洗脱梯度的确定在国家标准的基础上进行简化，经过多次试验之后，在表1的洗脱程序之下，8种合成着色剂得到很好的分离，分离完全，出峰时间稳定，峰型完整。2.3标准曲线表28种合成着色剂的标准曲线及相关系数合成着色剂名称线性方程相关系数柠檬黄Y=0.5095X-0.01020.9999新红Y=0.3135X+0.00860.9999苋菜红Y=0.4845X-0.00790.9999胭脂红Y=0.4786X+0.00050.9999日落黄Y=0.4011X+0.00490.9999诱惑红Y=0.2658X+0.00260.9999酸性红Y=0.2233X-0.00520.9999赤藓红Y=0.3110X-0.00490.9999将浓度分别为0.1、0.5、1.5、10、20μg/ml的标准溶液工作液进行测试，标准曲线方程及相关系数见上表2，线性范围为0.5~50μg/ml，各种合成着色剂的检出限为0.2μg/ml，定量限为0.5μg/ml。下图1为标准溶液在254nm下的色谱图。图18种合成着色剂在254nm下的液相色谱图2.4添加标准工作液后的检测结果分别称取空白本底值的样品5.000g(精确至0.001g)，添加标准溶液工作液。添加水平0.5、1、5μg/ml，每个水平添加4份。按照1.4.1，1.4.2进行样品处理。制成待测液上机分析。得到整体回收率为60.2%~103%，RSD小于8.53%。在这里列出添加水平为1μg/ml的结果，见下表3。从整体结果来看，除柠檬黄与日落黄外，其他合成色素的回收率与精密度均非常良好。柠檬黄与日落黄回收率稍稍低于平均水平，可能在实验过程中这两种合成色素发生了损失，这是本方法的不足之处。有可能是波长的问题，蒋荣华、吴玉杰等人认为在254nm波长下，有吸收的化学成分太多，很可能对测定的其他成分造成干扰[10]。刘剑波、余莲芳等人采用选择用不同的波长对来检测各个不同的组分，他们最终选择了415nm,515nm,610nm等不同的波长[11]。表3添加水平为1μg/ml的回收率与精密度合成着色剂名称回收率精密度柠檬黄71.23%6.39%新红89.10%4.77%苋菜红103.02%4.79%胭脂红99.74%6.69%日落黄77.84%8.53%诱惑红87.05%7.54%酸性红96.11%6.54%赤藓红80.34%5.00%2.5误差分析误差产生的主要步骤在于色素提取那一步，即使用固相萃取小柱的步骤。在使用固相萃取小柱时需要注意几点：第一点：控制流速。不管是在活化、淋洗还是在洗脱步骤，都要控制液体的流速。流速不可过快，保持小柱出口处的液体是平稳的一滴一滴的滴下即可。如果流速过快，液体成线流出，则会使提取净化过程大打折扣，极大程度上影响回收率。第二点：保持柱床完整、不干涸。使用固相萃取小柱的过程中，在排出液体时，不能用力过猛。用力过猛的话不仅会使流速过快，影响提取净化过程，还会破坏柱床，导致成分损失。同时也要保证柱床湿润，不能挤干。如果将柱床完全挤干，同样会导致柱中的成分损失。其余步骤也会导致一些误差。比如在旋转蒸发的过程中温度不能过高，需要控制温度，温度过高则会造成目标液的损失。比如在液体的转移过程，或者在最后的定容的过程中都会产生误差。需要注意的是在液体的转移过程中要减少液体的残留，在最后定容装瓶时，也要注意将鸡心瓶内所有物质转移出，不能有残留。结论本实验建立了一种高效液相色谱法，可用来测定肉制品中8种人工合成着色剂(柠檬黄、新红、苋菜红、胭脂红、日落黄、诱惑红、酸性红、赤藓红)的含量[8]。主要优化的步骤是色素提取的步骤。在色素提取的步骤，首先确定提取液，经过试验最终选择7:3的乙醇-水作为提取液。然后采用固相萃取小柱对样品中的合成着色剂进行提取和净化。对比最新食品安全国家标准中的聚酰胺吸附法和液-液分配法，本步骤操作更加