微生物代谢控制发酵

微生物代谢控制发酵王腾飞wangtengfei1981@163.co五章代谢控制发酵的应用第一节糖代谢与控制糖代谢的途径；糖代谢的调节机制第二节柠檬酸发酵机制与代谢调控柠檬酸的生物合成途径；柠檬酸生物合成中的代谢调节与控制；柠檬酸发酵的产率；柠檬酸产生菌的育种第三节脂类代谢与控制脂类代谢与调节；谷氨酸的生物合成途径；谷氨酸代谢调节机制；谷氨酸生产菌的育种思路第五章代谢控制发酵的应用第四节氨基酸代谢控制与发酵赖氨酸的生物合成途径；赖氨酸代谢调节机制；赖氨酸生产菌的育种思路第五节核苷酸类物质的代谢控制与发酵核苷酸生物合成的调节机制；肌苷发酵的代谢控制育种第六节抗生素发酵的代谢与控制抗生素的基本合成途径、关键酶、调控措施。淀粉——葡萄糖第一节糖代谢与控制α-淀粉酶及β-淀粉酶水解支链淀粉的示意图α-淀粉酶

-淀粉酶

淀粉降解1.到分枝前4个G时，淀粉磷酸化酶停止降解2.由转移酶切下前3个G，转移到另一个链上3.脱支酶水解α-1，6糖苷键形成直链淀粉。脱下的Z是一个游离葡萄糖4.最后由磷酸化酶降解形成G-1-PG—1—P脱支酶磷酸化酶海藻糖乳糖蔗糖半乳糖甘露糖单磷酸己糖途径（HMP）磷酸戊糖循环（PP环）糖酵解途径（EMP）双磷酸己糖途径（HDP）三羧酸循环（TCA）柠檬酸循环克雷布斯循环乙醛酸循环ED途径2-酮-3脱氧-6-磷酸葡萄糖酸裂解途径CO2固定作用伍德-沃克曼反应丙酮酸葡萄糖“糖酵解”不需氧“磷酸戊糖途径”需氧有氧情况缺氧情况好氧生物厌氧生物“三羧酸循环”“乙醛酸循环”CO2+H2O“乳酸发酵”乳酸“乳酸发酵”、“乙醇发酵”乳酸或乙醇CO2+H2O各种代谢途径的利用比例多种代谢途径可以同时存在于一个细胞内，不同代谢途径在细胞中存在的比例因微生物不同而异只有少数细菌以HMP途径作为有氧分解的唯一途径，如醋酸杆菌等；而有些微生物中只有EMP或ED途径P3PPOOHOHCH2CH2OO12546P磷酸二羟丙酮123+P②异构6-磷酸果糖P564磷酸甘油醛PP1，3-二磷酸甘油酸PCOHCOHH2COOH3-磷酸甘油酸P2-磷酸甘油酸P磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸6-磷酸葡萄糖PG葡萄糖①活化④裂解⑥脱氢⑤异构PP1，6-二磷酸果糖③活化⑦产能⑨脱水⑧异构⑩产能HHOHE1:己糖激酶E2:6-磷酸果糖激酶E3:丙酮酸激酶NAD+乳酸糖酵解的代谢途径GluG-6-PF-6-PF-1,6-2PATPADPATPADP1,3-二磷酸甘油酸3-磷酸甘油酸2-磷酸甘油酸丙酮酸磷酸二羟丙酮3-磷酸甘油醛NAD+NADH+H+ADPATPADPATP磷酸烯醇式丙酮酸E2E1E3NADH+H+TCA三羧酸循环（Tricarboxylicacidcycle；TCAcycle）又柠檬酸循环（CitricAcidCycle），是需氧生物体内普遍存在的代谢途径，因为在这个循环中几个主要的中间代谢物是含有三个羧基的柠檬酸，因此得名；或者以发现者汉斯·阿道夫·克雷伯命名为克雷伯氏循环，简称克氏循环（Krebscycle）。三羧酸循环是三大营养素（糖类、脂类、氨基酸）的最终代谢通路，又是糖类、脂类、氨基酸代谢联系的枢纽。分子酶反应类型反应物/

辅酶产物/

辅酶I.柠檬酸1.乌头酸酶脱水H2OII.顺-乌头酸2.乌头酸酶复水合H2OIII.异柠檬酸3.异柠檬酸脱氢酶氧化NAD+NADH+H+IV.草酰琥珀酸4.异柠檬酸脱氢酶脱羧V.α-酮戊二酸5.α-酮戊二酸脱氢酶复合体氧化脱羧NAD+

CoA-SHNADH+H+

CO2VI.琥珀酰辅酶A6.琥珀酰辅酶A合成酶底物水平磷酸化GDP

PiGTP

CoA-SHVII.琥珀酸7.琥珀酸脱氢酶氧化FAD+FADH2VIII.延胡索酸8.延胡索酸酶水合IX.L-苹果酸9.苹果酸脱氢酶氧化NAD+NADH+H+X.草酰乙酸10.柠檬酸合成酶加成XI.乙酰辅酶AATP+0.5ADP

能荷(Energycharge)ATP+ADP+AMP=需能ATP分解能荷降低激活催化糖类分解的酶解除ATP对酶的抑制加速糖酵解、TCA循环多产生能量多能ATP增加能荷升高激活糖元合成的酶抑制糖分解途径关键酶减慢糖酵解、TCA循环少产生能量糖代谢的能荷调节糖代谢的生物素调节（2）生物素的调节生物素是羧化酶的辅酶，它本身就是一种B族维生素B7。

生物素，又称为VH或VB7。是附有一个噻吩环的尿素衍生物。生物素主要是影响糖代谢的速度生物素充足时，糖分解速度提高，造成乳酸积累生物素缺乏时，丙酮酸氧化能力下降，乙醛酸途径基本是封闭的生物素充足时：

苹果酸、草酰乙酸脱羧反应活跃，琥珀酸氧化能力增强，倾向于完全氧化，ATP增加，蛋白质合成加剧，谷氨酸剧减。生物素缺乏时：

苹果酸、草酰乙酸脱羧反应停滞，琥珀酸氧化能力弱，异柠檬裂解酶很少，乙醛酸循环微弱，完全氧化能力降低，ATP减少，蛋白质合成降低，大量积累谷氨酸。第二节柠檬酸发酵机制与代谢调控柠檬酸

citricacid

取代羧酸——羟基酸——醇酸乳酸苹果酸酒石酸

柠檬酸（枸椽酸）

-羟基丙酸2-羟基丙酸

321羟基丁二酸2,3-

二羟基丁二酸2-羟基-1,2,3-丙烷三羧酸*****

柠檬酸又名枸橼酸。存在于柠檬、菠萝、葡萄等水果中，此外，天麻、覆盆子、五味子等中药中也有存在。

柠檬酸为无色晶体，常一分子结晶水。易溶于水和乙醇。具有多元羧酸的性质，易与金属离子形成络合物。

柠檬酸与酒石酸、苹果酸一样，广泛用作食品的酸味剂。在食品和医学上用作多价螯合剂，也是化学中间体，临床上，用柠檬酸作矫味剂。许多柠檬酸盐具有特定的生理活性，如：枸橼酸铁铵（抗贫血药），枸橼酸铋钾（抗溃疡药）等。柠檬也可用于与碱性药物成盐，成为溶于水的制剂，如枸橼酸哌嗪（抗蠕虫药）。1、柠檬酸的发酵机制2C6H12O6+3O22C6H8O7+4H2O理论产率：106.6%116.6%2、柠檬酸的代谢控制能够生产柠檬酸的微生物很多工业上以淀粉糖为原料直接发酵生产柠檬酸的主要是曲霉属（Aspergillus）菌株黑曲霉（Aspergillusniger）诱变育种（breedingbyinducedmutation）指通过人工方法处理均匀而分散的微生物细胞群，在促进其突变率显著提高的基础上，采用简便、快速和高效的筛选方法，从中挑选出少数符合目的突变株的过程。在此过程中，诱变和筛选是两个主要环节。

诱发突变（inducedmutation）物理因素紫外线（ultravioletlight）X射线和γ射线化学因素碱基结构类似物与核酸上碱基起化学反应的诱变剂移码诱变剂投产率多数不宜投产少数适宜投产多数幅度小少数幅度大高产率大多死亡少数存活存活率多数未变少数突变突变率多数负变少数正变正变率诱变育种的基本环节出发菌株计算出诱变

诱变育种的基本原则选择简便有效的诱变剂挑选优良的出发菌株处理单细胞或单孢子悬液选用最适的诱变剂量充分利用复合处理的协同效应利用和创造形态、生理与产量间的相关指标设计高效筛选方案创造新型筛选方法柠檬酸发酵优良突变株的筛选1、形态学观察法

黑曲霉的形态突变与柠檬酸产量之间有一定的关系，通过选育形态突变株，有助于柠檬酸高产菌株的获得。

例如，选育在葡萄糖培养基上孢子不生长、迟长或者少长的突变株。？柠檬酸发酵优良突变株的筛选2、透明圈法甘薯粉10%琼脂2%碳酸钙0.5%？柠檬酸发酵优良突变株的筛选3、显色圈法麦芽汁培养基pH指示剂（溴酚蓝0.01%）？柠檬酸发酵优良突变株的筛选4、高渗透压法

高产柠檬酸的菌株必须在高糖和高柠檬酸浓度的培养基上能够生长，即具备耐受高糖和高柠檬酸的能力。甘薯粉〉15%………..

柠檬酸〉20%………..柠檬酸发酵优良突变株的筛选5、选育不分解柠檬酸的突变株

用以柠檬酸为唯一碳源的培养基，选择菌体不生长或生长微弱的突变株。柠檬酸发酵优良突变株的筛选6、选育某些氨基酸缺陷的突变株如：谷氨酸缺陷型、精氨酸缺陷型等7、选育抗药性突变株如：寡霉素抗性、萘啶酮酸抗性等8、选育强化CO2固定反应的突变株如：将磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因克隆到高拷贝载体上，使之扩增第三节脂类代谢与控制脂类物质脂肪磷脂固醇蜡脂类的代谢与调节多不饱和脂肪酸含两个或两个以上双键且碳原子数为16-22的直链脂肪酸。如γ－亚麻酸，花生四烯酸，二十二碳六烯酸等。多不饱和脂肪酸可广泛用于医药、食品、化装品、饲料等领域。γ-亚麻酸是人体不能缺少、自身又不能合成或替代的必需脂肪酸。人体一旦缺乏，首先至关重要的前列腺素PGE1、PGE2、PGE3、就不能合成，免疫、心脑血管生殖内分泌等系统就会出现异常，发生紊乱，从而引起高血脂、高血压、血栓症、动脉粥样硬化、风湿病、糖尿病、皮肤粗糙、加速衰老化等一系列疾病。特别是对脑组织的生长发育相当重要，因为脑重量的20%是由必需脂肪酸组成的。产生菌：

多用被孢霉、毛霉、红教母、小克银汉霉γ-亚麻酸GammalinolenicAcid

（十八碳三烯酸，维生素F，OctadecatrienoicAcid，GLA）育种措施1：

切断或减弱支路代谢育种措施2：

解除反馈调节耐高浓度γ-亚麻酸突变株γ-亚麻酸结构类似物抗性突变株如LTBr育种措施3：

增加前体物质的合成育种措施4：

选育△6－脱氢酶活力强的突变株TTC酶活测定法TTC是一种无色的氧化还原剂，能被△6－脱氢酶还原成红色的物质，红色越深，酶活越强。育种措施5：强化能量代谢提高菌体细胞内ATP的水平，有利于脂肪酸的合成。选育呼吸抑制剂抗性突变株（如抗丙二酸、氰化钾、亚砷酸）选育ADP磷酸化抑制剂抗性突变株（如抗羟胺2，4－二硝基酚）选育ADP磷酸化抑制剂抗性突变株（如抗羟胺2，4－二硝基酚）选育抑制能量代谢的抗生素抗性突变株（如抗寡霉素、缬氨霉素）育种措施6：选育低温生长突变株

细胞膜由脂质和蛋白质组成，脂质分子中不饱和脂肪酸的含量越高，细胞膜的流动性越大，适宜在低温下生长。育种措施7：选育耐高糖的突变株谷氨酸的生物合成机制与代谢调节

谷氨酸发酵作为重点：（1）是代谢控制发酵的重点

（2）是目前代谢控制发酵中，在理论与实践上最成熟的一、谷氨酸的生物合成途径主要有：Glucose的酵解，EMP

Glucose的有氧氧化，HMP

丙酮酸的有氧氧化，TCA循环

乙醛酸循环途径，DCA循环

CO2固定反应

α-KGA（α-酮戊二酸）的还原氨基化这6条途径之间是相互联系和相互制约的。二、谷氨酸代谢调节机制谷氨酸发酵是控制磷脂合成代谢的典型例子。正常情况下，谷氨酸产生菌的细胞膜不允许谷氨酸从细胞内渗透到细胞外。在谷氨酸发酵过程中，一般是通过控制生物素亚适量、添加吐温60或青霉素等手段来调节细胞膜的渗透性，使细胞允许谷氨酸从细胞内渗透到细胞外。（1）优先合成谷氨酸比天冬氨酸优先合成，谷氨酸合成过量后，抑制和阻遏自身的合成途径，使代谢流转向天冬氨酸。（2）谷氨酸脱氢酶（GD）的调节谷氨酸对谷氨酸脱氢酶存在着反馈抑制和反馈阻遏。（3）柠檬酸合成酶的调节柠檬酸合成酶受能荷调节、谷氨酸的反馈抑制和顺乌头酸的反馈抑制。（4）异柠檬酸脱氢酶的调节细胞内α-酮戊二酸的量与异柠檬酸的量需维持平衡。当α-酮戊二酸过量时，对异柠檬酸脱氢酶发生反馈抑制作用，停止合成α-酮戊二酸。（5）α-酮戊二酸脱氢酶在谷氨酸生产菌中先天性丧失或微弱。（6）磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶受天冬氨酸的反馈抑制，受谷氨酸和天冬氨酸的反馈阻遏。（7）谷氨酸的合成还与糖代谢、氮代谢的调节有关。三、谷氨酸生产菌的育种思路

第四节氨基酸合成的代谢调节本节以赖氨酸为例，说明氨基酸合成的调节方法谷氨酸棒杆菌Lys合成途径葡萄糖

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协同反馈抑制天冬氨酸