《水产动物免疫学》贝类的免疫

水产动物免疫各论贝类的免疫第一节贝类及其免疫的特性一、贝类

贝类属于软体动物门，分7纲，大多数分布于海洋中，多营底栖生活，有些已是水产上的主要养殖对象单板纲、多板纲、无板纲、腹足纲、掘足纲、瓣鳃纲（双壳纲）和头足纲栉孔扇贝

Zhikong

scallop，Chlamys

farreri虾夷扇贝

Patinopecten

yessoensis海湾扇贝

Gulf

scallop，Argopecten

irridians菲律宾蛤仔

Ruditapes

philippinarum皱纹盘鲍

Haliotis

discus

hannai太平洋牡蛎

Pacific

oyster，

Crassostrea

gigas海湾扇贝虾夷扇贝太平洋牡蛎菲律宾蛤仔皱纹盘鲍缢蛏栉孔扇贝

软体动物的形态结构差别大，但基本结构相似。体外被外套膜，分泌形成贝壳。水生软体动物用鳃呼吸，鳃由外套腔内壁皮肤伸展而成；软体动物同时存在初生体腔和次生体腔；

次生体腔极度退化，仅残留围心腔、生殖器官和排泄器官的内腔

初生体腔存在于各组织器官之间，血液在其中流动，这些空隙称为血窦

贝类的血液循环为开管式循环，一些体大、行动敏捷的软体动物为闭管式循环

血液一般无色、内涵变形虫状血细胞，但毛蚶等因含血红素呈红色，乌贼含血青素，呈青蓝色闭壳肌口足内脏神经节肠性腺鳃外套腔水管足神经节肛门肾脏心脏围心腔膜肝胰腺胃二、贝类免疫的特性

软体动物的进化已经到了较高的程度，有较完善的器官系统及功能，存在着对外来入侵者的防御和修复自身组织损伤的机制。

贝类免疫功能分为细胞防御和体液防御。贝类细胞免疫学与高等动物和甲壳类的不同之处为：1、在贝类中，内部防御系统比许多节肢动物和脊椎动物更依赖于细胞防御；2、免疫防御更依赖于先天的成分，即非特异性反应，例如水解酶活力、细胞的吞噬能力和细胞介导的对病原的细胞毒作用；3、贝类表现出一种强烈的在体外凝集的现象。贝类的免疫反应主要依赖于血细胞的吞噬、包裹、呼吸爆发等细胞免疫反应，血淋巴中的一些酶及调节因子在免疫中也有重要作用。一、贝类的细胞防御1、贝类血细胞的分类及结构第二节贝类免疫的机制（1）非颗粒细胞，又称透明细胞：其细胞质染色很淡，几乎不含颗粒或含微量颗粒，极少或完全没有细胞器；（2）颗粒细胞：其细胞质中含有数量不等的染色颗粒。因细胞内颗粒染色性质不同分为嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞两种。2、血细胞免疫功能

吞噬作用

异己识别

呼吸爆发

包囊作用

其他免疫功能

吞噬作用贝类的主要防御手段是由血细胞完成的吞噬作用，吞噬作用能够清除入侵的病原体。吞噬作用主要是由颗粒细胞完成的，而且其吞噬能力与年龄无关，但易受外界环境因素的影响。吞噬作用的过程大致可以分为趋化、粘附、内吞以及杀伤消化4个阶段。血细胞对吞噬后的病原体的杀伤作用主要通过两条途径实现。1、将外源颗粒内化后形成吞噬小体，然后吞噬小体与含有水解酶类的胞质颗粒融合，逐步将外源颗粒水解消化。2、通过伴随吞噬作用的呼吸爆发来激活位于质膜上的NADPH氧化酶，从而产生多种活性氧中间体来杀伤病原微生物。如何识别异物？趋化过程中首先进行识别，识别后的清楚速率取决于细胞表面的特征，吞噬反应的强度由外源颗粒的表面特征和调理素及內源凝集素等类似调理素的调理因子共同控制

异己识别吞噬作用调理素对血细胞识别异物有重要的促进作用。贝类血细胞的趋化、粘附和吞噬过程都可被某些血清因子促进，说明贝类血细胞对异物的识别类似于高等生物，也依赖血浆中某些因子的作用，这些因子统称为调理素吞噬细胞的脱颗粒作用释放出的酶可以修饰外来细胞的表面结构，从而是外源细胞被有效识别，因子溶酶体酶也起到调理素作用贝类血淋巴中的内源性凝集素对于识别和吞噬外源颗粒具有重要的辅助作用。凝集素是一种糖蛋白，具有糖结合专一性，可与细胞表面的不同糖组分结合，同时可以与吞噬细胞相结合。凝集素在贝类中广泛存在，血清、血细胞表面一些凝集素可使细菌凝集，便于血细胞对其进行吞噬，一些作为血细胞和细菌表面的中介分子介导吞噬过程。由于贝类没有类似高等动物主要组织相容性复合体（MHC）和免疫球蛋白（Ig）那样基于可重排分子的识别系统，贝类对异物的识别主要依赖一些其他非特异的识别因子。天然免疫识别分子可以识别一大组或几大组病原体所共有的、保守的、不同于宿主自身成分的某类分子的结构模式，称为病原体相关分子模式（pathogen

associated

molecular

pattern，PAMP）,如细菌细胞壁中的肽聚糖、革兰氏阴性菌细胞壁的脂多糖、革兰氏阳性菌细胞壁的磷壁酸、RNA病毒的双链RNA等。天然免疫分子识别的不是高度专一性的空间结构和化学结构，而是某种结构模式，因而是广谱的。这些对病原相关分子模式进行识别的免疫识别分子包括血浆中的调理因子以及血细胞表面的某些受体

呼吸爆发呼吸爆发伴随着吞噬作用而产生，在这个过程中可产生大量的活性氧中间体来杀灭和消化病原微生物，在免疫防御中起重要作用。呼吸爆发的第一个反应是氧还原一个电子形成超氧阴离子，超氧阴离子被胞质超氧化物歧化酶催化转化成为过氧化氢。过氧化氢活性很高，是有毒的活性氧中间体之一，与髓过氧化物酶及卤素形成强力杀菌系统的基础。很多贝类的血细胞都有典型的呼吸爆发现象，同时伴有活性氧中间体的产生。

包囊作用如果异物比血细胞大得多，直径大于10μm时，则血细胞对异物的吞噬将动员全部的细胞膜面积，表现为血细胞在异物表面完全伸展，扁平化，由若干吞噬细胞共同将异物包裹起来，称为包裹作用。血细胞通过细胞内消化和细胞外消化将被包裹的异物消除。

炎症和伤口修复贝类的炎症发生包括其机体的细胞和体液因素，通常是一种机体的自我保护性反应。它一般是由单纯的组织损伤或因之而引起的物理、化学或生物因子侵扰开始，继而产生三种可能结果：（1）组织坏死；（2）机体将入侵微生物隔离；（3）伤口修复贝类的炎症反应与脊椎动物的炎症反应基本相似，不过，由于贝类为开放型的循环系统，使两者在细节上又存在较大的差异。在一般情况下，贝类从炎症开始到伤口修复主要经历几个过程：（1）大量的血细胞渗入受伤组织；（2）受伤约44小时后，血细胞聚集形成血栓；（3）病灶从内向外由变长的血细胞替代受伤组织；（4）成纤维细胞使胶原蛋白沉着；（5）巨噬性颗粒细胞清除坏死组织碎屑；（6）正常的组织结构重建二、贝类的体液防御因子

溶酶体酶贝类的溶酶体酶主要存在于颗粒细胞的溶酶体中，溶酶体酶主要有溶菌酶、酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、脂肪酶、β-葡萄糖苷酸酶等。颗粒细胞在吞食异物脱颗粒时这些酶被释放到血清中，发挥免疫防御、消化分解食物及调节代谢等作用。溶菌酶(Lysozyme)是其中最重要的一种，其作用机制是通过溶解细菌细胞壁中肽聚糖成分，从而使细菌的细胞壁破碎，细胞崩解。溶菌酶不仅能溶解杀灭多种细菌，防御病害，还有滤食海洋细菌的作用。酸性磷酸酶（ACP）和碱性磷酸酶(ALP或AKP)是动物体内参与免疫防御的两种重要水解酶，能催化有机磷酸酯水解，打开磷酸酯键，释放磷酸根离子。磷酸酶可以通过改变细菌表面的结构增强其异己性，起调理素作用，从而加速吞噬细胞吞噬和降解异物的速度，因此在免疫防御中发挥重要作用。

凝集素（Lectin）根据性质和功能，凝集素可以定义为一大类对特定细胞多糖具有结合亲和力的、能选择凝集脊椎动物一些细胞和某些微生物细胞的、多价构型的糖蛋白。凝集素是贝类血淋巴的常见成分，在双壳贝类中广泛存在，是贝类免疫防御的重要体液因子之一。凝集素作为贝类的一种非特异性识别因子，能识别病毒、细菌、真菌、原虫和非生命物质，可以通过凝集包围、调理、促进血细胞的吞噬作用等方式将外来物质清除，并参与机体止血、凝固、物质运输及创伤修复等一系列作用。贝类的各种凝集素虽有一定的特异性，但并非抗体，与脊椎动物的免疫球蛋白没有相同的氨基酸序列。

抗菌肽抗菌肽是动物或植物细胞中，由特定基因编码的一类具有广谱抗菌活性的小分子多肽。在海洋贝类体内也存在多种抗菌肽，并发挥重要的防御功能。抗菌肽以前体的形式存在，在缺乏感染刺激物的情况下，成熟前体以活性方式储存在血液中，在机体受到细菌感染后引起抗菌肽增加并在数小时迁移至感染部位，在感染部位吞噬细菌以发挥其抗菌活性。自太平洋牡蛎的鳃中发现了一种新的富含二盐基重复区域的抗菌肽它可能是太平洋牡蛎特有的抗菌肽

氧化酶和抗氧化酶类1、酚氧化酶（PO）和髓过氧化酶（MPO，过氧化物酶）是动物体内参与免疫防御的两种重要的氧化酶。2、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）是广泛存在于需氧和耐氧生物体各组织中的两种重要的抗氧化酶。超氧化物歧化酶能 化超氧化物自由基发生歧化反应形成H2O2，过氧2化氢酶 化H2O2降解为H2O和O

.-。这两种酶能作为活性氧清除剂参与2

2

2清除体内自由基O

.-和H

O

，以消除中间产物对细胞的毒害，并能够增强吞噬细胞的防御能力和机体的免疫功能。三、免疫相关的基因越来越多的研究利用分子克隆（Molecular

cloning）、定量PCR（RealTime

PCR）、高通量测序、表达序列标签（EST，Expressed

Sequence

Tag）、转录组、表达谱、基因组（Genome）等分子生物学技术从基因水平研究与免疫相关的分子，为探明免疫机制提供了大量资料。sPGRP：肽聚糖识别蛋白LGBP：脂多糖葡聚糖结合蛋白Lectin：凝集素

Lysozyme：溶菌酶LBP/BPI:脂多糖结合蛋白、杀菌/通透性增加蛋白SOD：过氧化物歧化酶CAT：过氧化氢酶Fig.

2.

Whole-mount

immunofluorescence

of

PRRsin

C.

farreri

larvae.

Letter

from

A

to

E

represents

different

molecule:

Negative

control

(A),CfPGRP

(B),CfLGBP

(C),CfLec-1

(D),and

CfLec-3

(E).Number

from

1

to

4

represents

different

larvaestage:trochophore

（担轮幼虫）

(1),D-hingedlarvae

（D形幼虫）(2),early

veliger

larvae

（面

盘幼虫）(3),and

mid-veliger

larvae

(4).Theimmunoreactive

area

was

marked

with

arrow.dg:digestivegland（消化腺）;es:esophagus（食道）;h:hinge（铰合部）;m:mouth;pr:prototroch（口前纤毛轮）;st:stomach;u:umbo;ve:velum.A:anterior;P:posterior;D:dorsal;V:ventral.Fig.3.Whole-mountimmunofluorescence

of

someimmune

effectors

in

C.

farreri

larvae.Letter

from

A

to

Drepresentsdifferent

molecule:

CfLYZ

(A),CfLBP/BPI

(B),

CfSOD

(C),

and

CfCAT(D).

Number

from

1

to

4

representsdifferent

larvae

stage:

trochophore(1),

D-hinged

larvae

(2),

early

veligerlarvae

(3),

and

mid-veliger

larvae(4).The

immunoreactive

area

wasmarked

with

arrow.四、贝类的抗感染免疫个体发育以及水环境温度影响太平洋牡蛎的抗病毒防御反应OsHV-1：牡蛎疱疹病毒微变株(2013OIE新增)Poly

I:C

双链RNA类似物HSV-1

单纯疱疹病毒牡蛎依赖一系列的细胞水平的反应来使病毒的复制达到最小值牡蛎在识别病毒相关分子模式基础上诱导宿主细胞进入抗病毒状态，而不是产生广谱的抗病毒物质Conceptual

diagram

of

theinducible

antiviral

responseof

Crassotrea

gigas.

Wehypothesize

C.

gigasrecognises

dsRNA

usingevolutionarily

conserveddsRNA

recognitionreceptors

(TLR

&

MDA5).Upon

recognition,

thesereceptors

instigate

TLR-dependent

and

MDA5-dependent

signallingresulting

inthetranscription

factors,

Reland

IRF,

to

translocatetothe

cell

nucleus

resultinginthe

induction

of

cytokinesand

antimicrobial

peptides.Cytokines

are

secretedfrom

viral

infected

cells.Cytokines

signal

throughtheJak-STAT

pathwayresulting

in

the

inductionofinterferon

stimulated

genes(ISGs),

such

as

proteinkinase

R

(PKR)

and

viperin.Fig.

1.

A

2-DE

reference

map

of

the

total

proteins

of

hepatopancreas

of

C.

farreri.

The

spot

numberswere

underlined

when

no

hit

was

returned

when

searching

their

massspectrum

data

against

the

publicdatabase.

The

spot

numbers

are

corresponding

to

Table1.Fig.

2.

Gene

ontology

(GO)

analysis

on

41

reference

spots

of

the

hepatopancreas

of

C.

farreri

(the

2nd

level).Fig.

3.

2-DE

gel

images

of

the

total

proteins

ofhepatopancreas

of

C.

farreri

at

24

h

postinjectionof

V.

harveyi

(a)

or

not

(b).

The

spot

numberswere

underlined

when

no

hit

was

returnedwhensearching

their

mass-spectrum

data

against

thepublic

database.

The

spot

numbers

arecorresponding

to

Table

2.五、免疫调控乙酰胆碱调控栉孔扇贝的免疫反应第三节影响贝类免疫的主要因素一、环境因子对海洋双壳贝类免疫体统的影响

血细胞总数的变化双壳贝类的血细胞总数在受到外来污染的作用后会发生不同程度的变动，但由于动物个体本身存在着差异，同时季节性波动及其他诸多环境因素也会严重影响贝类血细胞的数量。

血细胞类型的变动双壳贝类的血细胞被分为不同的细胞亚群，各自有不同的功能，有一些具有较高的吞噬能力，释放较多的水解酶和活性氧自由基，杀灭外来病原。

对血细胞吞噬作用的影响双壳贝类在受到短期、低浓度污染时，其血细胞的吞噬指数会有所增加，但是在受到高浓度、长期污染的作用后吞噬指数则会下降。

对血细胞杀伤机制的影响重金属、杀虫剂或其他有机化合物在体外或体内对贝类血细胞的化学发光反应有着明显的作用。一般来说，大多数污染物在低浓度时有促进的作用，而在高浓度时有着明显的抑制作用。

对免疫识别及免疫因子的影响污染物对双壳贝类免疫因子的影响研究主要集中在凝集结合位点的变化和对酚氧化酶活性的影响。二、病原刺激对贝类免疫活性的影响

对吞噬作用的影响吞噬作用时所有动物共有的现象，通过吞噬作用中和或杀灭外来物质，包括一些无机颗粒、异源生物以及一些机体自身变异的成分。

对各种相关酶活性的影响由于软体动物缺乏免疫球蛋白，所以其体液免疫主要被依靠血清中的一些非特异性的酶或因子来进行。在受到外界刺激后，免疫活性因子被释放到血清中，是机体对抗入侵生物的一种体液防御机制。三、免疫增强剂对贝类免疫的影响免疫增强剂是指单独或同时与抗原使用均能增强机体免疫应答的物质。它通过提高动物的非特异性免疫功能以及特异性免疫功能来增强水产动物的抗疾病感染能力。第四节检测贝类免疫的主要方法一、贝类血细胞的分类和形态观察

贝类血淋巴细胞的常规染色法

贝类细胞计数和细胞大小的测量

透射电子显微镜观察血细胞结构

流式细胞仪分类贝类血细胞栉孔扇贝两类血细胞a)吉姆萨染色单层细胞吉姆萨染色血细胞涂片血细胞悬液台盼蓝染色密度梯度离心分离血细胞Bar=10μm

G：颗粒细胞；H：透明细胞密度梯度离心分离血细胞：三条带的位置分别在20%-30%，30-40%，40-50%

的Percoll

界面上。台盼蓝染色，显微镜观察，20-30%的Percoll中主要是透明细胞，30-40%的Percoll中有42%的透明细胞，58%的颗粒细胞，而40-50%的Percoll中大部分是颗粒细胞透射电镜观察栉孔扇贝血细胞透明