免疫学原理与技术（第2版）课件 第12章 免疫学检测技术

第12章免疫学技术12.1血清学检测技术12.2免疫电泳技术12.3免疫标记技术12.4免疫组织化学技术12.5免疫细胞的分析技术12.6其他免疫学技术本章主要内容12.1血清学检测技术血清学试验通常采集血清来进行体外的抗原/抗体检测与分析。血清学试验的一般特点是特异性与交叉性。影响血清学试验的因素有反应温度、酸碱度和离子浓度等，这些因素对抗原和抗体分子上各基团的解离性和电荷特性有重要的影响12.1.1免疫沉淀试验检测技术可溶性抗原与相应抗体在溶液或凝胶中接触可形成肉眼可见的抗原抗体复合物沉淀，此即免疫沉淀。免疫复合物的形成通常分两步进行：第一步是抗原与相应抗体的特异性结合；第二步是形成肉眼可见的免疫复合物晶格。利用抗原和抗体可发生沉淀反应这一特征，可用已知抗原（或抗体）检测未知抗体（或抗原）的存在及其含量。免疫沉淀试验示意图12.1.2免疫凝集试验检测技术凝集反应是指细菌、红细胞等颗粒性抗原或表面覆盖抗原的颗粒状物质（如红细胞、聚苯乙烯胶乳等）与相应抗体结合，在一定条件下形成肉眼可见的凝集团块现象。凝集反应中，适量电解质的加入则是为了破坏颗粒抗原的双电层，促使凝集现象的出现。12.1.3补体结合试验检测技术补体结合试验（Complementfixationtest，CFT）是应用可溶性抗原，如蛋白质、多糖、类脂、病毒等，与相应抗体结合后，其抗原-抗体复合物可以结合补体，但这一反应肉眼不能察觉，如再加入致敏红细胞（溶血系统或称指示系统），即可根据是否出现溶血反应，判定反应系统中是否存在相应的抗原和抗体。此试验有两个系统并分两阶段进行。一为检测系统（溶菌系统），即已知的抗原（或抗体），被检的抗体（或抗原）和补体；另一为指示系统（溶血系统），包括绵羊红细胞、溶血素和补体。12.1.4中和试验检测技术凡能与病毒结合，使其失去感染力的抗体称为中和抗体，能与细菌外毒素结合，中和其毒性作用的抗体称为抗毒素。病毒可刺激机体产生中和抗体，中和抗体与病毒结合后使病毒失去吸附细胞的能力，从未丧失感染力，病毒与其特异性的中和抗体相遇之后发生的作用，类似于化学中的相应酸碱中和反应，所以称这种作用为中和作用。12.2免疫电泳技术免疫电泳（immunoelectrophoresis）是指一定量可溶性的抗原物质与相应抗体借用琼脂糖为载体在一定电场强度下以合适的比例加速结合形成复合物，并以沉淀线（或峰）的形式表现出来，通过观察和分析沉淀线（或峰）的性质而对抗原抗体进行定性定量。12.2.1微量免疫电泳技术微量免疫电泳技术是在凝胶介质中将区带电泳法与免疫双扩散相结合的一种免疫化学方法。先使血清在琼脂糖中进行电泳，在一定电场强度下，由于血清中各种蛋白质的分子大小以及电荷状态和电荷量不同，泳动速率也各不相同，使各自组分得到分离，然后加入抗血清，则抗原与相应抗体相遇，出现沉淀弧线。12.2.2对流免疫电泳技术当抗原和抗体在琼脂介质中电泳时，由于抗体的pI比较高，在适当的pH值下抗体带正电而抗原带负电，故在电场中抗体向阴极方向移动而抗原向阳极方向移动，直至相遇后出现沉淀线。12.2.3火箭免疫电泳技术抗原在含有抗体的琼脂糖凝胶中电泳时，在电场的作用下，抗原向一个方向移动并逐步与凝胶中的相应抗体结合形成沉淀，含量逐渐减少，最终全部沉淀而在适当的位置形成形状如火箭的峰，故有火箭免疫电泳之称。沉淀峰的高度与抗原浓度呈正比，与抗体浓度呈反比，因此可用于抗原的定量测定。12.2.4交叉免疫电泳技术交叉免疫电泳分两步进行，第一步是将抗原在适宜pH（一般为pH8.6）的琼脂糖中进行第1向电泳，将其中各成分进行分离，第二步是通过在与第1向电泳垂直的方向上进行第2向电泳，使抗原抗体相遇时，会出现一个弧形的沉淀峰。第2向电泳形成的每一个沉淀峰表示一种抗原成分，峰的面积与抗原量呈正比，而与琼脂中抗体的含量呈反比。交叉免疫电泳示意图12.2.5亲和免疫电泳技术外源凝集素（lectin）具有和糖蛋白结合的特性，故可用作亲和层析糖蛋白的配体，在交叉免疫电泳的第1向电泳中加入游离的外源凝集素，则样品中的糖蛋白由于和外源凝集素结合而迁移率降低，由此识别与外源凝集素结合的蛋白，确定结合的蛋白质的性质及其异质性，推测外源凝集素和糖蛋白的亲和力大小，预测制备分离的结果。12.2.6免疫印迹技术Western印迹法是将蛋白质借高分辨率的PAGE电泳有效分离成许多蛋白区带，分离后的蛋白带经电转移至一种固相支持体如硝酸纤维膜（NC膜）上，然后以抗体为探针，与附着于固相支持体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应，结合于固相支持体的抗体可用多种2级免疫学试剂检测。12.3免疫标记技术免疫标记技术是将已知抗体或抗原标记上易显示的物质，通过检测标记物来反应抗原抗体反应的情况，从而间接地测出被检抗原或抗体的存在与否或量的多少。常用的标记物有荧光素、放射性同位素、酶、铁蛋白、胶体金及化学（或生物）发光剂等。12.3.1免疫酶标记技术免疫酶标记技术是结合了抗原抗体反应的特异性和酶高效催化反应的专一性，利用酶催化底物反应的生物放大作用，提高特异性抗原－抗体免疫学反应检测敏感性的一种标记免疫技术。它以酶作为标记物，与抗体或抗原联结，与相应的抗原或抗体作用后，通过底物的颜色反应作抗原抗体的定性和定量，亦可用于组织中抗原或抗体的定位研究，即酶免疫组织化学技术12.3.2免疫荧光标记免疫荧光标记是应用一对单克隆抗体的夹心法。首先将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体。除去未结合抗体，然后加受检标本，使其中的蛋白抗原与固相抗体形成抗原抗体复合物。洗涤除去未结合物，接着加入荧光标记的抗体，使之与抗原特异性结合，形成抗体—抗原—抗体复合物。最后根据荧光强度，即可对蛋白抗原进行定量。12.3.3生物素-亲和素标记技术生物素—亲和素系统（Biotinavidinsystem，BAS）利用了一个Ig分子可偶联90个生物素分子，一个亲和素分子可结合4个生物素分子的特性，使传统的灵敏度较高的酶免法的灵敏度又有明显的放大作用。12.3.4免疫金标记技术免疫胶体金标记技术主要利用了金颗粒具有高电子密度的特性，在金标蛋白结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒，当这些标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫检测方法中，这一反应也可以通过银颗粒的沉积被放大，称之为免疫金银染色。12.3.5放射免疫标记技术放射免疫标记技术（Radioimmunoassay，RIA）是以过量的未标记抗原与放射性物质标记的抗原，竞争性地与抗体结合，形成有放射性的抗原—抗体复合物与无放射性的抗原—抗体复合物，并有过剩的标记抗原与未标记的抗原。然后通过离心沉淀等方法，将抗原—抗体复合物与游离抗原分离，分别测定其放射性强度与标准曲线比较，即可对未标记的待测抗原进行定量。12.4免疫组织化学技术免疫组织化学技术(immunohistochemistrytechnique)，也称免疫细胞化学技术（immunecytochemistry），是利用标记物标记的抗体与组织或细胞的抗原反应，结合形态学检查，对抗原做定性、定量、定位检测的技术。免疫组织化学染色效果图该技术的研究方法主要是组织或细胞免疫染色法，使用该方法检测组织或细胞内物质，必须具备两个条件：①待检测物质具有抗原性，能制作出特异性与高效价的抗体。在组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质（如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等）都可用特异性抗体进行检测。②待检测物质在免疫反应发生之前要保持抗原性和稳定状态。12.4.1免疫荧光组织化学技术免疫荧光组织化学是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。图12.4-1紫外光激发荧光物质放射荧光示意图免疫荧光组织化学染色方法用荧光抗体示踪或检测组织细胞内相应抗原的方法称为荧光抗体法。按标记方法可分为直接法、间接法和补体法。直接法图12.4-2直接免疫荧光法原理示意图间接法

图12.4-3间接免疫荧光法原理示意图间接免疫荧光法效果图补体法

图12.4-4补体结合免疫荧光法原理示意图12.4.2免疫酶组织化学技术免疫酶组织化学技术的方法常用的有酶桥法、PAP法和APAAP法。（1）酶桥法酶桥法使用的三种抗体中的第一抗体和第三抗体为同种动物所产生。如果第一抗体为兔抗人IgG，则第二抗体为羊抗兔IgG，第三抗体为兔抗过氧化酶。（2）PAP法PAP法是酶桥法的改进，是将酶和抗酶抗体在使用前先制成稳定的酶-抗酶抗体复合物（PAP复合物），稀释后使用，从而解决了酶与抗酶抗体的比例难以确定的问题图12.4-5免疫酶组织化学染色示意图：A.酶桥法；B.PAP法（3）APAAP法碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶法（Alkalinephosphataseantialkalinephosphatase，APAAP）是在PAP法的基础上，用碱性磷酸酶（Alkalinephosphatase，AKP）替代HRP而建立的一种方法。（4）多聚螯合物酶法12.4.3亲和免疫组织化学技术（1）亲和素-生物素标记系统亲和素-生物素标记系统用于免疫组织化学染色的方法主要有三类：①亲和素-生物素-过氧化物酶复合物技术（Avidinbiotin-peroxidasecomplextechnique，ABC）；图12.2-6生物素-亲和素免疫组织化学示意图：A.标记亲和素-生物素法（LAB法）；B.桥联亲和素-生物素法（BRAB法）；C.亲和素-生物素-过氧化物酶复合物法（ABC法）②酶标亲和素-生物素技术（Labeledavidin-biotintechnique，BA或LAB）③桥联亲和素-生物素技术（Bridgedavidin-biotintechnique，BAB或BRAB）（2）葡萄球菌A蛋白与IgG葡萄球菌A蛋白（staphylocoalproteinA，SPA）是金黄色葡萄球菌细胞壁的一种蛋白成份，含有4个高度相似的Fc片断结合区，能与人和多种哺乳动物IgG的Fc片断非特异结合，这种结合是双价的，即1个分子SPA能与2个IgG分子结合。因此，可以将SPA与荧光素或酶等结合后作为第二抗体使用。（3）CSA法催化放大系统（catalyzedsignalamplification，CSA法）是在链亲和素-生物素法的基础上发展而来，其原理是增加了生物素化的酪胺基团分子，通过HRP的催化作用，使酪胺基团分子与抗原抗体结合部位形成一个共价结合位点，导致大量的生物素沉积在信号位点上，再一次滴加链亲和素-HRP复合物时，可使原始信号得到几何级数放大。图12.4-7Envision法和CSA法原理示意图：A.Envision法；B.CSA法12.4.4免疫金银组织化学技术（1）免疫金银染色法图12.4-8免疫金银染色原理示意图12.4.5双重或多重免疫组织化学技术图12.2-9同种动物抗体间接法（分步固定）双重免疫荧光染色原理间接法（分步固定）双重免疫荧光染色效果图12.5.1免疫细胞的分离、纯化和鉴定（1）外周血免疫细胞的分离纯化和鉴定①外周血白细胞的分离和纯化②外周血单个核细胞的分离③淋巴细胞的分离④T淋巴细胞和B淋巴细胞的分离12.5免疫细胞的分析技术（1）外周血免疫细胞的分离纯化和鉴定⑤T细胞亚群的分离⑥NK细胞分离⑦单核细胞分离⑧人外周血中性粒细胞制备⑨树突状细胞（DC）分离（2）分离细胞的保存红细胞的保存淋巴细胞的保存12.5.2免疫细胞功能测定（1）淋巴细胞功能测定-①T淋巴细胞功能体外测定E花结试验活性E(Ea)花结试验稳定性E花结试验（1）淋巴细胞功能测定②B细胞膜表面Ig（SmIg）测定免疫微球法检查SmIg免疫荧光法测定SmIg③淋巴细胞亚群检测T细胞亚群检测B细胞亚群的检测④T淋巴细胞功能的体内试验法⑤淋巴细胞功能实验室检测法淋巴细胞转化试验淋巴细胞毒试验⑥TH、TS功能的测定⑦B细胞产生免疫球蛋白能力的检测⑧K细胞功能检测法⑨NK细胞功能测定⑩淋巴因子的检测（2）吞噬细胞功能测定（3）红细胞免疫功能检测C3b受体花结试验血清对红细胞粘附调节作用的测定12.5.3免疫复合物的检测方法（1）抗原非特异性检测法聚乙二醇沉淀法补体技术胶固素结合试验C1q结合试验抗球蛋白技术（2）抗原特异性检测法12.6.1免疫沉淀技术免疫沉淀(Immunoprecipitation，IP)是利用抗原与抗体特异性反应纯化富集目的蛋白的一种方法。预固定抗体法游离抗体法免疫沉淀技术中常用是预固定抗体的方法，但如果目的蛋白浓度低、抗体对抗原的亲和力或结合力弱时，采用游离抗体的方法更有利于形成免疫复合物。12.6其他免疫学技术

利用预固定或游离抗体免疫沉淀抗原示意图12.6.2免疫共沉淀技术免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)：免疫共沉淀是在免疫沉淀技术的基础上衍生出来的用于研究蛋白质相互作用的一种实验方法。

免疫共沉淀原理示意图12.6.3染色质免疫沉淀技术染色质免疫沉淀（Chromatinimmunoprecipitation,ChIP）：是分析细胞内生理状态下DNA结合蛋白与基因组DNA相互作用的技术，它能真实、完整地反映结合在DNA序列上的调控蛋白，是目前研究体内蛋白质与DNA相互作用的重要工具。染色质免疫沉淀原理示意图

12.6.4RNA免疫沉淀RNA免疫沉淀（RNAimmunoprecipitation,RIP）：其原理与ChIP类似，但RNA免疫沉淀是用来研究细胞内与蛋白质结合的RNA在基因表达调控中的作用。RIP是研究细胞内RNA与蛋白结合情况的技术